UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ESTELA MARIANA GUIMARÃES LOURENÇO
PLANEJAMENTO ASSISTIDO POR COMPUTADOR E SÍNTESE DE POTENCIAIS INIBIDORES SELETIVOS DE PDE4 BASEADOS EM
PRODUTOS NATURAIS
Natal – RN 2020
PLANEJAMENTO ASSISTIDO POR COMPUTADOR E SÍNTESE DE POTENCIAIS INIBIDORES SELETIVOS DE PDE4 BASEADOS EM
PRODUTOS NATURAIS
Dissertação de mestrado apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Euzébio Guimarães Barbosa Coorientadores: Prof. Dr. Dênis Pires de Lima Profª. Drª. Silvana Maria Zucolotto Langassner
Natal – RN 2020
Lourenço, Estela Mariana Guimarães.
Planejamento assistido por computador e síntese de potenciais inibidores seletivos de PDE4 baseados em produtos naturais / Estela Mariana Guimarães Lourenço. - 2020.
100f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas)
-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2020.
Orientador: Euzébio Guimarães Barbosa. Coorientador: Dênis Pires de Lima.
Coorientador: Slivana Maria Zucolotto Langassner.
1. Farmacologia - Dissertação. 2. Planejamento racional assistido por computador - Dissertação. 3. PDE4B - Dissertação. 4. Síntese orgânica - Dissertação. 5. Flavonóides - Dissertação. I. Barbosa, Euzébio Guimarães. II. Lima, Dênis Pires de. III. Langassner, Slivana Maria Zucolotto. IV. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 615
PLANEJAMENTO ASSISTIDO POR COMPUTADOR E SÍNTESE DE POTENCIAIS INIBIDORES SELETIVOS DE PDE4 BASEADOS EM PRODUTOS NATURAIS
Banca Examinadora:
___________________________________________ Prof. Dr. Euzébio Guimarães Barbosa
Presidente – UFRN
____________________________________________ Prof. Dr. Dênis Pires de Lima
Coorientador – UFMS
____________________________________________ Prof. Dr. Edson dos Anjos dos Santos
Examinador Externo – UFMS
____________________________________________ Profa. Dra. Raquel Brandt Giordani
Examinador Interno – UFRN
Natal, 26 de março de 2020
NATAL / RN 2020
A Deus por me acompanhar nos piores e melhores momentos e me ajudar a não desistir sob quaisquer circunstâncias. Pela fé e crença em algo maior que aumentam minha esperança em todas as situações.
Aos meus pais, Mariza Lourenço e João Maria Lourenço, meus primeiros e eternos exemplos, por me guiarem e apoiarem sem nunca pedir retorno. Agradeço por não terem medido esforços para me mostrar como ser uma pessoa melhor e por compartilharem comigo meus objetivos sendo minha felicidade maior desejo de ambos. Ao meu irmão, João Vitor Lourenço, por ter sido minha primeira inspiração de competência e por me ajudar sempre da forma mais silenciosa. À minha irmã, Ana Gabriela Lourenço, agradeço por me ensinar todos os dias, por me mostrar como ser forte e por ter dado a mim e à minha família a oportunidade única de ser feliz com situações comuns e corriqueiras. E à Ivonete de Lima, a madrinha que escolhi, pela amizade e apoio incondicionais e pelo amor que demonstra todos os dias.
À Catarina Melo, pela amizade duradoura, pela compreensão e apoio, e, principalmente, por ouvir sem julgar e dividir comigo tantas situações pelas quais passei. A Sales Germano, meu primeiro exemplo de profissional farmacêutico, pela dedicação sem limites durante minha formação e por sempre acreditar no meu potencial. Os dois me ensinaram juntos que os professores sempre acreditam e torcem por seus alunos independente do tempo e dos caminhos traçados.
À Profa. Silvana Zucolotto, pelos ensinamentos, paciência, confiança e, acima de tudo, compreensão quando me apoiou a aprender uma área de pesquisa totalmente distinta da fitoquímica. Agradeço imensamente por ter sido responsável pelo meu primeiro contato com a pesquisa e pelas diversas vezes em que falou abertamente que sentia orgulho de mim.
Ao Prof. Euzébio Guimarães, por acreditar em mim e em minha vontade de aprender, pela nossa amizade e pelo tempo que investiu ao me auxiliar durante as simulações e discussão de resultados, me fazendo compreender aos poucos a Modelagem Molecular. Agradeço, principalmente, por me tratar diversas vezes como uma colega de trabalho, me desafiando a sempre melhorar e por ser extremamente
Ao Prof. Dênis de Lima, por ter me recebido carinhosamente em seu laboratório e, desde então ter me ensinado com toda sua dedicação e carinho. Fico muito feliz por ter tido a oportunidade de ser desafiada a tentar entender não só como as coisas acontecem, mas o porquê de acontecerem. Agradeço por sempre tentar me despertar um lado filosófico, por nossas ricas conversas, pela amizade e por ter sido, sem dúvidas, meu melhor abraço em Campo Grande. Durante o período na UFMS tive o prazer de descobrir o motivo pelo qual o reconhecem não apenas como professor, mas como mestre. Tenho a certeza de que nossas discussões científicas, carinho, amizade e admiração sempre irão existir.
Aos demais professores que fazem o curso de farmácia, pelos ensinamentos e paciência. Em especial, aos professores: Guilherme Chaves, Raquel Giordani, Maiza Abrantes e Joselice Silva (in memoriam) pelos conselhos, conversas e por acreditarem que, de fato, eu aprendi o que haviam me ensinado.
Ao grupo de Pesquisa de Produtos Naturais Bioativos (PNBio) pelos ensinamentos compartilhados durantes meus anos de iniciação científica e indispensáveis durante esse trabalho. Em especial à Fernanda Santos, Ariane Teixeira e Samara Alves pela amizade independente da distância, e Letícia Gondim pelos cafés, apoio e conversas no laboratório de farmacognosia.
Ao grupo de Pesquisa em Química Farmacêutica Computacional (LabQFC) por fazerem do laboratório um ambiente de trabalho divertido e produtivo. À Pedro Igor, Natália Medeiros, Carla Mendonça, Thais Pinheiro, Marcel Verissimo e Alexander Macaulay pelo apoio e auxílio durante todo o decorrer do trabalho e a Rita Yanka por sempre ter as melhores histórias para contar. Em especial, à Paulo Henrique por ter sido um grande companheiro durante o mestrado e por dividir comigo não só o laboratório, mas os melhores e mais difíceis dias e demonstrar sempre ser uma grande amizade.
Ao grupo de pesquisa de Síntese e Transformação de Moléculas Orgânicas (SINTMOL), o LP4, pelo acolhimento durante meus dois períodos de estágio do mestrado. À Arthur Montanholi, Murilo Yonekawa e Rejane Gonçalves pela ajuda, apoio e ensinamentos durante meus primeiros três meses em Campo Grande; à Lyvia Moura e Tairine Pimentel pela simpatia e solicitude; à Ytallo Ferreira por me surpreender ao me agradecer mesmo quando pensei que não havia feito nada para isso, à Rosane Cesar e Felipe Bley por me provarem que estariam do meu lado não apenas em
pela amizade e por ter sido minha família em Campo Grande.
Ao Luiz Leonardo pela paciência em tentar analisar minhas amostras e pelo exemplo de profissional. E a Jacqueline Petrone e Luciana Ravaglia pela ajuda e disposição nas análises de RMN.
À Fábia Freire e Gibson que sempre me ajudaram durante todo o processo de mestrado e facilitaram todas as etapas solicitadas pelo PPGCF. Agradeço também a amizade que foi criada durante esse período e por demonstrarem claramente o quanto torcem por mim.
À Profa Maria Rita Marques e Prof. Edson dos Santos, Giovanna Galvão, Alexandre Sena, Renato Medeiros, Talita Amorim, Valéria Costa, Pedro Ivo, Rita Nykassia, Camila Soares, Luiza Abrantes, Thais Lins, Teresa Carvalho, Ysla Kallena, Andreza Geovana, Arthur Venâncio e Elton Viana. Todos, independente do lugar, me trouxeram o conforto e confiança nos momentos em que mais precisei.
