RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO

Biotecnologias da Reprodução Animal

ALINE CAMPELO CENTENO

Pelotas, 10 de Janeiro de 2005

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO

Biotecnologias da Reprodução Animal

ALINE CAMPELO CENTENO

Relatório apresentado como requisito de complementação curricular para graduação em

Medicina Veterinária na Universidade Federal de Pelotas.

Pelotas, 10 de Janeiro de 2005

IDENTIFICAÇÃO DO ESTÁGIO

Nome da Estagiária: Aline Campelo Centeno

Área do Estagio: Biotecnologias da Reprodução Animal

Local: Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem, localizado no Centro de Ciências Agroveterinárias - CAV, da Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC

Endereço: Av. Luiz de Camões, 2090, Lages-SC Orientador do Estágio: Alceu Mezzalira

Orientador Acadêmico: Marcio Nunes Corrêa Período do Estágio: 04/10/04 a 10/12/04 Carga horária: 50 horas semanais

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, não poderia deixar de agradecer a Deus, pelo dom da vida e por ter me concedido saúde para chegar até aqui.

Aos meus pais, Rita e Valmir, que sempre foram o meu apoio nas horas mais difíceis e os maiores aplausos nas vitórias, nunca mediram esforços e fizeram tudo que estava ao alcance para que eu realizasse o meu maior sonho, ser uma Médica Veterinária. Não podendo esquecer de pedir desculpa pela irritação constante na época das provas finais e agradecer, do fundo do coração, todo tempo dedicado a mim, muitas vezes esquecendo dos seus próprios sonhos para que eu pudesse realizar os meus. Sem dúvida, eles são os melhores pais do mundo.

Aos meus irmãos, Rogério e Fábio, que também não mediram esforços para a realização do meu maior sonho.

As minhas cunhadas, Simone e Maria Helena, que sempre estiveram dispostas a ajudar.

Aos meus amigos e, quase irmãos, Jaque e Cássio, pela grande amizade que cultivamos durante a faculdade e que, com certeza será eterna. Vocês moram no meu coração, e se por acaso, a vida profissional nos levar para caminhos diferentes, podem ter certeza que jamais esquecerei de vocês e quando forem profissionais respeitados pela competência, que sempre demonstraram, estarei na primeira fila, aplaudindo os meus “irmãos” em pé.

Aos meus colegas de faculdade, com quais, durante esses cinco anos, passei mais tempo do que com minha família, obrigada pela companhia e amizade.

A minha amiga Anna, pela força e estímulo e também pela compreensão de muitas vezes, não podermos estar juntas, pois os estudos eram mais importantes.

As amigas ”Lu” e “Angel”, que mesmo um pouco distantes, pela tumultuada vida de universitária, sempre torceram pelo meu sucesso.

Ao meu gatinho, Rafael, pelo carinho e compreensão, por agüentar minha irritação na época das provas e por me ajudar na realização deste relatório, pois sem ele, meu relatório não seria o mesmo.

Ao meu orientador do estágio, Alceu, pela atenção dedicada e pela transmissão de conhecimentos.

Aos meus colegas de estágio, Joana, Fernanda, Kelyn, Dennys, Rodrigo, Fabiano, Márcio, Diego, Marcos, Tiago e Júnior pelo companheirismo e ensinamentos repassados.

Ao meu orientador acadêmico, Marcio, que mesmo na correria, sempre achou tempo para responder as minhas dúvidas e me orientar da melhor maneira possível.

A minha ex-orientadora, Ligia, pelo apoio e serenidade nas horas em que precisei.

A minha nova família, Elisio, Cleide e Emely, que me acolheram com muito amor e carinho. Sem eles eu não teria chegado aqui, eles foram fundamentais na realização do meu estágio, me dando todo o apoio e carinho de uma família. Os guardarei pra sempre no meu coração.

