UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS
FERNANDA ARAGÃO FELIX
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE REPARO DO DNA EM TUMORES MALIGNOS DE GLÂNDULA SALIVAR
NATAL/RN 2020
FERNANDA ARAGÃO FELIX
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE REPARO DO DNA EM TUMORES MALIGNOS DE GLÂNDULA SALIVAR
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas - área de concentração em Patologia Oral e Estomatologia, como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza
Coorientadora: Profa. Dra. Lélia Batista de Souza
NATAL/RN 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - Departamento de Odontologia
Felix, Fernanda Aragão.
Análise da imunoexpressão de proteínas de reparo do DNA em tumores malignos de glândula salivar / Fernanda Aragão Felix. - Natal, 2020. 120 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza. Coorientadora: Profa. Dr. Lélia Batista de Souza.
Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas, Natal, 2020.
1. Neoplasias das glândulas salivares - Dissertação. 2. Reparo do DNA - Dissertação. 3. DNA Liase (Sítios apurínicos ou apirimidínicos) -
Dissertação. 4. Proteína 1 complementadora cruzada de reparo de Raio-X - Dissertação. 5. Xeroderma pigmentoso - Dissertação. 6. Imuno-histoquímica - Dissertação. I. Barboza, Carlos Augusto Galvão. II. Título.
RN/UF/BSO BLACK D65
A defesa deste trabalho foi realizada no dia 18 de fevereiro de 2020, em Natal/RN, tendo sido “aprovado”.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Jamile Marinho Bezerra de Oliveira Moura Universidade Estadual do Rio Grande do Norte
1º Examinador
Profa. Dra. Lélia Batista de Souza Universidade Federal do Rio Grande do Norte
2º Examinador
Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Aos meus pais, José e Lenira, e aos meus irmãos, Fernando e José, pelos quais nutro o mais profundo e verdadeiro amor.
AGRADECIMENTOS1
Decidi agradecer utilizando como metáfora o meu fascínio pelo que é circular, redondo, geométrico. Parte da história do universo gira em torno de um sistema que se diz redondo. Os infinitos multiuniversos (até onde sabemos) se organizam concentricamente. A origem da vida a partir de um óvulo fecundado, redondo. Para mim, o círculo tem algo de simbólico, inditoso, universal e contingente. Apesar do fascínio pelo círculo, algum aspecto destoou nessa trajetória e me mostrou como nem sempre uma conquista se delineia perfeitamente, dependendo das circunstâncias e da história.
Eu sou um sujeito histórico e, como tal, tive a vida atravessada por pessoas e por situações de ordem social que se refletem o meu “eu” de agora. Assim, costume dizer que eu sou muitos. Para sintetizar, eu agradecerei diretamente as pessoas que me acompanharam com mais afinco durante a minha trajetória de vida até aqui.
Aos meus familiares, aos meus pais, José e Lenira, e irmãos, Fernando e José, por todo amor, incentivo e compreensão. Aos meus avós maternos, Arnaldo e Marinalva, e paternos, Manoel (in memoriam) e Margarida (in memoriam), uma segunda-mãe, que me deixou durante este projeto. Vocês são exemplos de simplicidade, dedicação e amor incondicional ao mundo. As minhas tias (os), primas (os), em especial a Douglas, pela convivência estrita, conversas e aprendizado mútuo, madrinhas, afilhados e à família Santana, um grande laço que tenho em Nossa Senhora da Glória.
Aos meus antigos professores, em especial ao professor Bruno Martins Machado, pela oportunidade de aprender e de vivenciar de maneira mais aprofundada todo amor que sinto pelas humanidades. Você, sem dúvida, me ajudou a enxergar mais e melhor. A querida professora Ignez Aurora dos Anjos Hora, cuja força transpassa todos a sua volta, por todo incentivo e confiança.
Aos meus grandes amigos, Anne Tairine, Daianne, Evânio, Francielle, Laeza,
Larisse, Letícia, Mychelle, Rayle, Raquel, Sandi, Sílvia e Vanessa, cujas existências e
trajetórias me permite sonhar com um mundo múltiplo, com mais comunhão, justiça e conhecimento.
Curiosamente, o fato de cursar o mestrado não foi a única circunstância da minha felicidade. Recordo o corredor que dá acesso a Patologia Oral da UFRN como uma espécie de corredor elemental: tudo ali me lembrava da modéstia do meu conhecimento sobre 1Ou melhor: Urdidura eterna.
Patologia Oral e ninguém nesse lugar foi indiferente a minha vontade de aprender. Ali eu percebi como, parafraseando J.L. Borges2, podemos ser cegos, surdos, tolos e desmemoriados.
Evidentemente, muitas figuras pujantes contribuíram com a construção e a sedimentação do meu conhecimento. O meu orientador, Dr. Carlos Augusto Galvão
Barboza, um homem de conhecimento vasto, gentil e compreensivo. A professora Dra. Lélia Batista de Souza, a grande, a maior pesquisadora que já conheci, cuja trajetória nos enche
de orgulho. A senhora, professora, me permite acreditar que quase tudo é possível quanto se tem dedicação, coragem e força para persistir. A professora Dra. Márcia Cristina da Costa
Miguel, que é uma espécie de obra arquitetada pela Patologia Oral da UFRN para nos
lembrar da nossa imensa e permanente ignorância. A senhora deveria ser objeto de estudo, uma forma de investigar como é possível uma só pessoa saber tanto. A professora Dra.
Roseana de Almeida Freitas, uma pessoa dedicada e sensata, um verdadeiro exemplo de
patologista oral e a quem eu agradeço a disponibilidade e ajuda. Da mesma forma, aos demais professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas, da área de concentração em Patologia Oral e Estomatologia: Dr. Leão Pereira Pinto, Dra. Lélia Maria
Guedez Queiroz, Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Dra. Ana Miryam Costa de Medeiros, Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira, Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira e Dr. Pedro Paulo de Andrade Santos, por todo conhecimento
compartilhado. Eu agradeço imensamente por tudo.
Recordo claramente que o projeto não envolvia tantos agregados, cuja aparição repentina acalentou os meus dias. Agradeço aos colegas de turma, Ana Carolina, Carla,
Carol, Cíntia, Clarice, Gustavo, Hélder, Joaquim, Katianne, Maurília e Nathália, por todo
conhecimento compartilhado, companheirismo, alegrias e dores vividas. Cada um de vocês, a seu modo, me permitiu construir a ideia de que compartilhando se aprende muito mais.
Aos demais alunos do programa de pós-graduação: Amanda, André, Ana Cláudia,
Caio, Cristiane, Dáurea, Dennis, Everton, Glória, Hannah, Hugo, Janaína, Joyce, Juliana, Larissa, Leonardo, Leorik, Lourival, Lucas, Luiz Arthur, Mara, Mariana, Nara, Nelmara, Ondina, Rani, Rodrigo e Weslay, pela convivência, intercambio de conhecimento e ajuda na
prática da Patologia Oral. Como sempre, eu convivi mais ativamente com alguns deles e quero agradecê-los de maneira particular. Inicialmente, à Ana Cláudia, um exemplo de ser
humano, inteligente, prestativa e a quem eu devoto grande respeito. A Everton, uma pessoa inteligente, dedicada e a quem agradeço a ajuda incondicional. À Janaína, uma pessoa grande, calma, gentil e prestativa. E, finalmente, ao mais querido, Leorik, para quem, além de toda admiração, eu nutro os mais sinceros sentimentos. Você, gênio, se tornou aquilo que eu poderia facilmente caracterizar como amigo. A minha estima por você ultrapassa o dizível. Só nós sabemos o quanto você foi indispensável em cada etapa deste trabalho. Obrigada, de coração, por tudo.
À Maria Luíza (vulgo: Malu), cujo conhecimento, dedicação e paciência infinitos, me permitiu criar uma admiração descomunal. Obrigada por toda ajuda, em especial aquela direcionada à estatística deste trabalho.
Aos funcionários e técnicos da disciplina de Patologia Oral da UFRN, a querida
Graça Galvão (Gracinha), que me acolheu de maneira tão verdadeira na Patologia Oral. A
sua dedicação, presteza e cuidado a torna um exemplo a ser seguido. Ao biólogo Hévio
Lucena, pela competência e solicitude que transmite em tudo que faz. À Sandra Oliveira (Sandrinha), Ricardo e Betsaida (Betty), pela disponibilidade, eficiência, educação,
cordialidade e ajuda. À Maria de Lourdes (Lourdinha), Idelzuíte e Amanda, pela gentiliza e atenção. Agradeço por toda dedicação à Patologia Oral da UFRN.