Simplicity is the ultimate sophistication
O desenvolvimento da síntese orgânica representa um grande avanço no descobrimento de novos fármacos, sendo considerada uma etapa importante na química medicinal. Apesar disso, o processo de obtenção e otimização de fármacos é considerado desafiador. O alto custo e tempo laboratorial deste processo são oriundos, especialmente, da priorização da síntese de novos compostos sem estudos moleculares mais aprofundados. O uso do planejamento racional de fármacos assistido por computador a partir de protótipos é considerado uma ferramenta importante, capaz de guiar a síntese de novas moléculas. Aliado a isso, a prospecção de produtos naturais possui um amplo histórico no descobrimento de fármacos e ainda se apresenta como uma fonte de protótipos inéditos. Recentemente, foi isolado um flavonoide glicosilado com notória seletividade para a isoforma PDE4B em comparação à PDE4A. Esse alvo pode ser destacado como uma alternativa promissora na busca pelo tratamento de doenças como deficiência obstrutiva pulmonar crônica e asma. Contudo, a estrutura desse flavonoide apresenta desafios estruturais que o impedem de ser considerado um potencial fármaco. O presente estudo tem como objetivo o desenho e síntese de novos potenciais inibidores seletivos da enzima PDE4 utilizando como protótipo o quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosideo. Para tanto, foi construída uma biblioteca de inibidores seletivos de fosfodiesterase 4B e utilizada para a elaboração de um modelo de QSAR 4D bem como de uma relação estrutura-atividade. Estudos de dinâmica molecular e cálculos de energia livre de ligação foram também realizados com o objetivo de construir hipóteses relacionadas ao modo de interação do protótipo no sítio ativo de ambas as isoformas. Os resultados demonstraram a importância de grupamentos polares capazes de interagir com os resíduos de aminoácido dos sítios M e S. Interações intermoleculares hidrofóbicas com a fenilalanina presente no sítio Q foram apontadas como essenciais, justificando a necessidade da presença de um anel aromático ou heterocíclo na estrutura dos inibidores. Os valores calculados de energia livre de ligação e o estudo de flexibilidade proteica permitiram a determinação de dois possíveis modos de interação do flavonoide em PDE4A e PDE4B e corroboraram com a seletividade observada in vitro. Com essas informações, foram propostos análogos capazes de serem obtidos via uma rota sintética acessível e versátil. Os compostos propostos já foram obtidos a partir de diferentes metodologias e que obedecem aos princípios de química verde. Esse estudo pode contribuir para a obtenção dos compostos alvos planejados e possíveis protótipos de fármacos para o tratamento da deficiência obstrutiva pulmonar crônica e asma.
Palavras-chave: Planejamento racional assistido por computador, síntese orgânica, PDE4B, flavonoides.
ABSTRACT
The development of organic synthesis represents an important advance in the discovery of new drugs, being considered an important step in medicinal chemistry. However, the preparation and optimization of drugs is considered a challenge task. The expenditure and time consuming involved in this process are result, particularly, of the prioritization of the synthesis of new compounds without deeper molecular studies. The use of computer aided-drug design using prototypes is considered an important tool, capable to generate guide the synthesis of new molecules. In addition, the prospection of natural products has a long history in drug discovery and is still a source of unprecedented prototypes. Recently, a glycosylated flavonoid with remarkable selectivity for PDE4B isoform in comparison with PDE4A was isolated. This target can be highlighted as a promising alternative for the treatment of diseases as asthma and chronical obstructive pulmonary disease. Nonetheless, the structure of the flavonoid has some structural challenges that prevent it from being considered a potential drug. The present study aims to design and synthesize new potential selective inhibitors of PDE4 enzyme using the quercetin 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-O-α-L-rhamnopyranoside as a prototype. Therefore, a library of selective phosphodiesterase 4B inhibitors was constructed and utilized for the elaboration of a 4D QSAR model and a structure-activity relationship. Molecular dynamics studies and binding free energy calculations were also made to construct hypothesis related to the binding mode of the prototype in the active site of both isoforms. The results demonstrated the importance of polar groups capable to interact with the amino acid residues of M and S pockets. Hydrophobic intermolecular interactions with the phenylalanine present in the Q pocket have been identified as essential, justifying the need of the presence of an aromatic ring or heterocycle in the molecular structure of the inhibitors. The calculated values of binding free energy and the study of protein flexibility allowed the determination of two potential binding modes of the flavonoid in the PDE4A and PDE4B and corroborated with the selectivity observed in vitro. With these informations, analogues that can be obtained by an accessible and versatile synthetic route have been proposed. The compounds have already been obtained from different methodologies that follow the principles of green chemistry. This study may contribute to the obtention of the target compounds and potential new drug prototypes for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease and asthma.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Novas entidades moleculares aprovadas pelo FDA entre 1999 e 2018. ... 22
Figura 2: Ilustração dos três modelos de ligação proteína-ligante: Modelo de chave-fechadura (A), modelo de encaixe induzido (B) e modelo de seletividade conformacional (C). ... 23
Figura 3: Representação da caixa utilizada no cálculo dos descritores moleculares 3D. ... 27
Figura 4: Distribuição de classe de compostos aprovados pelo FDA em 2018. ... 28
Figura 5: Núcleo básico de flavonoides (C6-C3-C6). ... 30
Figura 6: Núcleo básico das subclasses de flavonoides. ... 31
Figura 7: Estrutura da quercetina 3-O-α-L- arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo (BP1). ... 32
Figura 8: Estruturas químicas dos fármacos roflumilast (A) e apremilast (B)... 34
Figura 9: Estrutura básica das moléculas derivadas de naftiridinona (A) e sobreposição de um dos derivados, NPV e quercetina, representados em azul, verde e rosa, respectivamente (B). ... 47
Figura 10: Alinhamento de todas as conformações possíveis para as moléculas utilizadas. ... 48
Figura 11: Gráfico de linearidade do modelo de QSAR 4D construído. Os valores do conjunto de treinamento foram representados em vermelho e o conjunto teste em azul. ... 49
Figura 12: Validações de leave-N-out (A) e y-randomization (B) do modelo construído. ... 50
Figura 13: Descritores intermoleculares utilizados para a construção do modelo de QSAR 4D em relação à molécula mais ativa da série (verde)... 52
Figura 14: Modo de ligação dos inibidores derivados de naftiridinona no sítio ativo da enzima PDE4 (PDB ID: 5K32). ... 53
Figura 15: Descritores LJP1, LJP4 (A) e LH2 (B) em relação a molécula mais ativa (verde) e menos ativa (em laranja). ... 53
Figura 16: Descritores IH2, LJP2 e LJP3 (A) e LH1 e LJP5 (B) em relação a molécula mais ativa (verde) e menos ativa (laranja). ... 54
Figura 17: Descritores LJN1, IH1 e LJP6 (A) e LJN2 (B) em relação a molécula mais ativa (verde) e menos ativa (laranja). ... 55