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS...vii

LISTA DE FIGURAS...viii

LISTA DE QUADROS...ix

1) INTRODUÇÃO...01

2) DESENVOLVIMENTO...04

2.1) PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES...04

2.1.1) Introdução...04

2.1.2) Etapas da produção in vitro de embriões...06

2.1.2.1) Coleta dos ovócitos...06

2.1.2.2) Maturação in vitro...10

2.1.2.3) Separação e capacitação espermática...14

2.1.2.4) Fecundação in vitro...18

2.1.2.5) Desnudamento...19

2.1.2.6) Cultivo in vitro...20

2.1.2.7) Avaliação da clivagem...22

2.1.2.8) Avaliação embrionária...23

2.2) OPU (OVUM PICK-UP)...27

2.3) VITRIFICAÇÃO...30

2.3.1) Protocolo para vitrificação de ovócitos...31

2.3.2) Protocolo para vitrificação de embriões...32

2.4) PROCEDIMENTOS DE SEGURANÇA E HIGIENE ADOTADOS NO LABORATÓRIO DE REPRODUÇÃO ANIMAL PROF. ASSIS ROBERTO

DE BEM...36

2.5) SUPEROVULAÇÃO EM CAMUNDONGAS...43

2.5.1) Diluição dos hormônios para superovulação em camundongas...44

2.5.2) Coleta de embriões de camundongas...45

3.0) COMENTÁRIOS SOBRE O ESTÁGIO...46

4.0) CONCLUSÃO...47

5.0) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...48

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Atividades desenvolvidas durante o Estágio Curricular, no Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem...03 TABELA 2 - Rotinas de PIV realizadas durante o estágio no Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem...05 TABELA 3 - Desenvolvimento de embriões produzidos in vitro

depois da maturação de COCs com diferente número de capas de células da granulosa...11 TABELA 4 - Desenvolvimento de embriões produzidos in vitro, utilizando

dois meios de cultivo...26 TABELA 5 - Resultados da OPU realizada durante o estágio...29 TABELA 6 - Rotinas de vitrificação acompanhadas durante o estágio...35 TABELA 7 - Resultados do reaquecimento de embriões vitrificados da rotina 2...35 TABELA 8 - Embriões de camundongas coletados durante o período de

estágio...45

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de

Bem...02

FIGURA 2 - Punção folicular utilizando scalp...08

FIGURA 3 - Tubos prontos para Swim-up...15

FIGURA 4 - Embriões clivados...23

FIGURA 5 - Aparelho produtor de vácuo utilizado no processo de vitrificação...34

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 - Meio de maturação utilizado no Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem...11 QUADRO 2 - Meio de migração (TALP Sperm), para Swim-up...16 QUADRO 3 - Meio de fecundação (TALP Fert)...18 QUADRO 4 - Diluição da heparina, adicionada ao meio de fecundação,

para capacitação dos espermatozóides...19 QUADRO 5 - Meio utilizado para cultivo de embriões...22 QUADRO 6 - Protocolo para superovulação em camundongas...44

1) INTRODUÇÃO

O Estágio Curricular foi realizado no período de 4 de Outubro a 10 de Dezembro de 2004, junto ao Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem, localizado no Centro de Ciências Agroveterinárias (CAV), da Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), na cidade de Lages-SC.

Totalizando 500 horas.

Em 1977, com o reconhecimento do curso de Medicina Veterinária, pelo Decreto Federal 79.851, começaram a surgir as primeiras iniciativas de pesquisa e extensão, onde se destacou a atuação do Dr. Assis Roberto De Bem, o qual iniciou trabalhos pioneiros em coleta e transferência de embriões bovinos no Estado de Santa Catarina, inicialmente pelo método cirúrgico. Nos anos 90, o Laboratório de Reprodução Animal passou a adotar uma linha de pesquisa voltada para a criopreservação. Os trabalhos iniciais realizados com embriões de camundongos foram extrapolados para bovinos, resultando em trabalhos pioneiros no país na criopreservação de embriões bovinos pelo método ultra- rápido. Em 1999, após a adequação do Laboratório, foram iniciados os trabalhos com produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, obtendo-se o nascimento do primeiro produto em outubro do mesmo ano. Desde então, a orientação da pesquisa foi voltada, principalmente, para a criopreservação de ovócitos bovinos por vitrificação. Resultados ainda mais promissores foram alcançados com a vitrificação de ovócitos imaturos em OPS (palhetas espichadas), com o

nascimento de Victra, a primeira terneira da América do Sul nascida de embrião derivado de ovócito imaturo vitrificado. Na seqüência do trabalho, obteve-se o nascimento de Glacial e Nitro, os primeiros terneiros do mundo obtidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos também vitrificados. A figura 1 demonstra a vista externa do Laboratório.

FIGURA 1 – Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem.

Durante o período de estágio no Laboratório de Reprodução Animal Prof.