As meninas do Vila Romana II, em especial Vitória e Eunice, pelas conversas, desconstruções e respeito mútuo. Vocês deixaram a minha estadia em Natal mais leve, sociável e catártica.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, um exemplo de universidade pública, gratuita e compromissada com o desenvolvimento humano e científico, e ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio
financeiro durante o mestrado.
Em síntese, queria ser capaz de reconstruir todas as anedotas vividas, mas creio que isso seria exaustivo e desnecessário. Sem modéstia, devo dizer que vivo como quem sonha. Em tudo que construí, na complexidade das situações vividas, se desenhava o inextrincável de ser pesquisadora - um sonho há tempos alimentado pela minha crença na ciência (o mais próximo que eu tive de uma experiência religiosa).
“(...)To those who can hear me, I say - do not despair. The misery that is now upon us is but the passing of greed - the bitterness of men who fear the way of human progress. The hate of men will pass, and dictators die, and the power they took from the people will return to the
people. And so long as men die, liberty will never perish” In The Great Dictator (1940), de Charlie Chaplin
RESUMO
Os tumores malignos de glândula salivar (TMGS) são lesões raras, heterogêneas e de prognóstico variável. As células dos mamíferos estão sujeitas a milhares de modificações espontâneas na molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA). A proteína endonuclease apúrica ou apirimídica 1 (APE1) e a proteína 1 de complementação cruzada de reparo de raios-x (XRCC1) são dois componentes importante da via de reparo por excisão de base (BER), e a proteína fator de complementação F do xeroderma pigmentoso (XPF), da via de reparo por excisão nucleotídeo (NER). Este estudo analisou a expressão imuno-histoquímica das proteínas APE1 e XRCC1 da via BER, e XPF da via NER, em amostra de tumores primários de carcinoma de células acinares (CCA), adenocarcinoma polimorfo (AcP), carcinoma adenoide cístico (CAC) e carcinoma mucoepidermoide (CME). Um total de 62 TMGS foram incluídos e submetidos à imuno-histoquímica contra os anticorpos selecionados, correspondendo a 14 CCA, 15 AcP, 16 CAC e 17 CME. As células do parênquima tumoral foram avaliadas quantitativamente, a partir de fotomicrografias de 5 campos (em aumento de 400x), por um único avaliador. Foram consideradas células imunorreativas aquelas com coloração acastanhada no núcleo e/ou núcleo/citoplasma, independente da intensidade. As células imunomarcadas e negativas foram contadas nos 5 campos, estabelecendo o porcentual de células positivas em relação ao número total de células contadas. Ademais, estabeleceu-se a razão núcleo ou núcleo/citoplasma, inferindo se a localização era predominantemente uni ou bicompartimental. Os testes estatísticos incluíram o exato de Fisher, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, correlação de Spearman e log-rank para comparação das curvas de sobrevida global construídas pelo método Kaplan-Meier. O nível de significância foi estabelecido em 5%. Todos os TMGS selecionados marcaram para APE1, XRCC1 e XPF. Não houve diferença entre a expressão de APE1 e XPF entre os tumores estudados. Para XRCC1, contudo, observou-se diferença significativa entre AcP e CME (p=0.032). A marcação nuclear de APE1 foi estatisticamente maior nos TMGS selecionados (p<0.0001). Houve relação estatística de APE1 com tumores T1-T2 no CAC (p=0.006), bem como de aumento de XPF em pacientes com CME acima de 60 anos (p=0.015) e CAC em glândula salivar menor (p=0.012), embora tenha reduzido em pacientes tratados com cirurgia associado à terapia adjuvante no CCA e no CAC (p=0.036 e p=0.020, respectivamente). A baixa expressão de XRCC1 no núcleo (p=0.028) ou a expressão de XRCC1 concomitante no núcleo e no citoplasma (p=0.017) foram associadas com menor taxa de sobrevida global em 5 anos. Finalmente, o teste de correlação de Spearman demonstrou correlação positiva entre a APE e XRCC1 em todos os TMGS analisados, embora a correlação entre as três proteínas (APE1, XRCC1 e XPF) tenha sido observada apenas em CAC e CME (p<0.05). Este trabalho demonstrou alta expressão das proteínas de reparo APE1, XRCC1 e XPF em CCA, AcP, CAC e CME, o que pode sugerir atividade reguladora relacionada ao controle genotóxico dessas proteínas nos TMGS.
Palavras-chaves: Neoplasias das Glândulas Salivares. Reparo do DNA. DNA Liase (Sítios Apurínicos ou Apirimidínicos). Proteína 1 Complementadora Cruzada de Reparo de Raio-X. Fator de Complementação F do Xeroderma Pigmentoso. Imuno-Histoquímica.
ABSTRACT
Malignant salivary gland tumors (MSGT) are rare, heterogeneous lesions with a variable prognosis. Mammalian cells are subject to thousands of spontaneous changes in the deoxyribonucleic acid (DNA) molecule. The apuric or apyrimidic endonuclease protein 1 (APE1) and the X-ray crossover complementation protein 1 (XRCC1) are two important components of the base excision repair pathway (BER), and the complementation factor protein F of the xeroderma pigmentosum (XPF), the nucleotide excision repair pathway (NER). This study analyzed the immunohistochemical expression of APE1 and XRCC1 proteins of the BER pathway, and XPF of the NER pathway, in a sample of primary tumors of acinar cell carcinoma (ACC), polymorphic adenocarcinoma (PAC), adenoid cystic carcinoma (AdCC) and mucoepidermoid carcinoma (MEC). A total of 62 MSGT were included and submitted to immunohistochemistry against the selected antibodies, corresponding to 14 ACC, 15 PAC, 16 AdCC, and 17 MEC. The tissue sections were subjected to immunohistochemistry for APE1, XRCC1 and XPF. The cells of the tumor parenchyma were quantitatively evaluated, using photomicrographs of 5 fields (in 400x magnification), by a single evaluator. Immunoreactive cells were those with brownish color in the nucleus and/or nucleus/ cytoplasm, regardless of intensity. Immunomarked and negative cells were counted in the 5 fields, establishing the percentage of positive cells in relation to the total number of cells counted. In addition, it was established whether the nucleus or nucleus/cytoplasm ratio, inferring whether the location was predominantly uni or bicompartmental. Statistical tests included Fisher's exact, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Spearman's correlation, as well as the log-rank for comparison of the overall survival built through Kaplan-Meier method. Significance was set at p<0.05. All selected MSGT scored for APE1, XRCC1 and XPF. There was no difference between the expression of APE1 and XPF among the studied tumors. For XRCC1, however, there was a significant difference between PAC and MEC (p=0.032). Nuclear labeling of APE1 was statistically higher in the selected MSGT (p<0.0001). There was a statistical relationship between APE1 and T1-T2 tumors in the AdCC (p=0.006), as well as an increase in XPF in patients with MEC over 60 years (p=0.015) and AdCC in a minor salivary gland (p=0.012), although reduced in patients treated with surgery associated with adjuvant therapy in ACC and AdCC (p=0.036 and p=0.020, respectively). The low expression of XRCC1 in the nucleus (p=0.028) or the expression of concomitant XRCC1 in the nucleus and cytoplasm (p=0.017) were associated with a lower overall 5-year survival rate. Finally, the Spearman correlation test demonstrated a positive correlation between APE and XRCC1 in all MSGT analyzed, although the correlation among the three proteins (APE1, XRCC1 and XPF) was observed only in AdCC and MEC (p<0.05). This study demonstrated high expression of the repair proteins APE1, XRCC1 and XPF in ACC, PAC, AdCC, and MEC, which may suggest regulatory activity related to the genotoxic control of these proteins in MSGT.
Keywords: Salivary gland neoplasms. DNA Repair. APEX1 protein human, X-ray Repair Cross Complementing Protein 1, xeroderma pigmentosum group F protein. Immunohistochemistry.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Modelo molecular geral do mecanismo da via BER em humanos, por meio da via curta e da via longa...