Figura 18: Principais resultados do estudo de Activity Cliff baseado em similaridade 2D. ... 55 Figura 19: Principal resultado do estudo de Activity Cliff baseado em similaridade 3D. ... 56 Figura 20: Gráfico RMSD de todas as simulações de BP1 em PDE4A e PDE4B. ... 57 Figura 21: Gráfico RMSD das posições de ligação mais promissoras de BP1 em PDE4A e PDE4B ... 59 Figura 22: Interações intermoleculares 3D e 2D da primeira pose de BP1, em laranja, e os resíduos de aminoácido de PDE4A (A e C, respectivamente) e PDE4B (B e D, respectivamente). ... 60 Figura 23: Interações intermoleculares 3D e 2D da quinta pose de BP1, em azul, e os resíduos de aminoácido de PDE4A (A e C, respectivamente) e PDE4B (B e D, respectivamente). ... 61 Figura 24: RMSF de ambas isoformas, PDE4A (A) e PDE4B (B). Modo de interação da quinta pose em PDE4A (C) e PDE4B (D). ... 62 Figura 25: Fragmento 1 (A) e fragmento 2 (B) sobrepostos ao bloco glicosídico de BP1 (verde). ... 64 Figura 26: Derivados triazólicos com atividade inibitória em PDE4... 65 Figura 27: Gráfico RMSD de simulação com G1_1. ... 66 Figura 28: Interações realizadas entre o análogo construído (G1_1), em azul, e os resíduos de aminoácido de PDE4B. ... 67 Figura 29: Estrutura do análogo G1_1 com destaque para as hidroxilas reativas da quercetina... 67 Figura 30: Relação estrutura-atividade da quercetina considerando sua ocupação nos sítios da enzima PDE4B. ... 68 Figura 31: Rota sintética geral para a obtenção de análogos de BP1. ... 69 Figura 32: Perfil cromatográfico da mistura reacional durante a etapa de formação da chalcona derivada do aldeído piperonal (A) e do 3-cloro-benzaldeido (C) e do flavonol derivado de ambos (B e D, respectivamente). As bandas 1, 2, 3 e 4 representam: chalcona, cetona, aldeído e flavonoide, respectivamente ... 72
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Equações utilizadas para o cálculo dos descritores de interação intermolecular ... 37 Tabela 2: Dados espectrais do 2’-hidroxi-4’-metoxiacetofenona ... 43 Tabela 3: Descritores intermoleculares utilizados na construção do modelo de QSAR 4D e suas respectivas coordenadas ... 51 Tabela 4: Valores calculados por MM/PBSA para cada posição de ligação provávela 58
LISTA DE ESPECTROS
Espectro 1: Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) da
2’-hidroxi-4’-metoxiacetofenona ... 70
Espectro 2: Espectro de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) da 2’-hidroxi-4’-metoxiacetofenona ... 71
Espectro 3: Espectro de RMN de 1H (300 MHz, DMSO-d6) do flavonol 1. ... 73
Espectro 4: Espectro de RMN de 13C (75 MHz, DMSO-d6) do flavonol 1. ... 74
Espectro 5: Espectro de RMN de 1H (500 MHz, DMSO-d6) do flavonol 2. ... 75
Espectro 6: Espectro de RMN de 13C (125 MHz, DMSO-d6) do flavonol 2. ... 76
Espectro 7: Espectro de RMN de 1H (500 MHz, DMSO-d6) da chalcona 1. ... 78
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AC Activity Cliff AcOEt Acetato de etila
AMPc 3’,5’-monofosfato cíclico de adenosina
BP1 quercetina 3-O-α-L- arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo CADD Desenho de fármacos assistido por computador (Computer aided drug
design)
CCDA Cromatografia em camada delgada analítica CCD Cromatografia em camada delgada
CMC Carboximetilcelulose
DPOC Doença pulmonar obstrutiva crônica
EM-IE Espectro de massas por impacto de elétrons GMPc 3’,5’-monofosfato cíclico de guanosina
Hz Hertz
IH Interações hidrofóbicas
J Constante de acoplamento químico
LBDD Planejamento de fármacos baseado em ligante (Ligand-based drug design)
LH Ligações de hidrogênio LJ Interações de Lennard Jones LPS Lipopolissacarídeo
MM/PBSA Poisson-Boltzmann surface area
OPS Seleção de preditores ordenados (Ordered predictors selection) P.A Puro para análise
PDE4 Fosfodiesterase 4 PDE4A Fosfodiesterae 4A PDE4B Fosfodiesterase 4B
PLS Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (Partial least squares) ppm Partes por milhão
QQ Interações eletrostáticas
QSAR Relação estrutura-atividade quantitativa (Quantitative Structure-Activity Relationship)
REA Relação estrutura-atividade
RENISUS Relação de Plantas Medicinais de Interesse do Sistema Único de Saúde RMN Ressonância magnética nuclear
RMSD Root-mean-square deviation RMSF Root-mean-square fluctuations SALI Structure-activity landscape index
SBDD Planejamento de fármacos baseado em estrutura (Structure-based drug design)
TMS Tetrametilsilano
TNF Fator de necrose tumoral
1 INTRODUÇÃO ... 18
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 21
2.1 O processo de descobrimento e desenvolvimento de novos fármacos ... 21
2.2 Planejamento racional de fármacos assistido por computador ... 22
2.2.1 Estudos de relação estrutura-atividade e triagem virtual em larga escala ... 24
2.3 Plantas medicinais como fonte de compostos bioativos ... 28
2.3.1 Metabólitos secundários: Flavonoides ... 29
2.3.2 Bryophyllum pinnatum ... 31
2.4 Inibidores da enzima fosfodiesterase 4 ... 32
3 OBJETIVOS ... 35
3.1 Objetivos gerais ... 35
3.2 Objetivos específicos ... 35
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 36
4.1 Estudo relação estrutura-atividade de inibidores de PDE4B ... 36
4.1.1 Construção da biblioteca de compostos ... 36
4.1.2 Cálculo dos descritores de interação intermolecular e filtros aplicados ... 36
4.1.3 Construção dos modelos lineares de QSAR 4D ... 37
4.1.4 Validação interna do modelo linear de QSAR 4D ... 38
4.1.5 Estudos de Activity cliff ... 38
4.2 Investigação do modo de ligação e perfil de seletividade de BP1 ... 39
4.2.1 Preparação do ligante e obtenção dos cristais de PDE4A e PDE4B ... 39
4.2.2 Determinação dos potenciais locais de ligação de BP1 ... 39
4.2.3 Simulações de dinâmica molecular e cálculos de energia livre de ligação... 39
4.3 Planejamento racional e avaliação de análogos de BP1 ... 40
4.3.2 Simulações de dinâmica molecular ... 41
4.4 Síntese dos compostos planejados ... 41
4.4.1 Procedimentos gerais ... 41
4.4.2 Síntese do composto 2’-hidroxi-4’-metoxiacetofenona ... 42
4.4.3 Síntese de chalconas através da reação de condensação de Claisen-Schimdt . 43 4.4.4 Síntese de flavonois através da reação Algar Flynn-Oyamada ... 44
4.4.4.1 Síntese do composto 3- (1,3-benzodioxol-5-il) -7-metoxi-4H-cromen-4-ona (flavonol 1) ... 44
4.4.4.2 Tentativa de síntese do composto 2-(3-clorofenil)-7-metoxi-3-metil-4H-cromen-4-one (flavonol 2) ... 45
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 46
5.1 Parte I: Estudo da relação estrutura-atividade de inibidores de PDE4B ... 47
5.2 Parte II: Investigação do modo de ligação e perfil de seletividade de BP1 ... 57
5.3 Parte III: Planejamento e síntese de análogos de BP1 ... 64
6 CONCLUSÕES ... 80
REFERÊNCIAS ... 81
SEÇÃO DE ESPECTROS ... 91
1 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento da síntese orgânica representou um grande avanço na química medicinal através do descobrimento e desenvolvimento de novos fármacos e moléculas bioativas. Contudo, a realização de sínteses sem um estudo molecular detalhado resultou em crescente número de bibliotecas de compostos com atividade farmacológica não elucidada. Esse fator é em parte responsável pelo aumento de custos e tempo laboratorial atrelados à obtenção de novas substâncias bioativas. Como resultado, é evidente a complexidade envolvida no processo de descobrimento e desenvolvimento de novos candidatos à fármacos (KATIYAR et al., 2012).
Metodologias direcionais, como o desenho de fármacos assistido por computador (CADD, computer aided drug design), passaram então a ser utilizadas com o objetivo de gerar um direcionamento ao químico medicinal (OOMS, 2000). De modo teórico, com base em simulações de interação entre proteína e ligante, é capaz de gerar compostos considerados potencialmente ativos e estruturalmente otimizados (WADOOD et al., 2013). Seu uso é relacionado a vantagens como diminuição de custos, tempo experimental e redução do número de testes biológicos necessários para a completa elucidação de uma atividade terapêutica (MACALINO et al., 2015).
O planejamento racional de novos compostos por meio de CADD utiliza essencialmente a modificação estrutural visando à obtenção de novas moléculas com propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas aperfeiçoadas. Para isso, explora-se principalmente estratégias baseadas em fragmentos de substâncias bioativas, metabólitos secundários ativos, conceitos de bioisosterismo, melhoramento de seletividade e latenciação de fármacos (VIEGAS-JUNIOR et al., 2007). Em geral, a modificação estrutural é realizada a partir de uma molécula já comprovadamente ativa, denominada como protótipo (lead compound) (TALEVI, 2018).