Assis Roberto De Bem, foram desenvolvidas atividades como lavagem e esterilização de materiais utilizados nas rotinas do Laboratório, preparo de meios, produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, OPU (Ovum pick-up), criopreservação de embriões bovinos, superovulação em camundongas, coleta de embriões de camundongas.

As atividades desenvolvidas estão relacionadas na Tabela 1.

TABELA 1 - Atividades desenvolvidas durante o estágio curricular, no Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem

Atividade Nº

Lavagem e esterilização de materiais *

Preparo de meios 54

Punções 17

Produção in vitro de embriões 17

OPU 24

Vitrificação de ovócitos 4

Vitrificação de embriões 6

Superovulação em camundongas 2

Coleta de embriões de camundongas 2

TOTAL 126

* Realizadas diariamente.

2) DESENVOLVIMENTO 2.1) PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES (PIV) 2.1.1) Introdução

A Produção in vitro (PIV) de embriões é um sistema alternativo de produção de embriões, principalmente bovinos, que utiliza ovócitos imaturos coletados de ovários de doadoras de várias idades e estados fisiológicos.

A PIV é uma biotécnica utilizada alternativamente para acelerar a produção de animais geneticamente superiores e impedir através, da punção in vivo (OPU), o descarte precoce de fêmeas geneticamente privilegiadas portadoras de alterações adquiridas, que impedem a reprodução de forma natural (GONÇALVES et al., 2002).

Inicialmente a PIV foi utilizada como ferramenta de pesquisa e foi empregada para recuperar ovócitos de doadoras abatidas. Em bovinos, comparando este uso, a PIV vem sendo importante para a produção de embriões de doadoras vivas, como alternativa, ou para integrar com a superovulação e transferência de embriões, devido à flexibilidade e vantagens que esta oferece (GALLI et al., 2003).

A PIV também é uma técnica fundamental para o uso de todas as novas biotécnicas de reprodução animal, pois através dela é possível produzir embriões pré-sexados e embriões ou zigotos em vários estágios de desenvolvimento, para o estudo de transgênese e clonagem. Recentemente, também tem sido sugerido

o uso da PIV para avaliar o potencial reprodutivo de touros, avaliando com mais precisão a fertilidade do reprodutor (EMBRAPA / CENARGEN, 2000).

Segundo DE BEM et al., (1995), podemos resumir algumas aplicações da PIV que se enquadram a todas as espécies de animais domésticos: obter uma maior quantidade de embriões a menor custo; obter um grande número de pró- núcleos para experiências de microinjeção de DNA exógenos, visando a obtenção de animais transgênicos; estudar alguns mecanismos ainda desconhecidos da capacitação espermática e da fecundação propriamente dita; testar in vitro a fertilidade potencial de machos utilizados em programas de melhoramento genético; determinar novos meios e cultivos celulares para incrementar a produção de bons embriões; abrir espaço para trabalhos científicos e iniciação de novos pesquisadores.

As rotinas de PIV realizadas durante o estágio, estão relacionadas na Tabela 2.

TABELA 2 - Rotinas de PIV realizadas durante o período de estágio

DESCRIÇÃO Nº

Rotinas realizadas 17

Ovários puncionados 1676

Ovócitos recuperados 8842

Ovócitos selecionados 4931

2.1.2) Etapas da produção in vitro de embriões

A PIV envolve a coleta, maturação e fecundação de ovócitos e ainda, o cultivo de zigotos e embriões.

2.1.2.1) Coleta dos ovócitos

Os ovócitos para PIV podem ser obtidos de diferentes tipos de doadoras e também por diferentes métodos, como por exemplo: in vitro através de punção folicular de ovários provenientes de abatedouro ou in vivo através da OPU ou laparotomia de flanco, sendo esta pouco utilizada atualmente.

Os ovários de abatedouro, apesar de serem uma importante fonte de ovócitos para serem utilizados na pesquisa, são geralmente provenientes de animais sem valor econômico. Entretanto, o desenvolvimento de outros métodos de aspiração folicular tem permitido a recuperação de ovócitos de animais vivos, proporcionando a multiplicação de animais de interesse econômico, superando os índices da Transferência de Embriões (TE) clássica, no que diz respeito à produção de terneiros/vaca/ano (EMBRAPA/CENARGEN, 2000).