31 Figura 2 - Representação dos domínios estruturais e funcionais da APE1... 33 Figura 3 - Representação dos domínios estruturais e funcionais de XRCC1... 35 Figura 4 - Modelo molecular geral do mecanismo da via NER em humanos. Reparo
no genoma global (GG-NER) e reparo acoplado à transcrição (TC-NER).. 40 Figura 5 - Características morfológicas dos tumores malignos de glândula
salivar... 52 Figura 6 - Imunoexpressão de APE1 em tumores malignos de glândulas
salivares... 54 Figura 7 - Imunoexpressão de APE1 em carcinoma de células acinares (CCA),
adenocarcinoma polimorfo (AcP), carcinoma adenoide cístico (CAC) e carcinoma mucoepidermoide (CME)... 55 Figura 8 - Imunoexpressão de XRCC1 em tumores malignos de glândulas
salivares... 58 Figura 9 - Imunoexpressão de XRCC1 em carcinoma de células acinares (CCA),
adenocarcinoma polimorfo (AcP), carcinoma adenoide cístico (CAC) e carcinoma mucoepidermoide (CME)... 59 Figura 10 - Imunoexpressão de XPF em tumores malignos de glândulas salivares... 62 Figura 11 - Imunoexpressão de XRCC1 em carcinoma de células acinares (CCA),
adenocarcinoma polimorfo (AcP), carcinoma adenoide cístico (CAC) e carcinoma mucoepidermoide (CME)... 63 Figura 12 - Imunoexpressão de APE1 (A), XRCC1 (B) e XPF (C) de acordo com a
presença ou ausência de diferenciação mioepitelial... 66 Figura 13 - Imunoexpressão de APE1, XRCC1 e XPF de acordo com a gradação
mucoepidermoides (CME; D-F)... 67 Figura 14 - Curva de probabilidade de sobrevida global em cinco anos dos pacientes
com tumores malignos de glândula salivar... 69 Figura 15 - Curva de probabilidade de sobrevida livre de doença em cinco anos dos
pacientes com tumores malignos de glândula salivar... 70 Figura 16 - Curvas de probabilidade de sobrevida global e sobrevida livre de doença
em cinco anos dos pacientes com tumores malignos de glândulas salivares segundo a imunoexpressão de APE1, XRCC1 e XPF... 72
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1 - Especificidade, Clone, Fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos utilizados ... 44 Tabela 1 - Características demográficas e clínicas da amostra de acordo com o
tipo de tumor. Natal/RN, 2020... 48 Tabela 2 - Mediana, quartis 25 e 75 e significância estatística (p) para a expressão
de APE1 nos tumores malignos de glândula salivar em relação às características clínicas. Natal/RN, 2020... 55 Tabela 3 - Mediana, quartis 25 e 75 e significância estatística (p) para a expressão
de APE1 nos tumores malignos de glândula salivar em relação às características clínicas. Natal/RN, 2020... 59 Tabela 4 - Mediana, quartis 25 e 75 e significância estatística (p) para a expressão
de APE1 nos tumores malignos de glândula salivar em relação às características clínicas. Natal/RN, 2020... 63 Tabela 5 - Distribuição dos tumores de glândulas salivares de acordo com a
localização da imunomarcação de APE1, XRCC1 e XPF nos compartimentos celulares. Natal/RN, 2020... 64 Tabela 6 - Tamanho da amostra, coeficiente de correlação de Spearman (r) e
significância estatística da imunoexpressão de APE1, XRCC1 E XPF nos espécimes de carcinoma de células acinares (CCA), adenocarcinoma polimorfo (AcP), carcinoma adenoide cístico (CAC) e carcinoma mucoepidermoide (CME). Natal/RN, 2020... 67 Tabela 7 - Análise de sobrevida global (SG) e sobrevida livre de doença (SLD)
em cinco anos dos pacientes com tumores malignos em glândulas salivares (n=48), de acordo com as variáveis demográficas, clínico-patológicas e imunoexpressão de APE1, XRCC1 e XPF. Natal/RN, 2020... 70
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AcP Adenocarcinoma polimorfo
APBG Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau AP Apurínico/apirimidínico
APE1 Endonuclease apúrica ou apirimídica AT Ataxia-telangiectasia
BER do inglês, base excision repair, traduzido como reparo por excisão de base BRCT Domínio central de ligação ao DNA
BRCTb Domínio do C-terminal de ligação ao DNA CAC Carcinoma adenoide cístico
CaexAP Carcinoma ex-adenoma pleomórfico CCA Carcinoma de células acinares CME Carcinoma mucoepidermoide
CRTC1 Do inglês, CREB-regulated transcription coactivator 1 CS Do inglês, Cockayne sindrome
DNA Do inglês deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido desoxirribonucleico DNAmt Do inglês Mitochondrial deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido
desoxirribonucleico mitocondrial
DOG1 Do inglês, Discovered on gastrointestinal stromal tumor (GIST) -1
ERCC4 Do inglês, ERCC Excision Repair 4, Endonuclease Non-Catalytic Subunit ERO Espécie reativa de oxigênio
ETV6 Do inglês, ETS variant transcription factor 6 FA Do inglês, Fanconi anaemia
FEN1 Do inglês, Flap Structure-Specific Endonuclease 1 GGR Do inglês, global genome repair
HIF-1α Do inglês, hypoxia-inducible fator 1α, traduzido como Fator induzível por hipóxia 1α
Kb Kilobase
MAML2 Do inglês, Mastermind like transcriptional coactivator 2
MDR Do inglês, multidrug resistance gene, traduzido como genes de resistência a múltiplas drogas
NER Do inglês, nucleotide excision repair, traduzido como reparo por excisão de nucleotídeo
NF-κB Do inglês, factor nuclear kappa B, traduzido como Fator nuclear kappa B Nrf1 Do inglês, Nuclear respiratory factor 1, traduzido como fator respiratório
nuclear
NOTCH Do inglês, Notch homolog 1, translocation-associated (Drosophila) NTD Domínio N-terminal de ligação ao DNA
NTRK3 Do inglês, Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 3 OMS Organização Mundial da Saúde
PARP1 Do inglês, Poly [ADP-ribose] polymerase 1, traduzido como poli [ADP-ribose] polimerase 1
PARPi Do inglês, Poly [ADP-ribose] polymerase 1 inhibitors, traduzido como inibidores da poli [ADP-ribose] polimerase 1
PCNA Do inglês, Proliferating cell nuclear antigen Pol β Refere-se à polimerase beta (β)
RAD23B Do inglês, RAD23 Homolog B, Nucleotide Excision Repair Protein RDD Resposta ao dano do DNA, traduzido do inglês DNA damage response REF-1 Do inglês, redox effector factor 1, traduzido como fator efetor redox 1 RNA Do inglês ribonucleic acid, traduzido como ácido ribonucleico
RTq-PCR Do inglês, Polymerase chain reaction quantitative real time, traduzido como reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real
ssDNA DNA de fita dupla
TCR Do inglês, transcription-coupled NER TMGS Tumores malignos de glândula salivar
TFIIH Refere-se ao complexo do fator de iniciação da transcrição IIH
UV Ultravioleta
VNU Variação de nucleotídeo único XL1/2 Linker 1/2
XP Xeroderma pigmentoso
XPF Do inglês Xeroderma pigmentosum complementation F, traduzido como fator de complementação F do xeroderma pigmentoso
XRCC1 Do inglês X-ray repair cross-complimenting protein-1, traduzido como proteína 1 de complementação cruzada de reparo de raios-X
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 19
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 21
2.1 Neoplasias de glândula salivar: considerações gerais ... 21
2. 1.1 Carcinoma de células acinares ... 22
2. 1.2 Adenocarcinoma polimorfo ... 24
2. 1.3 Carcinoma adenoide cístico ... 25
2.1.4 Carcinoma mucoepidermoide ... 27
2.2 Reparo do DNA ... 28
2.2.1 Via de reparo por excisão de base ... 29
2.2.1.1 Endonuclease apúrica ou apirimídica (AP) ... 31
2.2.1.2 Proteína 1 de complementação cruzada de reparo de raios-x (XRCC1) ... 35
2.2.2 Via de reparo por excisão de nucleotídeo ... 37
2.2.2.1 Fator de complementação f do xeroderma pigmentoso (XPF) ... 38
3 PROPOSIÇÃO ... 41
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 42
4.1 Considerações éticas ... 42
4.2 Caracterização do estudo ... 42
4.3 Amostra ... 42
4.4 Critérios de seleção da amostra ... 42
4.5 Estudo clínico ... 43
4.6 Estudo morfológico ... 43
4.7 Estudo imuno-histoquímico ... 43
4.8 Análise estatística ... 45
5 RESULTADOS ... 47
5.1 Perfil clínico-patológico da amostra ... 47
5.2 Resultados morfológicos ... 49 5.3 Resultados imuno-histoquímicos ... 53 5.4 Análise de sobrevida ... 69 6 DISCUSSÃO ... 73 7 CONCLUSÃO ... 81 REFERÊNCIAS ... 82
APÊNDICE A – Ficha catalográfica ... 92
APÊNDICE C – Artigo ... 94 ANEXO A – Parecer do comitê de ética ... 116
1 INTRODUÇÃO
As neoplasias de glândula salivar correspondem a um grupo heterogêneo de lesões, com variadas características morfológicas, imuno-histoquímicas e moleculares, que acometem as glândulas salivares maiores e menores. Elas são subdivididas em lesões malignas e benignas, e representam cerca de 3-5% das neoplasias de cabeça e pescoço (SPEIGHT; BARRETT, 2002; HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014; WANG et al., 2017). Estima-se uma taxa de incidência anual de 0,3-4 casos por 100.000 indivíduos, de acordo com os dados de estudos de base populacional (GALDIRS et al., 2019). As causas primárias das neoplasias malignas e benignas de glândula salivar não são claramente estabelecidas, embora associações etiológicas tenham sido feitas com deficiências nutricionais, exposição à radiação ionizante, exposição ultravioleta, predisposição genética e infecção viral (vírus Epstein-Barr) (QUON et al., 2014).