Considerando a obtenção desses compostos, a fitoquímica aplicada à prospecção de produtos naturais ainda é considerada uma fonte importante de moléculas bioativas inéditas. O uso de plantas medicinais possui grande valor na medicina popular pela vasta quantidade de constituintes com potencial atividade terapêutica (SÜNTAR et al., 2018). De acordo com a OMS, cerca de 40% da população faz uso de medicamentos derivados de plantas para o tratamento de diversas doenças (WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO), 2002).
Dentre os metabólitos secundários, a classe dos flavonoides se destaca por apresentar uma grande quantidade de constituintes, versatilidade estrutural e amplo número de atividades terapêuticas relatadas. Dentre as propriedades farmacológicas, é possível citar a atividade antiproliferativa, anti-inflamatória, antiviral, antioxidante e psicoestimulante, bem como a capacidade de inibir a peroxidação lipídica, agregação plaquetária e estimulação da biogênese mitocondrial (AGUIRRE et al., 2011; PANCHE; DIWAN; CHANDRA, 2016; UMESH et al., 2018).
A espécie Bryophyllum pinnatum, presente na Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse do Sistema Único de Saúde – RENISUS (ANVISA, 2009) é um exemplo de planta com grande quantidade de flavonoides em sua constituição química. Seu composto majoritário, identificado como quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo (BP1), vêm sendo amplamente estudado por seu potencial farmacológico (MUZITANO et al., 2006; NASCIMENTO et al., 2013; SOBREIRA et al., 2017). Estudos recentes, realizados em nosso grupo de pesquisa confirmaram que a substância é um potente inibidor seletivo da enzima fosfodiesterase 4B (PDE4B) em comparação com a enzima PDE4A (LOURENÇO et al., 2020).
A enzima PDE4 é encontrada majoritariamente em células do sistema inflamatório e imunológico, sendo dividida em 4 isoformas distintas (A-D) e possui a capacidade de metabolizar de modo seletivo o AMPc. Dentre as isoformas, a inibição da enzima PDE4B é amplamente conhecida por causar efeitos anti-inflamatórios (SPADACCINI et al., 2017). É notório ainda a maior expressão dessa isoforma no tecido pulmonar. Isso faz com que a PDE4B seja considerada como um alvo alternativo e promissor para o tratamento de doenças inflamatórias do sistema respiratório, como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) (LI; ZUO; TANG, 2018).
Vale ressaltar que o uso de inibidores de PDE4 ainda possui dificuldades conhecidas no contexto de sua aplicação terapêutica. A principal delas é relacionada ao número de efeitos adversos, como náuseas e êmese gerados a partir de seu uso (DE AZEVEDO; KÜMMERLE, 2015). Embora o mecanismo responsável por gerar os efeitos adversos ainda não seja completamente elucidado, a explicação mais aceita envolve a baixa seletividade dos inibidores frente às diversas isoformas de PDE4 devido à grande semelhança estrutural entre elas (WANG et al., 2007). Por esse motivo, inibidores reconhecidamente seletivos, como BP1, apresentam vantagens como candidatos a um potencial fármaco.
No entanto, vários metabólitos secundários possuem uma estrutura complexa e apresentam desvantagens que influenciam diretamente na possibilidade de se tornarem futuros fármacos. A enzima lactase-florizina hidrolase, encontrada no intestino delgado de mamíferos, é capaz de hidrolisar uma grande quantidade de flavonois e derivados glicosilados (DAY et al., 2000). Por ser um flavonoide glicosilado, BP1 apresentaria dificuldades na absorção de sua estrutura completa ao ser administrado por via oral, uma vez que sua estrutura poderia ser hidrolisada. Adicionalmente, seu isolamento, mesmo com o uso de técnicas de otimização, apresenta um baixo rendimento. Consequentemente, sua obtenção em grande quantidade se torna um processo laborioso e de alto custo.
De fato, é possível destacar um pequeno declínio nas últimas décadas do uso de produtos naturais para o desenvolvimento de novos fármacos (PATRIDGE et al. 2016). Essa diminuição se deve particularmente ao crescimento da síntese combinatória, planejamento racional de fármacos e processos de triagem de alta produtividade. Combinados, esses fatores levaram a geração de grandes bibliotecas compostas por pequenas moléculas bioativas e, em geral, de reprodução sintética mais viável quando comparada aos produtos naturais (SHEN, 2015).
Entretanto, BP1 não deve ser descartado com um protótipo interessante em razão de suas características bioativas. A partir de sua estrutura, metodologias in silico podem ser aplicadas com o objetivo final de planejar potenciais novos inibidores seletivos de PDE4B. De forma ideal, as moléculas propostas apresentariam uma síntese mais viável e fatores farmacocinéticos aperfeiçoados em relação ao composto original. Adicionalmente, esses estudos podem contribuir com a elaboração de uma relação estrutural responsável pela inibição seletiva da enzima e contribuir para a obtenção de fármacos para o tratamento da DPOC e asma.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 O processo de descobrimento e desenvolvimento de novos fármacos
O descobrimento de novos fármacos visa a identificação de compostos bioativos estruturalmente simples, ou biomoléculas maiores e complexas, potencialmente capazes de serem candidatas a constituir um medicamento (SINHA; VOHORA, 2017). Com o desenvolvimento da medicina e preocupação crescente com a qualidade de vida, indústrias e centros de pesquisa farmacêuticos aumentaram consideravelmente o investimento direcionado a esses estudos. Além disso, o aperfeiçoamento de fármacos ou moléculas com atividade já elucidada também se caracteriza como uma possibilidade para geração de novos medicamentos.
O processo de descoberta de substâncias bioativas inclui as etapas de escolha da doença a ser estudada e seus principais aspectos clínicos, seleção de um alvo molecular e sua validação, além da escolha dos protótipos mais promissores por meio de testes in vitro e in vivo (SINHA; VOHORA, 2017). Esse conjunto de fatores é responsável por orientar a posterior otimização dos compostos visando aumentar sua eficácia e farmacocinética. Somente após essas etapas, o desenvolvimento de fato do potencial fármaco é iniciado, sendo dividido em ensaios pré-clínicos e clínicos (STEINMETZ; SPACK, 2009).
Sendo assim, trata-se de um estudo longo, complexo e oneroso. Desde a seleção da doença a ser investigada até a introdução de um novo medicamento no mercado farmacêutico, estima-se um período de 12 a 15 anos. O tempo necessário é refletido nos custos envolvidos, que podem ultrapassar até US$ 2,6 bilhões (MOHS; GREIG, 2017). Apesar da existência de estudos, o valor real para esse processo não pode ser estimado de forma precisa, uma vez que existe um alto índice de variação (MORGAN et al., 2011).
Além disso, a taxa de insucessos durante esse processo é alta. A maioria dos compostos protótipo não reproduzem sua atividade demonstrada in vitro e in vivo em fase clínica. Estima-se ainda que apenas 1 dentre 8 compostos com resultados clínicos promissores consiga ser aprovado para comercialização, sendo, em maioria, desenvolvidos por indústrias farmacêuticas (MOHS; GREIG, 2017). Os principais motivos para o insucesso durante essa fase são: erros na escolha da dose do fármaco e problemas de eficácia e segurança (SACKS et al., 2014).
Porém, ainda é notório o investimento contínuo da indústria farmacêutica no descobrimento e desenvolvimento de novos fármacos, atribuindo à suas pesquisas avanços biológicos, químicos e biomédicos. Como resultado, é possível observar o recente crescimento no número de novas entidades moleculares aprovadas para o uso terapêutico (DE LA TORRE; ALBERICIO, 2019) (Figura 1). Essa evolução é refletida diretamente em termos econômicos, fazendo com que a indústria farmacêutica seja considerada uma das mais rentáveis em escala global, movimentando bilhões de dólares anualmente.