No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem os ovários eram obtidos, na maioria das rotinas, do Frigorífico Verdi, localizado no município de Pouso Redondo-SC, distante cerca de 100 Km do Laboratório. Logo após o abate, os ovários eram colocados em PBS (Phosphated Buffered Saline Solution) a uma temperatura de 30-35ºC, sendo transportados até o laboratório em recipiente hermético. Como os ovócitos são sensíveis a choques térmicos, é importante um cuidadoso monitoramento da temperatura durante os procedimentos de coleta e transporte (GALLI et al., 2003). O tempo desde o abate até a chegada no laboratório não deve ser superior a 3 horas.

Ao chegar no laboratório, a temperatura do PBS onde foram transportados os ovários era medida, em seguida eram retirados os tecidos adjacentes aos ovários, quando necessário. Após, os ovários eram submetidos a 2 lavagens em PBS, na mesma temperatura de chegada, a fim de evitar choque térmico. Depois das lavagens, os ovários eram colocados em um recipiente contendo PBS aquecido, onde permaneciam até o inicio da punção.

A punção dos folículos, com diâmetro entre 2 e 8 mm, era realizada com scalps (18 G), utilizando 2,0 a 2,5 de pressão na bomba de vácuo (20-30 mL/minuto), sendo o líquido folicular depositado em tubos cônicos de 15 mL, esperando de 5 a 10 minutos para sedimentação. Durante o repouso os tubos eram mantidos em fluxo laminar e sobre placa aquecedora. O tempo de sedimentação não deve ser superior a 15 minutos, pois assim as sujidades do líquido folicular irão sedimentar junto com os ovócitos, o que dificultará a busca dos mesmos.

Marcar o momento do início e final da punção, contar e pesar os ovários. A figura 2 ilustra o procedimento de punção folicular.

FIGURA 2 – Punção folicular utilizando scalp.

Logo após o tempo de repouso, o sedimento dos tubos era retirado, com o auxílio de uma pipeta de Pasteur e transferidos para placas de Petri milimetradas, onde era realizada a busca dos complexos cumulus oophoros (CCOs), sob a lupa-estereomicroscópica, em fluxo laminar. Os CCOs encontrados eram colocados em placas de Petri pequenas (30x10mm) contendo líquido folicular centrifugado, para posterior seleção. Estas placas eram mantidas sob fluxo laminar e sobre placa aquecedora.

A seleção dos ovócitos era feita em líquido folicular, também sob fluxo laminar e sobre placa aquecedora. Eram selecionados os ovócitos com tamanho médio, ovoplasma de coloração marrom homogênea e cobertura de células do

cumulus (compacto em toda a superfície do ovócito), descartando ovócitos muito grandes, retraídos ou de contorno irregular; com ovoplasma com coloração muito clara ou apresentando granulação escura e ovócitos com cumulus incompleto, frouxo ou expandido.

Existem diversas categorias para classificação de ovócitos, as quais variam segundo os autores e são importantes para fins científicos e controle de qualidade, tanto da produção quanto da coleta dos CCOs.

Os critérios para seleção dos ovócitos estão descritos a seguir por LEIBFRIED et al., 1979, adaptado por GONÇALVES et al. (2002):

a) Grau I: Cumulus compacto, contendo mais de três camadas de células.

Citoplasma com granulações finas e homogêneas, de coloração marrom, preenchendo o interior da zona pelúcida.

b) Grau II: Cumulus compacto parcialmente presente ou com menos de três camadas celulares rodeando completamente o ovócito. Citoplasma com granulações distribuídas heterogeneamente.

c) Grau III: Cumulus expandido. Citoplasma contraído, com espaço entre a membrana celular e a zona pelúcida.

d) Grau IV: Ovócito sem cumulus (desnudo).

Após a seleção os ovócitos eram colocados em TCM Hepes (Meio de manipulação), para uma rápida lavagem antes de serem colocados na placa de maturação. Procurar não ultrapassar 20 minutos desde a punção até a colocação em TCM Hepes.

2.1.2.2) Maturação in vitro

A maturação é essencial no processo de PIV, pois é onde o ovócito adquire capacidade para ser fecundado posteriormente. Portanto, a maturação dos ovócitos depende da eficiência do método de coleta e, principalmente, dos meios e métodos de maturação in vitro.

Quando os ovócitos são retirados de folículos terciários e cultivados in vitro, a maturação ocorre tanto no núcleo quanto no citoplasma. Somente ovócitos com maturação nuclear e citoplasmática podem ser fecundados. A primeira modificação visível do núcleo é a condensação da cromatina e a dissolução da membrana nuclear, processo conhecido como ruptura da vesícula germinativa (PALMA et al., 2001).