Em 2017, a Organização Mundial da Saúde (OMS) reconheceu 31 subtipos histológicos de neoplasias de glândula salivar, sendo 20 delas malignas e 11 benignas (EL-NAGGAR et al., 2017). Dentre os subtipos histológicos de tumores malignos de glândula salivar (TMGS), o carcinoma adenoide cístico (CAC) e o carcinoma mucoepidermoide (CME) são os que acorrem com mais frequência, além de terem comportamento biológico distinto (GAO et al., 2017; SILVA et al., 2018; HE et al., 2017; HU et al., 2019). Outros subtipos, como o carcinoma de células acinares (CCA) e o adenocarcinoma polimorfo (AcP), além de também terem destaque de incidência dentre os demais TMGS, são reconhecidos pelo comportamento mais indolente e prognóstico mais satisfatório (PATEL et al., 2015; SILVA et al., 2018; SCHERL et al., 2018).
As células de mamíferos estão, naturalmente, sujeitas a milhares de reações espontâneas de oxidação, alquilação, hidrólise e ionizações na molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA). Se esses danos não forem reparados por um sistema de reparo de DNA eficiente, eles se acumulam, interferindo na maquinaria de replicação, transcrição e na viabilidade celular (JEGGO; PEARL; CARR, 2016). Dessa forma, a propensão a mutação e/ou a incapacidade de reparar danos ao DNA contribuem para a transformação de uma célula normal em uma célula neoplásica (JEGGO; PEARL; CARR, 2016). Duas grandes vias se destacam pelo reparo do DNA, a via de reparo por excisão base (BER) e a de reparo por excisão nucleotídeo (NER) (CURTIN, 2012; MARTEIJN et al., 2014). Dentre os componentes da via BER, a proteína endonuclease apúrica ou apirimídica 1 (APE1) e a proteína 1 de complementação cruzada de reparo de raios-x (XRCC1) participam do
reconhecimento e do preenchimento do sítio abásico, respectivamente, reparando o dano a fita de DNA (WALLACE, 2014). A APE1, também conhecida como fator efetor redox 1, é uma proteína multifuncional, que se destaca pelas funções de endonuclease no reparo do DNA e de coativador redox de fatores transcricionais (TELL et al., 2005). A XRCC1, por sua vez, é uma proteína scaffold, isto é, que organiza os componentes proteicos do reparo em torno da lesão ao DNA (HANSSEN-BAUER et al., 2012; LONDON, 2015).
Dentre os componentes da via NER, a fator de complementação F do xeroderma pigmentoso (XPF) exerce função catalítica e remove, juntamente com a ERCC1, nucleotídeos danificados por estímulos UV e aditivos químicos, fornecendo uma extremidade livre de 3'-OH para que a DNA polimerase exerça suas funções (McNEIL; MELTON, 2012; MANANDHAR; BOULWARE; WOOD, 2015; FERRI; ORIOLI; BOTTA, 2020). Em síntese, reconhece-se que a atividade de reparo da APE1, XRCC1 e XPF depende de sua localização no núcleo celular (TELL et al., 2005; KUTOBA et al., 2009; AHMAD et al., 2010). As proteínas de reparo do DNA são importantes porque participam dos mecanismos de vigilância ao dano e regulam o background genético favorável à progressão das células neoplásicas, interferindo, inclusive, na resposta a agentes terapêuticos citotóxicos (CURTIN, 2012; JEGGO; PEARL; CARR, 2016; CHATTERJEE; WALKER, 2017).
No contexto dos TMGS, as proteínas de reparo foram pouco investigadas. Há relatos da investigação de polimorfismo no gene XRCC1 relacionado às neoplasias de glândula salivar (HO et al., 2007), da proteína APE1 em adenomas pleomórficos e carcinomas ex-adenomas pleomórficos (CaexAP) (SILVA et al., 2017), e das proteínas hMSH2 e hMLH1 do sistema de reparo de incompatibilidade (CASTRILLI et al., 2002), embora os resultados não sejam amplos e conclusivos. Em outras neoplasias, por outro lado, a alta expressão de APE1 estava relacionada a piores prognósticos em câncer de mama (WOO et al., 2014) e a tumores de alto grau em gliomas (BOBOLA et al., 2001). A alta expressão de XRCC1 e XPF se relaciona ora a um mau prognóstico (VAEZI et al., 2011; ABDEL-FATAH et al., 2012), ora a um bom prognóstico (MIAN et al., 2016; LIU et al., 2018), sendo, portanto, necessárias mais investigações para se chegar a fins conclusivos.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Neoplasias de glândula salivar: considerações gerais
As glândulas salivares humanas são divididas em maiores e menores. As glândulas salivares maiores são constituídas por três pares de glândula: parótida, submandibular e sublingual, responsáveis por 90% do volume total de saliva produzido. As glândulas salivares menores correspondem a 600-1000 glândulas distribuídas por toda cavidade oral. Os constituintes das glândulas salivares são as células acinares/ductais e mioepiteliais (DE PAULA et al., 2017).
O desenvolvimento das glândulas salivares ocorre entre a 6-8 semana de gestação e envolve interações entre tecidos epiteliais e mesenquimais, que induzem e controlam a morfogênese e a citodiferenciação das glândulas salivares. Isso envolve os eventos iniciais de espessamento epitelial até o estágio final de broto, onde se vê brotos terminais diferenciados e um sistema ductal presuntivo com respectivos lúmens bem desenvolvidos (TUCKER, 2007; HOLMBERG; HOFFMAN, 2014; DE PAULA et al., 2017). A princípio, os brotos do ducto primitivo são compostos por um revestimento interno das células do ducto e da camada de células externas, que adquire, posteriormente, os ácinos glandulares esféricos como unidades funcionais finais (DWIVEDI et al., 2013). A atividade das glândulas salivares envolve a produção de secreção serosa, mucosa ou seromucosa, cujo efeito, em última instância, resulta na lubrificação para alimentação e vocalização, digestão, paladar, tampão de pH e defesa imune inata e adaptativa (TUCKER, 2007; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013; QUON et al., 2014).
Qualquer um dos componentes das glândulas salivares adultas pode ser afetado por alterações como infecção, inflamação, doença autoimune e neoplasias. Tumores primários ou secundários (ou metastáticos) podem envolver qualquer uma das glândulas salivares maiores e menores, embora haja predileção pela glândula parótida e pelas glândulas salivares do palato (LARSEN; YAMADA; MUSSELMANN, 2010; QUON et al., 2014). No modelo morfogenético, os tumores com origem na glândula salivar envolvem três formas básicas de organização celular, a saber: (i) diferenciação de células luminais do ducto mais células do tipo basal e/ou mioepiteliais; (ii) células luminal e/ou acinares do ducto e (iii) células tumorais do tipo mioepitelial e/ou basal exclusivamente (DWIVEDI et al., 2013). Em última instância, a perda funcional da glândula é observada, com o aparecimento de hipossalivação, mastigação
e deglutição deficientes, o que também contribui para um risco aumentado de ocorrência de infecções (LARSEN; YAMADA; MUSSELMANN, 2010; QUON et al., 2014).