Figura 1: Novas entidades moleculares aprovadas pelo FDA entre 1999 e 2018. Fonte: Adaptado de DE LA TORRE; ALBERICIO (2019).
2.2 Planejamento racional de fármacos assistido por computador
O processo para o descobrimento e desenvolvimento de um novo fármaco é o objeto principal de estudo da química medicinal. Essa grande área engloba desde o planejamento até a preparação de substâncias biologicamente ativas. Por envolver uma grande quantidade de aspectos e conceitos, a química medicinal é marcada pela interdisciplinaridade (ROBERTA MELO ARAÚJO et al., 2018). Dentre as áreas envolvidas, é importante destacar a proximidade crescente com a farmacologia molecular. As interações intermoleculares entre o composto biologicamente ativo e seu alvo molecular vêm sendo cada vez mais exploradas como uma das formas de explicar a atividade observada experimentalmente.
A compreensão sobre como ocorre o reconhecimento, especificidade e afinidade entre um composto bioativo e seu alvo molecular é considerada crucial para o planejamento de novas entidades químicas bioativas. De modo geral, a atividade de uma molécula depende da complementariedade entre o sítio ativo do alvo farmacológico e a estrutura de seu ligante (VELJKOVIC et al., 2011). Os detalhes moleculares desse processo apresentam alta complexidade e diferem de acordo com o modelo de ligação proteína-ligante utilizado para análise.
Três principais modelos de ligação proteína-ligante são atualmente propostos: modelo de chave-fechadura, modelo de encaixe induzido e modelo de seleção conformacional (Figura 2). O primeiro deles, chave-fechadura, foi sugerido por Emil Fischer em 1894 e propõem que ambos, proteína e ligante, são rígidos e suas interfaces de ligação precisam necessariamente encaixar de modo exato. Como resultado, existiriam ligantes específicos para os receptores moleculares (VELJKOVIC et al., 2011). Experimentos posteriores evidenciaram as limitações desse modelo ao demonstrar interações proteína-ligante inicialmente consideradas incompatíveis. O modelo de encaixe induzido diminuiu o número de limitações ao assumir a existência de uma flexibilidade do sítio de ligação capaz de gerar uma adaptação conformacional ao ligante no momento do reconhecimento molecular. Recentemente, foi proposto o modelo de seleção conformacional que considera a existência de uma vasta quantidade de estados conformacionais proteicos em equilíbrio. O composto bioativo se ligaria de forma seletiva à conformação energeticamente mais favorável (DU et al., 2016).
Figura 2: Ilustração dos três modelos de ligação proteína-ligante: Modelo de chave-fechadura (A), modelo de encaixe induzido (B) e modelo de seletividade conformacional (C).
Fonte: Adaptado de DU et al. (2016).
A complexidade teórica é refletida nas metodologias experimentais capazes de gerar informações acerca das interações intermoleculares. A cristalografia de raio-x, ressonância magnética nuclear (RMN) e microscopia crioeletrônica estão entre os métodos mais utilizados. É importante destacar que a cristalografia de raio-x ainda se
apresenta como a principal forma de estudo das interações intermoleculares. Essa metodologia é capaz de fornecer informações importantes sobre as contribuições entálpicas e entrópicas envolvidas na formação do complexo entre alvo molecular e composto ativo (BRONOWSKA, 2011). Contudo, os métodos citados são considerados laboriosos e demandam alto custo para sua realização.
Dessa forma, o uso de metodologias computacionais aplicadas ao estudo de sistemas biológicos é cada vez mais relevante. Isso se deu através do desenvolvimento e aprimoramento de algoritmos e máquinas capazes de calcular aspectos energéticos além de permitir a visualização tridimensional do complexo proteína-ligante (SCHNEIDER, 2011). Essas metodologias permitem o desenho de novos compostos baseados no estudo de interações intermoleculares com o receptor. Atualmente, esses fatores tornam o planejamento de fármacos assistido por computador (CADD) um dos pilares do descobrimento e desenvolvimento de novos fármacos e auxiliando suas sínteses.
Os estudos de CADD podem ser categorizados essencialmente em duas classificações: planejamento de fármacos baseado em estrutura (SBDD, structure-based
drug design) ou baseado em ligante (LBDD, ligand-based drug design). Na ferramenta
de SBDD, a informação estrutural do receptor molecular é considerada como um pré-requisito, sendo determinada por métodos experimentais ou computacionais. Em situações nas quais essa determinação não é possível, características químicas de ligantes capazes de interagir com o receptor desejado são utilizadas, definindo a ferramenta de LBDD (APAROY; KUMAR REDDY; REDDANNA, 2012).
A escolha entre as ferramentas é realizada de acordo com o foco do estudo e as metodologias computacionais envolvidas. Ambas, SBDD e LBDD, buscam a identificação de um composto protótipo ou o utilizam como estrutura base para os estudos. Essas moléculas possuem necessariamente uma atividade auspiciosa no alvo desejado, mas apresentam desvantagens em relação à aspectos farmacocinéticos e/ou toxicológicos. A partir da estrutura desse composto, estratégias como melhoramento de seletividade, latenciação de fármacos e biososterismo podem ser utilizadas em um processo denominado de otimização de composto protótipo (SHARMA; SHARMA; KUMAR, 2015).
2.2.1 Estudos de relação estrutura-atividade e triagem virtual em larga escala
Dentre as estratégias in silico, a investigação da relação estrutura-atividade de compostos (REA) se destaca por dar suporte à triagem primária de novos protótipos
e permitir a otimização dos já conhecidos (GUHA, 2013). Esse estudo é fundamentado no conceito de similaridade estrutural, no qual moléculas similares provavelmente apresentam atividades biológicas também semelhantes (MARTIN; KOFRON; TRAPHAGEN, 2002). A partir desse conceito, a REA é capaz de determinar grupamentos químicos fundamentais para a manutenção e aumento da atividade biológica.
Um modo interessante de obtenção de informações acerca da REA se dá através da análise de um par ou grupo de moléculas com pequenas diferenças estruturais e grandes diferenças em relação à potência. Esses pares ou grupos são denominados de
Activity Cliffs (AC) (STUMPFE et al., 2014). De modo geral, a análise correta de um
AC consegue determinar regiões do esqueleto molecular com maior potencial para substituições. A definição de um AC válido deve ser criteriosa e depende principalmente do cálculo de similaridade entre duas moléculas e a definição de um parâmetro capaz de determinar o que seria considerado como uma diferença significativa de atividade (BAJORATH, 2017).
A forma do cálculo de similaridade entre duas moléculas depende da dimensão espacial escolhida como forma de comparação entre as estruturas. A similaridade pode ser obtida através de cálculos 2D ou 3D. A comparação entre características moleculares, conhecidas por fingerprints, em plano bidimensional caracteriza o cálculo de similaridade 2D. Esse tipo de cálculo pode ser realizado por métodos como Tanimoto, Cosine e Hamming, sendo considerado rápido e, portanto, de baixo custo computacional (WILLETT, 2006). Já a comparação entre a topologia tridimensional de duas moléculas distintas é responsável pela geração da similaridade 3D. Essa metodologia é amplamente utilizada por gerar um alto número de informações (MAGGIORA et al., 2014). As informações 2D e 3D podem se complementar, de modo que um estudo com ambas torne o estabelecimento de uma relação estrutura-atividade mais preciso.
A diferença considerada relevante entre as potências das atividades biológicas é comumente determinada utilizando a metodologia de Structure-activity
Landscape Index (SALI). O valor de SALI busca gerar informações resultantes da
relação entre a estrutura das moléculas comparadas e suas respectivas atividades biológicas (GUHA, 2012). Seu uso é realizado principalmente para relações do tipo proteína-ligante e o valor é calculado de acordo com a equação abaixo (1).
(1) Na equação, A e B representam valores de atividade biológica de duas moléculas distintas e Sim é referente à similaridade entre esses mesmos compostos. Moléculas que apresentam similaridade muito próximas ( 1), fazem com que o valor calculado para SALI tenda ao infinito. Nesses casos, deverá haver um reajuste para os maiores valores considerados mais coerentes (GUHA; VAN DRIE, 2008).