A maturação do ovócito está ligada a uma série de mudanças estruturais e bioquímicas que tornam o gameta feminino apto para ser fecundado e ter desenvolvimento embrionário subseqüente. In vivo, esse processo tem início, coincidentemente, com o pico pré-ovulatório de LH e, in vitro, com a simples retirada do ovócito do folículo (GONÇALVES et al., 2002).

O efeito da aspiração dos ovócitos sobre sua capacidade de desenvolvimento pode variar se os CCOs são obtidos de vacas vivas. Os CCOs recorrem maiores distâncias no tubo coletor, a presença de ar é maior na tubulação, em conseqüência o efeito traumático da pressão negativa pode aumentar e desta forma se observou um número menor de camadas de células da granulosa (PALMA et al., 1996).

TABELA 3 - Desenvolvimento de embriões produzidos in vitro depois da maturação de COCs com diferente número de camadas

de células da granulosa

Nº de capas da Nº de ovócitos Desenvolvimento (%) granulosa recuperados 2 a 4 céls., D2 embriões, D7

4-6 81 25** 4**

> 6 58 32** 18**

** nas mesmas colunas diferem significativamente (p< 0,01) Fonte: PALMA et al.,2001.

Estudos realizados nas décadas de 70 e 80 por LEIBFRIED & FIRST (1979) e SÜSS & MADISON (1983), indicaram que somente os ovócitos que apresentam um cumulus completo, possuem capacidade de completar a maturação in vitro e alcançar o estado de embrião transferível. Mas estudos realizados por PALMA et al., (2001), demonstraram que mesmo ovócitos com cumulus incompleto podem desenvolver-se corretamente, chegando a embriões viáveis.

Na maioria dos laboratórios, as condições de maturação utilizadas envolvem o uso de TCM (Tissue Culture Medium) 199, suplementado com soro fetal bovino (SFB) e gonadotrofinas (FSH e LH) em 5% de CO2 em ar a 38,5ºC. O quadro 1 demonstra a composição do meio de maturação utilizado no Laboratório.

QUADRO 1 - Meio de maturação

Produto Quantidade

5 mL 10 mL

TCM bicarbonato 4,5 mL 9,0 mL

Sol. Piruvato (Sol. I) 57,5 µl 115 µl

Soro de égua em estro (10%) 0,5 mL 1,0 mL

LH * 5 µg / mL

FSH * 0,01 UI / mL

- * Adicionar uma alíquota de FSH (50 µl) e LH (50 µl) ao meio, pois estas alíquotas já contêm a quantidade necessária de gonadotrofinas.

- Colocar 400 µl do meio em cada poço da placa Nunc.

- Manter a placa identificada em estufa por no mínimo 12 horas antes do uso.

Fonte: Protocolo para PIV utilizado no Laboratório de Reprodução Animal Prof.

Assis Roberto De Bem.

As chamadas soluções base utilizadas no Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem, eram feitas no próprio Laboratório, pelo Prof. Alceu Mezzalira, coordenador do Laboratório. As soluções produzidas no Laboratório devem ter a osmolaridade corrigida, pois esta deve ficar entre 275 e 285 mOsm.

Quando são utilizadas soluções comerciais, não é necessária a correção da osmolaridade antes do uso, pois esta já está nos valores normais (entre 275 e 285 mOsm). Esses valores são ligeiramente inferiores ao do plasma sangüíneo, que é de aproximadamente 290 mOsm, entretanto esta condição ligeiramente hipotônica da solução é para compensar a evaporação que ocorre durante a incubação. A verificação da osmolaridade é um dos controles de qualidade imprescindíveis em um laboratório que produz seus próprios meios, a fim de evitar os erros de pesagem e diluição de seus componentes, bem como para controlar a qualidade da água utilizada e dos suplementos dos meios (PALMA et al., 2001).

Outro fator que deve ter uma atenção especial é o pH das soluções, este deve ser mantido em valores similares ao do plasma sangüíneo, por meio do sistema ácido carbônico/bicarbonato (H2CO3/HCO3). A enzima anidrase carbônica, presente nas células, catalisa tanto a formação quanto à decomposição do ácido carbônico. Quanto mais elevada é a concentração de CO2

(normalmente para ovócitos e embriões 5%), maior é a dissolução de CO2 que se combina com a água, gerando bicarbonato e íons de H⁺, aumentando a acidez do meio. Contrariamente a isto, quanto menor é sua concentração, mais CO2 passa da forma líquida para gasosa, diminuindo a concentração de íons de H⁺, tornando a solução alcalina. Por isso, para cada solução e particularmente para cada concentração na estufa de CO2, existe uma quantidade preestabelecida de bicarbonato de sódio no meio (PALMA et al., 2001).