Os tumores de glândulas salivares são lesões incomuns, com incidência média anual de 0,3-4 por 100.000 pessoas (GALDIRS et al., 2019). Em um trabalho retrospectivo de 10 anos, Silva et al. (2018) destacaram que as neoplasias de glândula salivar acometeram indivíduos de 1-101 anos, com média de idade para tumores benignos e malignos de 47 e 55 anos, respectivamente. A proporção entre mulheres e homens foi de 1,5:1. As glândulas parótidas foram os locais mais acometidos (40,7%), seguindo das glândulas salivares menores do palato (27,5%). Quanto ao subtipo histológico, o adenoma pleomórfico foi o subtipo benigno mais comum, enquanto o CME, CAC, e o AcP foram os subtipos malignos mais prevalentes (SILVA et al., 2018).
2. 1.1 Carcinoma de células acinares
O CCA é uma neoplasia de comportamento indolente, que foi descrita originalmente como uma neoplasia benigna. O seu potencial de malignidade foi afirmado apenas em 1950, devido a propensão à invasão linfática e a metástases à distância. Ele é o único carcinoma de glândula salivar que demonstra diferenciação de células acinares serosas (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014; VANDER POORTEN et al., 2016). A OMS define o CCA como sendo uma “neoplasia maligna de glândula salivar composta por células com características acinares” (EL-NAGGAR et al., 2017).
O CCA representa cerca de 15% de todos os tumores malignas de glândula salivar e acomete quase exclusivamente as glândulas parótidas. CCA de glândula salivar menor é raro, mas, quando acontece, é mais comum na mucosa jugal e lábio superior. Ele é mais comum no sexo feminino, com ampla faixa etária de acometimento; e é o segundo tumor maligno de glândula salivar mais comum em crianças depois do CME. O aspecto clínico do CCA evidencia um aumento de volume indolor e inespecífico, uni ou multilobulado. Supreendentemente, a paralisia secundária do nervo facial é vista em menos de 10% dos casos, considerando sua localização anatômica predominante (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014; VANDER POORTEN et al., 2016).
O CCA deriva do componente acinar das glândulas salivares e é comporto por células luminais e/ou acinares (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014; CHINTAKUNTLAWAR et al., 2016). As células com diferenciação acinar têm citoplasma rico em grânulos de zimogênio, semelhante àquele de células serosas normais.A presença de células vacuoladas, claras e de
uma população de células glandular não específica também é observada no CCA (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014). Ele pode assumir diferentes padrões de crescimento, incluindo arranjo sólido, microcístico, papilar-cístico e folicular (LEIVO, 2006). Batsakis, Luna e El-Naggar (1990) tentaram estabelecer três níveis de agressividade para o CCA, de acordo com o princípio histogenético de origem das células de reserva do ducto intercalado. Quer dizer, o grau 1, para as lesões monolobulares, <3cm, predomínio de arquitetura sólida e/ou microcística diferenciada, e sem ou com mínimo pleomorfismo celular; grau 2, para as lesões multilobulares, entre 3 e 6 cm, com predomínio de diferenciação tubuloductal e/ou papilar-cística, pleomorfismo celular, invasão vascular e neural; e, finalmente, grau 3, para as lesões infiltrativas, >6cm, com padrão de crescimento mais indiferenciado e infiltrativo, pleomorfismo nuclear e celular, invasão vascular e neural. A maioria das lesões é de grau baixo a intermediário. Contudo, a transformação de alto grau do CCA não é incomum, sendo associada a taxas de recidiva local, metástase à distância e pior sobrevida (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014; CHINTAKUNTLAWAR et al., 2016)
A semelhança histológica do CCA com o carcinoma secretor, composto por células acinares não serosas, fez com que casos dessas lesões fossem confundidos no momento do diagnóstico. É reconhecido que uma série de casos de carcinoma secretor foi diagnosticado como CCA, em especial nas glândulas salivares menores, e discute-se se os casos de CCA com localização anatômica fora da parótida são, de fato, CCA ou se são parte do espectro do carcinoma secretor. Atualmente, o perfil fenotípico das células que compõem esses tumores, bem como a translocação (12; 15) (p13;q25), que resulta na fusão dos genes ETV6 e NTRK3, específica do carcinoma secretor e que não foi relatada em nenhum outro tumor de glândula salivar, permite a distinção entre essas duas lesões. Sabe-se, portanto, que o perfil fenotípico DOG1 negativo e mamaglobina positivo é próprio do carcinoma secretor e o inverso é verdadeiro para o CCA (VANDER POORTEN et al., 2016; HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014; SAID-AL-NAIEF et al., 2017; MIESBAUEROVÁ et al., 2019).
A ressecção cirúrgica é o tratamento definitivo para o CCA, embora a radiação adjuvante do feixe externo seja utilizada em alguns casos, dependendo das características clínicas e patológicas que prenunciam um alto risco de recorrência (CHINTAKUNTLAWAR et al., 2016; VANDER POORTEN et al., 2016). Chintakuntlawar et al. (2016) destacam que o envolvimento de múltiplos linfonodos, tamanho dos linfonodos, extensão extracapsular do tumor, localização (lobo profundo da parótida), extensão extraglandular, invasão perineural, invasão angiolinfática e margens cirúrgicas positivas são fatores prognóstico importantes.
2. 1.2 Adenocarcinoma polimorfo
O AcP é descrito pela OMS como uma “neoplasia epitelial maligna caracterizada por uniformidade citológica, diversidade morfológica e padrão de crescimento infiltrativo” (EL-NAGGAR et al., 2017). O AcP era reconhecido inicialmente como adenocarcinoma polimorfo de baixo grau (APBG); a classificação da OMS de 2017, contudo, removeu o complemento baixo grau e acrescentou dentro do espectro desse tumor o adenocarcinoma cribriforme de glândula salivar menor, reconhecido por ter comportamento clínico mais agressivo (EL-NAGGAR et al., 2017; VANDER POORTEN et al., 2018).
O AcP é quase exclusivamente diagnosticado em glândulas salivares menores, sendo raro nas glândulas salivares maiores. Ele representa cerca de 10-20% dos tumores malignos de glândula intraorais, ficando em primeiro ou segundo lugar de acometimento depois do CME, dependendo da região geográfica do diagnóstico. Ele é comum no sexo feminino, com faixa etária de maior acometimento entre a sexta e sétima décadas de vida. O palato é o sítio mais acometido, seguido do lábio superior e da mucosa jugal. Clinicamente, o AcP tem aspecto de um aumento de volume inespecífico, de crescimento lento e indolor (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014).
O AcP se origina do ducto intercalado. O aspecto primário é de um tumor circunscrito, embora não encapsulado, que apresenta aspecto celular uniforme. O padrão de crescimento do tumor abrange a organização sólida, tubular, cribriforme, cística, papilar-cística e linear (fileira indiana). O estoma tumoral pode ser colagenoso, mucoide, hialino ou muco-hialino (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014; VANDER POORTEN et al., 2018). As células luminais são geralmente cúbicas e delimitam espaços tubulares com uma única camada de células. O predomínio das células luminais dá a aparência tubular ao tumor. As células não luminais, por sua vez, são redondas, ovais ou fusiformes, com cromatina, geralmente, dispersa. A predominância de células não-luminais dá ao tumor a aparência de ninhos sólidos e/ou cribriformes com espaços pseudoluminal. Curiosamente, as células na periferia dos ninhos sólidos se organizam em paliçada (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014).
A aparência microscópica do AcP permite diferenciá-lo de outras neoplasias de glândula salivar, incluindo o adenoma pleomórfico, o CAC e o CaexAP. Essa distinção deve ser cautelosa e observar os aspectos citológicos, morfológicos e imuno-histoquímicos dessas lesões (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014; VANDER POORTEN et al., 2018). O mapeamento de uma mutação no gene da PRKD1 foi determinado em mais de 70% dos AcP e essa
mutação está relacionada ao aumento da atividade da proteína cinase e da proliferação celular nessa neoplasia (WEINREB et al., 2014; VANDER POORTEN et al., 2018).
O tratamento de escolha para o AcP é a excisão cirúrgica, que proporciona um controle locorregional satisfatório. Em pacientes com tumores primários grandes, margens cirúrgicas comprometidas, linfonodos comprometidos, invasão vascular e perineural, a radioterapia adjuvante pós-operatória pode ser adotada. A recorrência não é comum e a prognóstico é bom (VANDER POORTEN et al., 2018).