Entretanto, o estudo da determinação de uma REA é considerado apenas qualitativo e gera numerosas alterações moleculares possíveis no esqueleto dos compostos estudados. O resultado é a criação de uma grande quantidade de análogos potencialmente ativos, diminuindo a capacidade de direcionamento objetivada por esse tipo de metodologia. Visando solucionar isso, as informações de atividade biológica podem ser utilizadas também para a construção de modelos com características quantitativas. Esses modelos são capazes de gerar a previsão da atividade biológica de compostos ainda não sintetizados, e caracterizam a metodologia denominada como
Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR).
Para isso, é necessário que se construa uma correlação estatisticamente relevante entre as características estruturais específicas dos compostos e suas respectivas atividades biológicas (NEVES et al., 2018). A aprendizagem de máquina é a ferramenta mais utilizada para esse propósito e usa as informações fornecidas ao modelo para prever as atividades de moléculas planejadas e ainda não sintetizadas. Essa capacidade torna o QSAR amplamente utilizado em grupos de pesquisa e indústrias farmacêuticas visando a síntese direcional de novos compostos bioativos (CHERKASOV et al., 2014).
A informação fundamental para a geração de um modelo de QSAR é fornecida por descritores moleculares que representam propriedades físico-químicas ou estruturais de uma determinada molécula. Podem ainda representar diferentes tipos de interação intermolecular. A escolha dos descritores a serem utilizados depende da análise estrutural a ser feita e é responsável por categorizar o tipo de modelo gerado. Os modelos de QSAR utilizam, com maior frequência, descritores que podem ser classificados em 1D a 3D (CHERKASOV et al., 2014). Descritores 1D e 2D descrevem propriedades físico-químicas e características estruturais básicas como massa molecular, logP, número de átomos e número de ligações. Já os descritores 3D correlacionam a atividade biológica a campos de diferentes tipos de interação intermoleculares
organizados em uma caixa de delimitação que envolve as moléculas, em geral, alinhadas (XUE; BAJORATH, 2000) (Figura 3). É importante destacar que outros tipos de descritores já foram desenvolvidos, gerando modelos de QSAR classificados como 4D-6D. Esses descritores apresentam menor utilização em razão do alto custo computacional envolvido (VERMA; KHEDKAR; COUTINHO, 2010).
Figura 3: Representação da caixa utilizada no cálculo dos descritores moleculares 3D. Fonte: MARTINS et al. (2009).
Após a construção, metodologias de validação são consideradas fundamentais para garantir a confiabilidade e qualidade do modelo gerado. As estratégias envolvidas nesse processo se dividem em internas e externas. A validação externa é realizada a partir da previsão de atividade biológica de moléculas não utilizadas na construção do modelo e posterior comparação dos resultados previstos com os experimentais. Já a validação interna pode avaliar fatores como robustez e influência da atividade biológica na capacidade preditiva, através metodologias como leave-N-out e y-randomization (VEERASAMY et al., 2011).
Os modelos de QSAR podem ser aplicados em conjunto com outras ferramentas, como a triagem virtual em larga escala (PÉREZ et al., 2016). Essa metodologia utiliza grandes bibliotecas com o objetivo de identificar um composto capaz de interagir com determinado alvo molecular. Estudos anteriores demonstraram importantes contribuições da triagem virtual que passou a ser considerada um dos grandes avanços da química computacional aplicada aos sistemas biológicos (XU; HUANG; ZOU, 2018).
Assim como o planejamento racional de fármacos, a triagem virtual pode ter duas classificações: baseada em estrutura ou baseada em ligante (LAVECCHIA;
GIOVANNI, 2013). Ambas as classificações ainda são subdividas em metodologias clássicas ou invertidas de acordo com o objetivo final do estudo. Dentre elas, as metodologias clássicas são as mais utilizadas uma vez que podem auxiliar de modo direto o processo de planejamento racional de novos fármacos (CHENG et al., 2012).
Focando nessa subdivisão, a triagem virtual clássica baseada em estrutura envolve a busca por ligantes que melhor interagem com um determinado receptor. É utilizada nos casos em que a informação estrutural do alvo molecular é conhecida e as análises são realizadas através de simulações de docking molecular em larga escala. Já a triagem virtual clássica baseada em ligante foca particularmente na análise de similaridade, em geral 3D, entre compostos (LAVECCHIA; GIOVANNI, 2013). Ambas as metodologias possuem como semelhança a utilização de grandes bibliotecas compostas por moléculas bioativas.
2.3 Plantas medicinais como fonte de compostos bioativos
Historicamente, a fitoquímica é considerada uma ferramenta importante na geração de bibliotecas de compostos farmacologicamente ativos. Os produtos naturais e derivados de plantas possuem ampla importância no processo de descobrimento e desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de diversas doenças. Esse fato é comprovado com base na porcentagem representativa do total de novas entidades moleculares aprovadas recentemente. Além disso, é responsável por cerca de 50% de todos os fármacos aprovados em uso clínico. (PATRIDGE et al., 2016) (Figura 4).
Figura 4: Distribuição de classe de compostos aprovados pelo FDA em 2018. Fonte: Adaptado de DE LA TORRE; ALBERICIO (2019).
Essa importância se deve ao crescente interesse envolvendo plantas medicinais nativas de diferentes biomas. Contudo, a elucidação do perfil químico e farmacológico de fontes naturais ainda deve ser fortemente incentivada. A investigação sistemática da presença de compostos de interesse terapêutico é estimada em apenas 5 a 15%. Essa porcentagem demonstra que a biodiversidade química dos biomas é ainda pouco explorada como fonte de potenciais protótipos (DE LUCA et al., 2012; SIOMARA DA CRUZ MONTEIRO, 2017).
O potencial da bioprospecção é ainda mais evidenciado em países com grande biodiversidade conhecida. O Brasil possui cerca de 15 a 20% da biodiversidade mundial, sendo considerado o país mais rico em termos de variedade de plantas conhecidas (BARREIRO; BOLZANI, 2009). Seus principais biomas são amplamente explorados e utilizados pela população, o que gera um vasto conhecimento tradicional em relação às propriedades terapêuticas das espécies existentes. Muitos estudos envolvendo plantas nativas brasileiras são guiados pelos conceitos etnobotânicos e etnofarmacológicos. A aplicação dessas estratégias pode facilitar a descoberta de novos compostos bioativos, uma vez que, ao utilizar conhecimentos tradicionais, diminui o tempo demandado para a triagem farmacológica e toxicológica (LEITÃO; DE OLIVEIRA, 2014).
2.3.1 Metabólitos secundários: Flavonoides
Os metabólitos secundários podem ser produzidas e armazenadas em tecidos e estruturas específicas como vacúolos, glândulas especializadas e tricomas. A produção desses compostos é afetada de forma direta por fatores ambientais, como mudanças climáticas ou presença de patógenos. Essa influência é explicada pela importante função que os metabólitos secundários exercem na interação entre as plantas e o meio ambiente, sendo responsáveis por vários mecanismos de proteção (GONÇALVES; ROMANO, 2018). Além disso, são amplamente utilizados na medicina por apresentarem grande quantidade de atividades terapêuticas comprovadas (KESSLER; KALSKE, 2018).
Os flavonoides formam um dos grupos considerados mais importantes e diversificados de metabólitos secundários, sendo marcados por sua ampla distribuição nas plantas e, em geral, baixa toxicidade (MACHADO et al., 2008; SAXENA; SAXENA; PRADHAN, 2012). Dentre as principais atividades farmacológicas relacionadas a essas moléculas, é possível destacar as atividades anti-inflamatória,
antimicrobiana, antiproliferativa e antioxidante (PANCHE; DIWAN; CHANDRA, 2016; PRITHVIRAJ, 2018).
Quanto à sua estrutura básica, os flavonoides apresentam um núcleo fundamental, denominado de flavilium, contendo quinze átomos de carbono e arranjados em três anéis (C6-C3-C6). Dentre eles, existem dois aneis fenólicos (anéis A e C) e um pirano (cadeia heterocíclica B) acoplado ao anel A (PRITHVIRAJ, 2018) (Figura 5). As modificações no núcleo básico como hidrogenação, hidroxilações, metilações e glicosilações são diretamente relacionadas a grande quantidade de atividades terapêuticas descritas para os flavonoides (MACHADO, 2006).