Para um efetivo controle visual das variações de pH, se utiliza nos meios o corante vermelho de fenol. O indicador é vermelho a um pH de 7,4 (ideal);

alaranjado a 7,0; amarelo a 6,5; vermelho escuro a 7,6 e púrpura a 7,8.

O SFB (Soro Fetal Bovino) é utilizado como fonte protéica. O soro junto com a albumina bovina, é o complemento orgânico mais importante dos meios, levando a uma perfeita expansão do cumulus e maturação do ovócito. Além do SFB, pode ser utilizado o soro de vaca em estro (SVE), ambos em concentrações de 2 a 10%.

A função das gonadotrofinas (FSH e LH) é assegurar níveis semelhantes aos existentes in vivo, proporcionando condições adequadas para uma perfeita fecundação e desenvolvimento embrionário (GONÇALVES et al., 2002).

No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem, após a seleção retirava-se uma placa com meio de maturação da estufa, preparada na noite anterior ao abate, preferencialmente, ou na manhã do abate, efetuando-se a transferência dos ovócitos da placa contendo o meio de manipulação, procurando levar o mínimo possível deste meio, e retornando o mais breve possível para a estufa, a fim de evitar alteração de pH, o que poderia prejudicar a viabilidade dos ovócitos.

Após 20-24 horas de incubação em 5% de CO2 em ar e 38,5ºC, os ovócitos estão completamente maturados, com expulsão do primeiro corpúsculo polar e estão prontos para a fecundação. Terminado o tempo de maturação, verificava-se a expansão das células dos CCOs, o que indicava uma correta maturação dos ovócitos.

2.1.2.3) Separação e capacitação espermática

A capacitação espermática é a condição fisiológica que devem cumprir os espermatozóides (sptz) para adquirir sua capacidade fecundante in vivo. Isto é feito através da remoção dos fatores decapacitantes, derivados das vias genitais masculinas e da interação das células espermáticas com os chamados “fatores capacitantes”, que se encontram no trato genital feminino. Os mecanismos de capacitação são poucos conhecidos, entretanto sabe-se que ocorrem modificações bioquímicas e estruturais que levam a eliminação de componentes aderidos à membrana do espermatozóide, modificação da composição lipídica da membrana plasmática, aumento da permeabilidade aos íons de Ca⁺⁺, modificação do pH interno e um incremento na permeabilidade e no metabolismo celular.

Todas estas modificações levam a reação acrossômica cuja ativação prematura é evitada pelos mesmos fatores que regulam a capacitação (PALMA et al., 2001).

Para capacitação in vitro, emprega-se a heparina, a qual desencadeia a capacitação, finalizando a reação acrossômica e permitindo a penetração do espermatozóide através da zona pelúcida (PALMA et al., 2001).

A técnica de separação espermática tem a finalidade de remover os espermatozóides mortos, os crioprotetores, substâncias tóxicas e recuperar a maioria dos espermatozóides móveis sem produzir alterações espermáticas. Além disso, deve permitir o controle da concentração e volume final da suspensão espermática (GONÇALVES et al., 2001).

As técnicas mais utilizadas para a separação dos espermatozóides vivos dos demais componentes do sêmen e dos crioprotetores são: o Swim-up (técnica de migração ascendente) e o gradiente Percoll. Ambas técnicas têm os mesmos

objetivos: separar os espermatozóides do líquido seminal e do diluente e obter espermatozóides com no mínimo 70% de motilidade retilínea progressiva.

No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem, a técnica utilizada era o Swim-up, desenvolvida por PARRISH et al. (1984), a qual se baseia na capacidade migratória dos espermatozóides incubados em meio de cultivo a 39ºC, por seus próprios movimentos.

FIGURA 3 – Tubos prontos para Swim-up.

No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem os meios para migração (TALP Sperm) e para fecundação (TALP Fert), eram feitos na noite anterior ou na manhã da fecundação.