2. 1.3 Carcinoma adenoide cístico
O CAC é descrito pela OMS como sendo “uma neoplasia de glândula salivar de crescimento lento e implacável composta por células neoplásicas epiteliais e mioepiteliais que formam padrões tubulares, cribriformes e sólidos” (EL-NAGGAR et al., 2017). Ele é uma das neoplasias malignas de glândula mais comuns, representando cerca de 20% de todos os tumores malignos, o que corresponde a aproximadamente 1% de todas as neoplasias malignas de cabeça e pescoço (COCA-PELAZ et al., 2015b; HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014).
O CAC afeta mais comumente as glândulas parótidas, seguido das glândulas submandibulares e salivares menores. Os adultos e idosos entre a quarta e quinta décadas de vida são os mais afetados. O CAC apresenta um comportamento aparentemente indolente, de crescimento lento, embora persistente e com tendência a recorrência e metástase. Clinicamente, ele aparece como um aumento de volume inespecífico e, por vezes, doloroso, em virtude da invasão perineural (COCA-PELAZ et al., 2015b; HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014).
O CAC se origina do ducto intercalado, cujos componentes são formados por células luminais e não luminais. Microscopicamente, evidencia-se a proliferação de células luminais e não luminais, arranjadas em padrão tubular, cribriforme e sólido. Individualmente, as células não luminais têm formato basaloide, citoplasma escasso, enquanto as células luminais têm formato cúbico ou colunar, com citoplasma eosinofílico mais amplo (COCA-PELAZ et al., 2015b; HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014). Os dois tipos de células são sempre encontrados em proporções variáveis no CAC, embora a célula basaloide seja a mais comum (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014). Nos três subtipos histológicos do CAC, as mitoses são escassas, mas é possível observar alguma atipia celular. Comumente, a invasão peri e intraneural são vistas, mesmo a uma distância considerável do tumor principal. Pode haver também áreas de necrose, particularmente em áreas sólidas. Ademais, a transformação de alto
grau também pode ser visualizada no CAC, com células caracteristicamente anaplásicas e imunofenótipo alterado (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014). Curiosamente, o CAC frequentemente exibe uma combinação dos padrões tubular e cribriforme (COCA-PELAZ et al., 2015b).
A gradação histológica do CAC pode ser feita em grau I, II e III, de acordo com o subtipo histológico apresentado, conforme preconizado por Szanto et al. em 1984. Tumores com áreas tubulares e cribriformes, mas sem componentes sólidos constituem grau I, enquanto os tumores grau II apresentam padrões mistos, mas menos de 30% das áreas são sólidas. Os tumores de grau III têm predominantemente um padrão sólido (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014). O sistema de classificação histológico parece se correlacionar com o prognóstico da lesão, embora mais estudos sejam necessários para apurar essa teoria (COCA-PELAZ et al., 2015b; HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014).
A investigação do padrão molecular do CAC permitiu identificar uma translocação cromossômica recorrente, t (6; 9) (q22-23; p23-24), cujo resultado da fusão envolve os genes MYB e NFIB, que pode tornar uma célula progenitora suscetível à transformação maligna (BELL; HANNA, 2013). Outras alterações nos genes Sox-4, c-kit, no receptor do fator de crescimento epidérmico (RFCE), via Wnt/β-catenina, perda gênica nos cromossomos 6q e 8p23, ganho do cópias no cromossomo 22q e perda de heterozigosidade no cromossomo 6q são os achados citogenéticos mais comumente encontrados no CAC, embora seus papeis não estejam de todo esclarecidos (LIU et al., 2012; BELL; HANNA, 2013; HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014).
A terapia do CAC envolve a excisão radical, dissecção seletiva de linfonodos e a radioterapia adjuvante para o controle locorregional da doença em estágio inicial. Em estágios avançados, regimes quimio e radioterápicos são comumente utilizados (CHAE et al., 2015; CAO et al., 2017). Cao et al. (2017) destacam que a idade, local do tumor, classificação T e N, status da margem e radioterapia foram fatores prognósticos importantes em seu estudo. Além desses fatores, o subtipo histológico sólido e a invasão vascular e neural parecem influenciar o prognóstico do CAC (COCA-PELAZ et al., 2015b). A taxa de sobrevida global do CAC em cinco anos é de aproximadamente 84,7% (CAO et al., 2017).
2.1.4 Carcinoma mucoepidermoide
O CME é a neoplasia maligna de glândula salivar mais comum, representando cerca de 30-35% de todos os tumores malignos (DWIVEDI et al., 2013; HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014). A OMS define o CME como uma “malignidade distintiva da glândula salivar composta por células tumorais mucosas, intermediárias e epidermoides, formando padrões cístico e sólido” (EL-NAGGAR et al., 2017).
Entre as glândulas salivares maiores, a glândula parótida é a mais afetada e, em relação as glândulas salivares menores, o palato e a mucosa jugal são os sítios mais comumente acometidos (COCA-PELAZ et al., 2015a). O CME aparece clinicamente como um aumento de volume indolor, fixo ou móvel, com superfície vermelha ou azulada, medindo, na maioria das vezes, de 2-5cm (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014).
A histogênese do CME envolve células do ducto excretor. Histologicamente, nota-se uma neoplasia não encapsulada, frequentemente lobulada, composta de três subtipos celulares (epidermoides, intermediárias e mucosas), podendo haver a presença de células claras, oncocíticas e colunares. O parênquima tumoral é organizado em agregados sólidos e espaços císticos, simples ou múltiplos, de diferentes tamanhos. Cavidades menores são frequentemente arredondadas, e, quando múltiplos, resultam em um padrão pseudocribriforme. Esses espaços císticos são delimitados, primariamente, por células mucosas colunares ou cuboides, mas com quantidades varáveis de células intermediárias e epidermoides. O acúmulo de material secretório pode ser visto nas cavidades, que pode estar associado com macrófagos espumosos (COCA-PELAZ et al., 2015a; HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014; EL-NAGGAR et al., 2017).
Individualmente, as células mucosas são piramidais, semelhantes a cálices ou esferoidais, com citoplasma abundante, deslocando o núcleo pequeno para a periferia. Essas células são produtoras de mucinas (MUCs), que são secretadas ou se acumulam no citoplasma; geralmente não apresentam atipia ou atividade mitótica (COCA-PELAZ et al., 2015a). As células epidermoides são poligonais, com núcleo hipercromático e citoplasma eosinofílico abundante. Notam-se pontes intercelulares demarcadas e ocasionalmente ceratinização individual. Atipia ou atividade mitótica também podem ser vistas. As células intermediárias, por sua vez, são células pequenas, com núcleo grande e citoplasma eosinofílico escasso, de formato basaloide e/ou colunar. Atipia e/ou atividade mitótica são frequentemente observadas (COCA-PELAZ et al., 2015a; HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014).
Os CME são classificados histologicamente em três níveis: baixo grau, grau intermediário e alto grau, com o objetivo de prever o potencial biológico da lesão. A classificação leva em conta, basicamente, a proporção entre as populações celulares, pleomorfismo celular, figuras de mitose, necrose, invasividade e a proporção de espaços císticos em relação às áreas sólidas. O CME de baixo grau contém um componente de células mucosas proeminente, espaços císticos demarcados e atividade mitótica baixa. O CME de grau intermediário tem menos células mucosas e espaços císticos, com população de células intermediárias proeminentes; atipia e figuras de mitose são mais pronunciadas. O CME de alto grau é um tumor predominantemente sólido, contendo mais células epidermoides, necrose e atividade mitótica alta (HELLQUIST; SKÁLOVÁ, 2014; EL-NAGGAR et al., 2017).
A patogênese em torno do CME ainda é alvo de investigação. Em 2003, Tonon et al. (2003) descreveram a translocação (11;19)(q14-21;p12-13) em pacientes com CME, sendo observada em cerca de 70% dos CME. Essa translocação funde os genes CRTC1 e MAML2, conduzindo a alteração da via NOTCH. Esse rearranjo é mais frequentemente detectado em tumores de grau baixo ou intermediário, clinicamente indolentes, tendo, portanto, influência positiva no prognóstico. Outras alterações nos genes da CDKN2A e EGFR já foram relatadas, embora seus papeis na patogênese do CME ainda sejam incertos (COCA-PELAZ et al., 2015a).