Figura 5: Núcleo básico de flavonoides (C6-C3-C6). Fonte: PRITHVIRAJ (2018).
Os flavonoides armazenados nos vacúolos das células vegetais possuem comumente uma ou mais moléculas de monossacarídeo ligadas ao seu núcleo básico. Esses compostos passam a ser denominadas de glicosídeos e podem conter uma ligação do tipo O- ou C- glicosídica dependendo do átomo ao qual o monossacarídeo é ligado. As posições 3 e 7 do núcleo básico dos flavonoides são as mais comuns para a formação de glicosídeos, sendo a posição 3 encontrada com maior frequência. As principais moléculas de monossacarídeo observadas são: D-glicose, D-galactose, ramnose, L-arabinose e D-xilose (KOČEVAR; GLAVAČ; KREFT, 2007).
Outras modificações na estrutura do núcleo básico dos flavonoides também podem ser observadas. A mais frequente se trata de mudanças no grau de insaturação e oxidação do anel B. Diferenças em relação aos substituintes encontrados nesse anel, principalmente presença de hidroxilas, também são consideradas comuns. Essas modificações são responsáveis por gerar uma grande quantidade de estruturas distintas provenientes do mesmo núcleo básico. Sendo assim, o grupo dos flavonoides é dividido nas seguintes subclasses: flavona, flavonol, isoflavona, flavanona, flavononol, antocianina, aurona e chalconas (DE RIJKE et al., 2006; PANCHE; DIWAN; CHANDRA, 2016) (Figura 6).
Figura 6: Núcleo básico das subclasses de flavonoides. Fonte: Adaptado de DE RIJKE et al. (2016).
2.3.2 Bryophyllum pinnatum
A espécie Bryophyllum pinnatum (Lam) Pers., popularmente conhecida como saião ou coirama, é amplamente distribuída nas regiões do Brasil, com presença predominante no bioma da Caatinga. Possui grande importância terapêutica, sendo utilizada pela população para o tratamento de gastrite, infecções microbianas, diabetes, hipertensão e, principalmente, condições inflamatórias (FERNANDES et al., 2019). Atrelado a seu amplo uso popular, a inserção da espécie na RENISUS aumenta a necessidade e relevância de estudos químicos e farmacológicos envolvendo a planta (ANVISA, 2009).
As folhas de B. pinnatum representam a parte da planta mais utilizada em estudos químicos. Investigações de seu extrato, demonstraram a presença de compostos pertencentes a várias classes de metabólitos secundários como: bufadenolídeos, derivados fenantrênicos, esteroides, flavonoides, ácidos fenólicos e saponinas. Os compostos classificados como esteroides, terpenos e, principalmente, flavonoides são identificados e isolados com maior frequência das folhas da espécie (FERNANDES et al., 2019; MUZITANO et al., 2006).
Os flavonoides comumente identificados nas folhas são glicosídeos derivados dos núcleos de quercetina, patuletina ou canferol (FERNANDES et al., 2016). O primeiro glicosídeo isolado a partir do extrato de B. pinnatum, quercetina 3-O-α-L-
arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo (Figura 7), é considerado o composto majoritário da espécie. Atrelado a esse fator, o amplo potencial terapêutico demonstrado o torna um promissor marcador químico e farmacológico do extrato de B. pinnatum (NASCIMENTO et al., 2018). Estudos recentes geraram um importante avanço no conhecimento do mecanismo de ação do composto. Foi confirmado uma atividade promissora de inibição da enzima PDE4B. Além disso, o composto também se mostrou seletivo para essa isoforma quando os resultados são comparados ao teste de inibição em PDE4A (LOURENÇO et al., 2020).
Esses resultados também explicam parcialmente algumas atividades observadas através uso do extrato de B. pinnatum. Destaca-se principalmente a relação com as atividades anti-inflamatória e antiasmática já relatadas (CRUZ et al., 2012). Adicionalmente, o flavonoide glicosilado também pode ser considerado um potencial protótipo em razão de sua alta capacidade de inibição da enzima.
Figura 7: Estrutura da quercetina 3-O-α-L- arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo (BP1). Fonte: Autoria própria.
2.4 Inibidores da enzima fosfodiesterase 4
As fosfodiesterases (PDEs) foram descritas pela primeira vez logo após a descoberta, em 1962, do 3’,5’-monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) (DE AZEVEDO; KÜMMERLE, 2015). Essas enzimas são capazes de catalisar a hidrólise seletiva do AMPc e do 3’,5’-monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) através da quebra das ligações fosfodiéster. Ambos, AMPc e GMPc, atuam como mensageiros secundários em inúmeras vias de sinalização, sendo capazes de converter e amplificar sinais celulares por meio da ativação de proteínas quinases (MAURICE et al., 2014; YAN et al., 2016). Como resultado, as PDEs desempenham um papel fundamental na
regulação indireta de vias de biossinalização do metabolismo intracelular, o que as tornam alvos farmacológicos promissores (DE AZEVEDO; KÜMMERLE, 2015).
Após a identificação da classe de PDEs, constatou-se a existência de diferentes isoformas que demonstram propriedades cromatográficas, cinéticas e farmacológicas distintas (BOSWELL-SMITH; SPINA; PAGE, 2006). Atualmente, existem 11 famílias relatadas (PDE1-PDE11), podendo apresentar de 1 a 4 genes representados por letras (A-D). Como resultado, são originados aproximadamente 20 genes em mamíferos capazes de decodificar até 50 proteínas diferentes (DE AZEVEDO; KÜMMERLE, 2015). Contudo, a ampla variedade proteica não é considerada uma desvantagem em termos de potencial farmacológico. Essa conclusão se baseia no fato de que cada família possui diferenças marcantes na distribuição tecidual e na atividade enzimática relacionada (BENDER; BEAVO, 2006).
Dentre as famílias de PDE, a PDE4 tem demonstrado ser um foco importante da indústria farmacêutica nas últimas décadas (LI; ZUO; TANG, 2018). Essa enzima, dividida em 4 isoformas diferentes (A-D), hidrolisa de modo seletivo o AMPc e é encontrada em grande parte das células dos sistemas inflamatório e imunológico. Em específico, a isoforma PDE4B possui um papel central em processos inflamatórios, sendo predominantemente distribuída no tecido pulmonar e encontrada em monócitos e neutrófilos (AZAM; TRIPURANENI, 2014; YANG et al., 2017). A participação nesses processos é evidenciada durante a inibição da enzima que resulta no aumento dos níveis de AMPc e, consequentemente, redução da produção de citocinas pró-inflamatórias (LI; ZUO; TANG, 2018).
Considerando o principal tecido de expressão e seus efeitos biológicos, a isoforma PDE4B é considerada um alvo alternativo e promissor para tratamento de distúrbios pulmonares como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Os inibidores de PDE4B são capazes de reduzir substancialmente a inflamação do trato respiratório e promover o relaxamento dos músculos lisos pulmonares. Dentre os principais inibidores desenvolvidos, o roflumilast e apremilast (Figura 8) são exemplos de fármacos aprovados pelo FDA para comercialização (GAVALDÀ; ROBERTS, 2013; LI; ZUO; TANG, 2018).
Figura 8: Estruturas químicas dos fármacos roflumilast (A) e apremilast (B). Fonte: Autoria própria.
Embora sejam muito estudados, os inibidores de PDE4 ainda possuem uma grande quantidade de efeitos adversos relacionados ao seu uso (SPINA, 2008). Os mecanismos responsáveis pelo aparecimento dos efeitos adversos vêm sendo amplamente investigados como forma de auxiliar o desenvolvimento de compostos mais seguros. Atualmente, existem três principais hipóteses sugeridas. A primeira delas propõe uma atuação dos inibidores nas isoformas de PDE4 distribuídas em maior quantidade em outros tecidos, especialmente no sistema nervoso central e gastrointestinal. Outra hipótese sugerida, envolve uma possível ligação dos inibidores no sítio de alta afinidade conhecido como sítio de ligação de alta afinidade do rolipram. A última e mais aceita, propõe a não seletividade frente as quatro isoformas de PDE4 dada a semelhança estrutural entre elas (DE AZEVEDO; KÜMMERLE, 2015; ROBERTS et al., 2018). A aceitação dessa hipótese se baseia no fato de que as estruturas são diferenciadas apenas nas regiões N-terminais, gerando uma grande conservação dos resíduos de aminoácidos presentes no sítio ativo (CHEUNG et al., 2007).