QUADRO 2 - Meio de migração (TALP Sperm), para Swim-up

Produto Quantidade

5 mL 10 mL

TALP Sperm 5,0 mL 10,0 mL

BSA fração V 0,03 g 0,06 g

Sol. Piruvato 70µl (Sol.II)/250 µl (Sol. I) 140 µl (Sol. II)/500µl(Sol. I) - Acertar o pH em 7,3 – 7,4 com HCl 0,1 N (fica amarelado - se acidificar muito agitar até subir o

pH).

- Filtrar (usar seringa limpa e o mesmo filtro do Fert - desprezar as primeiras gotas), colocar em tubo cônico e armazenar na geladeira.

Fonte: Protocolo para PIV utilizado no Laboratório de Reprodução Animal Prof.

Assis Roberto De Bem.

Uma hora antes de completar o período de maturação dos ovócitos, era aquecido em banho-maria uma quantidade suficiente de tubos cônicos com 1 mL de TALP Sperm (meio de migração). Em seguida, descongelava-se a palheta de sêmen em água a 35°C por 30 segundos, secava-se a palheta e vertia-se o conteúdo em um Eppendorf. Eram depositados 100 µl do sêmen sob o meio de migração, de forma lenta para evitar a suspensão. Após, os tubos eram colocados em banho-maria por uma hora a 38,5°C para que os espermatozóides aptos migrem para a porção superior do meio de migração, enquanto os demais constituintes do sêmen, juntamente com espermatozóides mortos, permaneçam no fundo.

Após o período de migração, retirava-se 850 µl do sobrenadante com pipetador, tendo cuidado para não aspirar a camada inferior, onde encontram-se os espermatozóides imóveis, substâncias decapacitantes e crioprotetores. O

sobrenadante era depositado em um tubo, previamente aquecido, e centrifugado por 5 minutos na intensidade 1 (200 rpm). O pellet formado no fundo do tubo era recolhido, com um volume de meio relativo ao número de tubos utilizados para a migração (70 µl por tubo). A quantidade de pellet recolhida por tubo é determinada em função da qualidade do sêmen. Quanto melhor o sêmen, menor o volume recolhido do pellet por tubo. A quantidade total retirada do pellet era depositada em Eppendorf previamente aquecido. Do total retirado pegava-se uma amostra de 5 µl que era colocada em 95 µl de água destilada (diluição 1:20) para determinar a concentração espermática em câmara de Neubauer. Era feita a contagem dos espermatozóides presentes em 5 quadrados de cada hemi-câmara, e somava-se os valores encontrados, dividia-se por 2, e aplicava-se a fórmula, permitindo o uso de uma dose inseminante, com 1.000.000 células por mL (1x10⁶ sptz/mL). No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem, este cálculo da dose inseminante só era feito quando o sêmen era utilizado pela primeira vez, ou em novas partidas do sêmen. Não sendo necessário, portanto, o cálculo da dose inseminante em cada rotina. O sêmen utilizado era de um touro da raça Devon, da Fazenda Arapari, localizada no município de Água Doce-SC.

Para a fecundação com este sêmen utilizava-se, uma dose inseminante fixa, de 20 µl.

A fórmula para cálculo da dose inseminante é a seguinte:

C1 x V1 = C2 x V2

C1 (Concentração inicial) = Média de sptz contados / 0,02/ 0,05 ou média/1/1000 C1 = média x 1000/mm³ ou C1 = média x 10⁶ sptz/mL

0,02 = Volume da câmara de Neubauer (0,2 = área x 0,1 = altura) 0,05 = Diluição usada, 1:20; Contando 5 quadrados de cada câmara

V1 = Volume inicial

V2 = Volume final (é o volume do poço da placa de fecundação) = 400 µl C2 = Concentração final (1 x 10⁶ sptz/mL)

Exemplo:

Nº de sptz contados = 60; Média = 30

C1 = 30/0,02/0,05 = 30 x 10³ ou 30 x 10⁵ sptz/mL C1 x V1 = C2 x V2

30 x 10⁶ x V1 = 1 x 10⁶ x 400 V1 = 400/30

V1 = 13,3 µl é a dose inseminante.

2.1.2.4) Fecundação in vitro

A fecundação resume os eventos iniciados pela penetração do espermatozóide através das diferentes capas celulares e não celulares que rodeiam o ovócito e culminam com a formação dos pró-núcleos. É uma reação em cascata, desencadeada pela passagem do espermatozóide pela zona pelúcida, penetração na membrana plasmática e seu alojamento no interior do citoplasma ovocitário (PALMA et al., 2001).