Comumente, os pacientes diagnosticados com CME estão no estágio I e II. A excisão cirúrgica é o tratamento preconizado para o CME. A quimio e radioterapia adjuvantes são comumente realizadas em pacientes com tumores nos estágios III e IV, metástases linfonodais, com margens cirúrgicas comprometidas e em tumores de alto grau (PARK; LEE, 2018). O prognóstico do CME depende dessas mesmas variáveis juntamente com a idade do paciente e o sítio primário do tumor (GRANIC et al., 2018; HU et al., 2019).
2.2 Reparo do DNA
A integridade da molécula de DNA está constantemente sendo alterada pela exposição a metabólitos de processos fisiológicos, como os radicais livres da respiração celular, e a agentes externos como a radiação. O dano ao DNA pode parar a replicação celular ou gerar alterações na sequência de DNA, incluindo quebra da fita de DNA, o que conduz ao aparecimento de mutações e/ou aberrações cromossômicas. Essas mutações e/ou aberrações
cromossômicas podem ativar oncogenes ou inativar genes supressores tumorais, aumentando o risco de aparecimento de câncer (CURTIN, 2012; MARTEIJN et al., 2014).
Curiosamente, o DNA danificado não pode ser substituído, como acontece com outras macromoléculas, e depende exclusivamente do reparo para permanecer intacto (CURTIN, 2012; MARTEIJN et al., 2014). Marteijn et al. (2014) destacam que essa situação forçou a evolução de um sistema de reparo de DNA amplamente sofisticado, que atua como sensores de dano ao DNA e quinases de sinalização, moléculas mediadoras e efetoras a jusante que controlam o reparo, a progressão do ciclo e o destino celular. Em última análise, a RDD é formada por uma rede de sistemas complementares de reparo de DNA, cada um dos quais lida com uma classe específica de lesões de DNA (CURTIN, 2012; MARTEIJN et al., 2014).
Os principais mecanismos de reparo são os reparos por reversão direta, por excisão de base, por excisão de nucleotídeo, de bases mal pareadas e por recombinação homóloga ou não homóloga (CURTIN, 2012). Alberts et al. (2017) destacam que a estrutura da dupla hélice do DNA é altamente adequada para o reparo, porque possui duas cópias separadas da informação genética, o que facilita a correção por complementariedade.
Dentre os sistemas de reparo, destaca-se o reparo do excisão de base (no inglês, base excision repair [BER]), que elimina, em última instância, alterações específicas de bases, e o reparo por excisão de nucleotídeo (no inglês, nucleotide excision repair [NER]), que elimina a mais ampla gama de lesões de DNA estruturalmente não relacionadas, incluindo: ligação covalente de bases do DNA aos hidrocarbonetos (como o carcinógeno benzopireno, encontrado na fumaça do tabaco, alcatrão e exaustão do diesel) e dímeros de pirimidina (T-T, T-C e C-C), que são as principais lesões induzidas por radiação UV e numerosos aditivos químicos; ligações cruzadas de DNA causados por drogas como cisplatina; e ciclopurinas geradas por ERO, por exemplo. Isso acontece porque a via NER se concentra em um conjunto de pontos comuns compartilhados por muitas lesões diferentes, como as distorções na dupla-hélice (MARTEIJN et al., 2014; ALBERTS et al., 2017).
2.2.1 Via de reparo por excisão de base
O reparo por excisão de base é uma via conservada evolutivamente em bactérias e humanos e é responsável por reparar a maioria dos danos endógenos ao DNA, como alquilações, oxidações, desaminação, depurinação e rupturas de fita simples. A função primária da via BER é remover lesões ao DNA, a fim de manter a integridade genômica
(WALLACE, 2014). A remoção das lesões ao DNA envolve a atividades de enzimas como as glicosilases, endonucleases AP, DNA polimerases e DNA ligases (WALLACE, 2014).
O evento inicial da via BER é o reconhecimento da lesão pelas enzimas DNA-glicosilases. O conjunto de DNA-glicosilases é capaz de reconhecer a base alterada no DNA e de catalisar sua remoção hidrolítica (WALLACE, 2014; ALBERTS et al., 2017). Existem pelo menos seis tipos dessas enzimas, incluindo as que removem Cs desaminadas, As desaminadas, diferentes tipos de bases alquiladas ou oxidadas, bases com anéis rompidos e bases nas quais a ligação dupla carbono-carbono foi acidentalmente convertida em uma ligação simples entre os carbonos (ALBERTS et al., 2017).
Nesse sentido, quando ocorre uma alteração na sequência de base, o nucleotídeo alterado é projetado para fora da hélice, onde ele é reconhecido pelas DNA-glicosilases e removido do açúcar. A lacuna deixada pela remoção da base, conhecida como sítio apurínico/apirimidínico (AP), é, então, reconhecida por uma enzima chamada endonuclease apúrica ou apirimídica (AP), que cliva a cadeia principal fosfodiéster para correção do defeito previamente existente, deixando o radical hidroxil 3’ resultante como um substrato para a polimerase de reparação. O espaço é preenchido e selado por uma DNA ligase, mais especificamente DNA ligase I e/ou a DNA ligase III associada a XRCC1 (WALLACE, 2014; LI; WILSON, 2014; ALBERTS et al., 2017).
A remoção dos nucleotídeos pode ser feita por meio da via curta (no inglês, short-patch repair), que remove apenas um nucleotídeo e envolve a atividade da DNA polimerase β (Pol β) e a DNA ligase III, associada a XRCC1, ou pela via longa (no inglês, long-patch repair), que remove de 2 a 8 nucleotídeos e envolve a atividade das DNA polimerases replicativas (POL β, δ e ε), FEN1, PCNA e DNA ligase I (Figura 1). A escolha entre as duas vias depende da etapa do ciclo celular, da remoção completa do açúcar da extremidade 5’ e da localização do processo (WALLACE, 2014; DYRKHEEVA; LEBEDEVA; LAVRIK, 2016).
Figura 1 - Modelo molecular geral do mecanismo da via BER em humanos, por meio da via curta e da via longa.
Fonte: Adaptado de Meas; Wyrick; Smerdon (2019).
2.2.1.1 Endonuclease apúrica ou apirimídica (AP)
O DNA está sendo continuamente danificado pela ação de metabólitos internos e externos. Os sítios AP estão entre os mais abundantes danos ao DNA; eles podem emergir devido à hidrólise espontânea da ligação N-glicosídica e durante a remoção das bases danificadas do DNA pelas glicosilases de DNA, que clivam a ligação entre a base alvo e a desoxirribose. Em processos normais, cerca de 10.000 locais AP emergem diariamente nas células de mamíferos, principalmente devido à apurinização do DNA (DYRKHEEVA; LEBEDEVA; LAVRIK, 2016; WHITAKER et al., 2017).
Como visto anteriormente, a ausência de base de codificação no molde de DNA pode resultar no bloqueio das DNA e RNA polimerases, bem como em substituição, deleção e/ou inserção de nucleotídeo único, se o mecanismo de síntese de DNA estiver envolvido (DYRKHEEVA; LEBEDEVA; LAVRIK, 2016). Em última instância, os sítios AP sofrem reatividade química, levando a ligações cruzadas DNA-proteína e DNA-DNA, e a quebras na molécula de DNA. Todos esses fatores tornam esse tipo de dano altamente mutagênico, citotóxico e indutor de apoptose (DYRKHEEVA; LEBEDEVA; LAVRIK, 2016). O reparo de sítios AP é, dessa forma, um dos mecanismos globais para manter a estabilidade do genoma, e as endonucleases AP são as enzimas mais importantes envolvidas no reparo desse DNA (DYRKHEEVA; LEBEDEVA; LAVRIK, 2016).
A proteína AP é uma proteína multifuncional, pertencente a duas classes principais de endonucleases AP: aquelas que clivam o resíduo abásico 3’ (classe I) e aquelas que clivam o resíduo 5’ (classe II) (LI; WILSON, 2014). Originalmente, APE1 humana, também conhecida como fator efetor redox 1 (do inglês, redox effector factor 1 [REF-1]), compartilha homologia de sequências com a exonuclease III (xth) da Escherichia coli, embora abrigue uma região N-terminal única. A APE1 exerce função de exonuclease, atividade enzimática, endonuclease, fosfodiesterase, fosfatase, reguladora transcricional, além de ser constituinte do fator efetor da oxirredução (LI; WILSON, 2014; DYRKHEEVA; LEBEDEVA; LAVRIK, 2016). A outra classe das endonucleases AP, a APE2, têm atividade de excisão do dano 3’ fraca e sua função como uma enzima de reparo do DNA permanece em questão (LI; WILSON, 2014). Suscita-se, dessa forma, que mais de 95% da clivagem dos sítios AP seja realizada pela APE1, que gera uma ruptura simples nas porções 3’-hidroxil do DNA, deixando para trás os terminais 3'– hidroxilo e 5’-desoxirribose livres (LI; WILSON, 2014; DYRKHEEVA; LEBEDEVA; LAVRIK, 2016).