Dessa forma, a síntese de novas moléculas ativas e mais seletivas frente as diferentes isoformas de PDE4 é amplamente incentivada. Preferencialmente, os compostos precisam ser obtidos por meio de rotas sintéticas acessíveis e que permitam sua obtenção em larga escala. Além disso, é crescente a preocupação com a utilização de metodologias que sigam os princípios da química verde e se baseiam na minimização ou não utilização de solventes tóxicos para processos ou análises químicas assim como a não geração de resíduos (DE MARCO et al. 2019). Como resultado, faz-se necessário mais estudos que tenham como objetivo o planejamento de novos inibidores seletivos de PDE4 e a elaboração de rotas sintéticas seguindo os indicadores mencionados.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivos gerais
Planejar novos análogos de quercetina
3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosideo potencialmente ativos e seletivos para a enzima PDE4B através
de metodologias in silico e avaliar metodologias de síntese que tornem possível a obtenção dos compostos planejados.
3.2 Objetivos específicos
a) Elaborar uma relação estrutura-atividade e modelo de QSAR 4D com uma biblioteca de inibidores conhecidos da enzima PDE4B;
b) Investigar possíveis modo de interação do protótipo BP1 por meio de análises de dinâmica molecular e cálculos de energia livre de ligação;
c) Propor hipóteses responsáveis pelo perfil de seletividade demonstrado por BP1; d) Planejar análogos por meio de CADD considerando BP1 como protótipo;
e) Avaliar diferentes metodologias de síntese que permitam a obtenção dos compostos planejados.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Estudo relação estrutura-atividade de inibidores de PDE4B
Todos os inibidores de PDE4B utilizados no estudo da relação estrutura-atividade são derivados do núcleo de naftiridinona, sendo portanto, análogos entre si. Adicionalmente, todos foram testados experimentalmente seguindo o mesmo protocolo de ensaio de inibição enzimática.
4.1.1 Construção da biblioteca de compostos
A biblioteca de inibidores de PDE4B foi construída a partir dos compostos sintetizados por ROBERTS e colaboradores (2018). As estruturas em 3D de todas as moléculas foram obtidas utilizando o programa MarvinSketch 16.9.5 (ChemAxon Ltd.). As cargas provenientes de ionização e/ou protonação foram definidas considerando o pH de 7,4, de modo a seguir as condições do ensaio biológico. Após a construção, cada modelo 3D foi quimicamente conferido através do software Avogadro (HANWELL et al., 2012). Por fim, as estruturas químicas foram otimizadas pelo método semiempírico PM7 com o modelo de solvatação implícito COSMO (KLAMT; SCHÜÜRMANN, 1993) implementado no programa MOPAC2016 (STEWART, 2016). Os valores de atividade expressos em IC50 foram convertidos para pIC50 com o objetivo de garantir
uma linearidade numérica necessária para as etapas posteriores. É importante destacar que dois compostos foram excluídos do estudo de QSAR por não apresentarem centro estereogênico quirotópico (MISLOW; SIEGEL, 1984) definido após a obtenção sintética, totalizando 54 moléculas.
4.1.2 Cálculo dos descritores de interação intermolecular e filtros aplicados
Todas as conformações possíveis de cada composto foram geradas de forma estocástica a partir do programa Balloon (PURANEN; VAINIO; JOHNSON, 2010). As conformações foram alinhadas a partir da sobreposição de átomos em comum presentes no núcleo básico, utilizando o algoritmo confrms presente no pacote GROMACS simulation version 5 (VAN DER SPOEL et al., 2005). O cálculo dos descritores 3D foi baseado em um método previamente descrito com uso de uma caixa de resolução de 1 Å (PATIL et al., 2018). Foram calculados os seguintes descritores de interação intermolecular: Lennard Jones (LJ), interações eletrostáticas (QQ), ligações de hidrogênio (LH) e interações hidrofóbicas (IF) (Tabela 1).
Tabela 1: Equações utilizadas para o cálculo dos descritores de interação intermolecular
Descritor (Abreviação) Equação
Lennard Jones (LJ)
Interações eletrostáticas (QQ)
Ligações de hidrogênio (LH) e interações hidrofóbicas (IF)
Fonte: Dados experimentais
Com o objetivo de reduzir o número de descritores calculados, foram deletados aqueles que apresentaram intercorrelação igual a 0,98 garantindo assim apenas o uso de descritores com alta correlação com a variável dependente y (atividade biológica). Além disso, descritores localizados de modo muito diferente em relação às moléculas alinhadas também foram deletados. Para isso, foi considerando uma variação de 0,02 (MIRANDA et al., 2019).
4.1.3 Construção dos modelos lineares de QSAR 4D
A matriz contendo os descritores calculados foi submetida a seleção de preditores ordenados (OPS, ordered predictors selections). Essa metodologia foi utilizada para a redução do número total de descritores e seleção daqueles considerados mais relacionados com a atividade biológica. Após a seleção por OPS, o modelo de QSAR 4D linear foi construído a partir do método de Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS, Partial Least Squares) implementado no software QSAR modeling (MARTINS; FERREIRA, 2013). O modelo linear considerado mais promissor foi selecionado com base nos valores de coeficiente de R2 e Q2LOO.
Visando a construção do modelo, os compostos foram divididos em dois conjuntos distintos: treinamento (70%) e teste (30%). As moléculas pertencentes ao conjunto de treinamento foram utilizadas para a elaboração do modelo e as do conjunto teste para a validação externa. A divisão foi realizada utilizando a diferença de valores de atividade biológica, de modo a existir uma variação considerável em ambos os conjuntos. Os valores de Q2ext, R2 e Q2LOO foram calculados de acordo com a equação 2.
Apenas os modelos com valores de R2 > Q2
LOO e maiores que 0,70 foram considerados
promissores (KIRALJ; FERREIRA, 2009).
(2) Na equação 2, yexp representa o valor da atividade biológica experimental e
ypred o valor predito pelo modelo.
4.1.4 Validação interna do modelo linear de QSAR 4D
A validação interna dos modelos obtidos foi realizada utilizando os métodos conhecidos como y-randomization e Leave-N-out. Respectivamente, objetivou-se avaliar a robustez e influência da atividade biológica no modelo construído. Na metodologia de y-randomization foram realizadas 50 tentativas de reconstrução do modelo obtido com valores de atividade biológica randomicamente embaralhadas. Esses resultados foram plotados como R2 vs Q2LOO e o valor de ambos para o modelo gerado
com as atividades reais foi considerado como parâmetro. Idealmente, os modelos reconstruídos com as atividades embaralhadas devem apresentar valores de R2 e Q2LOO
claramente separados e inferiores aos obtidos para o modelo construído com base nas atividade biológicas reais. Já a análise de robustez foi realizada a partir da remoção de até 50% do número total de moléculas do conjunto de treinamento e posterior comparação dos valores de Q2LNO e Q2LOO. Os modelos que apresentaram uma oscilação
menor que 0,1 para 25% de amostras removidas foram considerados mais robustos. 4.1.5 Estudos de Activity cliff
Estudos de Activity Cliff 2D e 3D foram realizados para uma melhor interpretação da influência dos substituintes na atividade biológica das moléculas. A similaridade 2D foi computada a partir do programa Openbabel e calculada utilizando o método de Tanimoto (BENDER; GLEN, 2004). Já a similaridade 3D foi realizada com base em um alinhamento por meio do algoritmo pharmACOphore (KORB et al., 2010) seguido do cálculo realizado pelo algoritmo ShaeEP (VAINIO; PURANEN; JOHNSON, 2009). Em ambas as análises, a relação entre a atividade biológica e a similaridade de um par de moléculas foi determinado pelo fator de Landscape Activity