O gene humano APE1 é composto por cinco éxons, com aproximadamente 2,5 a 3 quilobases (kb) de DNA, localizado no cromossomo 14q11.2, que codifica uma proteína de 318 aminoácidos. A APE1 é expressa ubiquamente em todos os tipos de célula e tecidos humanos. Diz-se que os componentes pertencentes a família da exonuclease III foram conservados ao longo da evolução e estão presentes em muitos organismos, o que permite suscitar um papel biológico crítico exercido por essas proteínas (LI; WILSON, 2014). A atividade da APE1 reside em seus domínios constituintes; no domínio C terminal, é onde reside a atividade de endonuclease de reparo de DNA, enquanto no domínio N terminal reside a porção de controle redox dessa proteína (EVANS; LIMP-FOSTER; KELLEY, 2000).
Figura 2 - Representação dos domínios estruturais e funcionais da APE1.
Fonte: Tell et al. (2009).
A APE1 está localizada no núcleo, citoplasma ou mitocôndria, exercendo funções distintas nessas localidades. A regulação pós-traducional parece influenciar a estabilidade, a interação e a distribuição intracelular da APE1 (THAKUR et al., 2014). A APE1 é predominantemente expressa no núcleo, onde exerce, em última instância, a função de reparo do DNA, sendo um agente central e coordenador da atividade de outras proteínas de reparo da via BER (THAKUR et al., 2014; DYRKHEEVA; LEBEDEVA; LAVRIK, 2016). A atividade de reparo da APE1 é dependente de cátions divalente (Mg2+ e Mn2+) e da presença de aminoácidos, mais especificamente aspartato, histidina e glutamato, para reação hidrolítica e catalítica com os sítios AP (LI; WILSON, 2014). No citoplasma, a APE1 funciona como mediadora de reparo do DNA mitocondrial (DNAmt) e como fator de oxidorredução, favorecendo o estado ativo reduzido de fatores transcricionais (TELL et al., 2005; FISHEL; KELLEY, 2007; LAEV; SALAKHUTDINOV; LAVRIK, 2017). Curiosamente, a expressão citoplasmática é comumente vista em células com potencial proliferativo e metabólico alto (TELL et al., 2005; THAKUR et al., 2014). Demonstrou-se que a APE1 participa da regulação de genes humanos relacionados ou não ao estresse oxidativo, como o NF-ĸB, Hif-1α, Nrf1, p53, c-MYC, Pax5 e 8, que já foram relacionados à resposta oncogênica, proto-oncogênica, genotóxica e a progressão inflamatória e metastática (JAYARAMAN et al., 1997; EVANS; LIMP-FOSTER; KELLEY, 2000; ANTONIALI; MALFATTI; TELL, 2017). Além disso, mais recentemente, a APE1 foi implicada na quimiorresistência pela sua
capacidade de estimular genes de resistência a múltiplas drogas (do inglês, multidrug resistance gene [MDR]) (SENGUPTA et al., 2011).
Existe uma associação conhecida entre as mutações, o reparo do dano ao DNA e o câncer, que é comumente demonstrada em algumas síndromes humanas que carregam defeitos em vias de reparo do DNA e são mais propensas ao desenvolvimento de neoplasias, como o XP, a ataxia-telangiectasia (AT) e a anemia de Fanconi (FA) (MORAES; CABRAL NETO; MENCK, 2012). Whitaker et al. (2017) destacam que a manutenção do reparo por excisão altamente funcional depende da abundância de proteínas funcionais e do equilíbrio entre essas proteínas. Em uma metanálise de estudos observacionais, o polimorfismo de genes da via BER demonstrou efeito protetor e de risco ao desenvolvimento de câncer de mama, em especial relacionado ao gene XRCC1 (RS25487) e APE1 (rs1760944), respectivamente (QIAO et al., 2018). Um aumento da suscetibilidade à adenocarcinoma já foi demonstrada em função do polimorfismo no gene da APE1, destacando-se o câncer gastrointestinal (DAI et al., 2015) e o carcinoma hepatocelular (YANG; ZHAO, 2015).
A regulação positiva da APE1 parece ter relevância biológica tanto para o reparo do DNA quanto para as funções de oxidorredução. Quanto a isso, diz-se que o estímulo indutor da APE1 é capaz de promover o seu movimento intracelular e, consequentemente, a sua função (TELL et al., 2005). Investigações sugerem que a superexpressão da APE1 se relaciona com o prognóstico de neoplasias, como com a tumores de alto grau (AL-ATTAR et al., 2010; BOBOLA et al., 2001), redução do tempo de sobrevida (WANG; LUO; KELLEY, 2004; WOO et al., 2014), estágio clínico avançado (KUMAR et al., 2018), metástase regional (KUMAR et al., 2018), recorrência (JUHNKE et al., 2017) e resistência a medicamentos (LOU et al., 2014), enquanto que a sua redução melhora a sensibilidade à quimioterapia e à radiação (WANG; LUO; KELLEY, 2004). No contexto das neoplasias de glândula salivar, a atividade da APE1 também já foi verificada em adenomas pleomórficos e CaexAP, demonstrando positividade em todos os casos analisados, com alta expressão nuclear no CaexAP (SILVA et al., 2017).
O interesse me torno da multifuncionalidade da APE1 suscitou a emergência de mecanismos modulatórios de suas funções. Como a APE1 tem domínios funcionais aparentemente independentes, diferentes inibidores são direcionados para os seus sítios ativos, como a metoxiamina, inibidora da atividade da endonuclease AP localizada no domínio C terminal, e o APX3330 (também denominado E3330) e resveratrol, direcionado à porção N terminal e, consequentemente, a inibição da atividade redox dessa proteína (THAKUR et al., 2014; LAEV; SALAKHUTDINOV; LAVRIK, 2017). A utilização de APX3330, por
exemplo, atenuou a proliferação das células neoplásicas, em culturas tridimensionais e in vivo, de câncer de bexiga (FISHEL et al., 2019), de próstata (McILWAIN et al., 2018) e pancreático (CARDOSO et al., 2012).
2.2.1.2 Proteína 1 de complementação cruzada de reparo de raios-x (XRCC1)
O gene humano XRCC1 tem 33 kb de comprimento e está localizado no cromossomo 19q13.3–13.3. A proteína 1 de complementação cruzada de reparo de raios-X (no inglês, X-ray repair cross complementing 1 [XRCC1]) é o produto desse gene e tem cerca de 633 aminoácidos, cuja função de arcabouço medeia o recrutamento e a interação proteína-proteína, com a DNA ligase I, III e IV, APE1, DNA polβ e poli [ADP-ribose] polimerase 1 (PARP1), das vias de reparo BER, NER e por recombinação não homóloga (MOSER et al., 2007; HANSSEN-BAUER et al., 2012; LONDON, 2015). Curiosamente, a XRCC1 não tem função catalítica conhecida, exercendo, portanto, função de proteína scaffold (MOSER et al., 2007).
A XRCC1 consiste em três domínios estruturais conectados, a saber: o domínio N-terminal de ligação ao DNA (NTD), o domínio central BRCTa e o domínio do C-N-terminal BRCTb, ligados por fragmentos interdomínios importantes, o linker 1 e 2 (XL1 e XL2). A disponibilidade dos dois domínios BRCT, que se associa com outras proteínas, e o domínio NTD cria as condições para a função da proteína XRCC1 como organizador estrutural dos “reparossossomos” (Figura 3) (MOOR; LAVRIK, 2018).
Figura 3 - Representação dos domínios estruturais e funcionais de XRCC1.
Fonte: Adaptado de Kirby et al. (2015).
A atividade de scaffold da XRCC1 organiza os componentes proteicos do reparo de lesões de base, sítios abásicos e quebra de fita simples (HANSSEN-BAUER et al., 2012; LONDON, 2015). Uma das interações mais estudadas é aquela existente entre a XRCC1 e a DNA ligase III, que exerce função primordial no reparo de quebra de fita única, na BER e na NER (MOSER et al., 2007; WALLACE, 2014; DYRKHEEVA; LEBEDEVA; LAVRIK,
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