QUADRO 3 - Meio de fecundação (TALP Fert)

Produto Quantidade

5 mL 10 mL

TALP Fert 5,0 mL 10,0 mL

BSA fração V 0,03 g 0,06 g

Sol. Piruvato 50 µl (Sol. I) 100 µl (Sol. I)

Sol. PHE 50 µl 100 µl

Sol. de Heparina * 0,0006 g/mL

- Filtrar o meio e preparar os poços na placa de fecundação.

- *Adicionar 20 µl de Sol. de Heparina em cada poço da placa.

- Manter a placa e o meio restante em estufa por 12 horas antes do uso.

Fonte: Protocolo para PIV utilizado no Laboratório de Reprodução Animal Prof.

Assis Roberto De Bem.

Segundo GONÇALVES et al. (2001), a adição de PHE (Penicilamina, hipotaurina, epinefrina) tem a finalidade de aumentar a atividade espermática e facilitar a sua penetração, incrementando os índices de fecundação.

Após a maturação, os ovócitos eram transferidos, com o auxílio de uma ponteira de vidro de espessura média, diretamente para uma placa Nunc (4 poços) com 400 µl de meio de fecundação (TALP Fert) em cada poço, previamente equilibrado em estufa, e já contendo a heparina, que deve ser colocada na véspera. O volume de sêmen era depositado em cada poço, ao redor dos ovócitos, verificando-se a seguir a motilidade dos espermatozóides. A transferência deve ser realizada no menor tempo possível, retornando para a estufa logo após a colocação dos espermatozóides junto com os ovócitos. A incubação dos ovócitos com os espermatozóides deve durar de 18 a 22 horas. O dia da fecundação era considerado como o dia 0 (D0), da produção in vitro.

QUADRO 4 - Diluição da heparina, adicionada ao meio de fecundação, para capacitação dos espermatozóides

2.1.2.5) Desnudamento

Consiste na remoção parcial das células do cumulus e também de espermatozóides aderidos a elas. É feito com o auxílio de um agitador de tubos, Vórtex.

Após a fecundação, colocava-se 400 µl de meio de manipulação (TCM Hepes) em tubo de ensaio e com micropipeta média as estruturas eram

HEPARINA

3,0 mg de heparina em 5,0 mL de água ultrapura – Filtrar e aliquotar.

transferidas da cada poço da placa de fecundação para o tubo de ensaio contendo TCM Hepes. Em seguida, os tubos eram submetidos ao vórtex por 1,20 minutos na intensidade 6. Com micropipeta fina, as estruturas eram retiradas dos tubos de ensaio e depositadas em placa de Petri para busca. Lavava-se o tubo 2 vezes com 400 µl de meio de manipulação de cada vez, com a finalidade de retirar as estruturas da parede e leva-las para o fundo do tubo, logo após depositava-se o conteúdo na mesma placa. Os zigotos eram agrupados, em números semelhantes, sempre procurando fazer grupos com qualidades diferentes, para que durante o cultivo, os embriões possam ter melhores condições de desenvolvimento. Com micropipeta fina, os zigotos eram transferidos para uma placa com TCM Hepes, chamada placa de manutenção, para uma rápida lavagem, antes de serem transferidos para a placa de cultivo. A micropipeta para transferência dos zigotos deve ser fina para evitar excesso de células e também para levar o mínimo possível de meio de manipulação. O dia do desnudamento era considerado o dia 1 (D1).

2.1.2.6) Cultivo in vitro

É o desenvolvimento de ovócitos fecundados até o estágio de blastocisto (Bl) (GALLI et al., 2003).

No final da década de 80, foram muitos os meios de cultivo avaliados e diversas as combinações estudadas para obter adequadas taxas de blastocistos transferíveis e congeláveis no dia 7 (BERG et al., 1993). Atualmente, o interesse se volta para dois aspectos básicos: desenvolver meios de cultivo que atendam as necessidades metabólicas dos embriões durante seu desenvolvimento e que

evitem em sua composição as células somáticas, pois estas, após o quarto dia de cultivo, começam a competir com os embriões.

Para que se chegasse ao desenvolvimento embrionário dos dias atuais, foi preciso conhecer as necessidades bioquímicas dos embriões, durante seu desenvolvimento até o estágio de blastocisto, tanto in vivo quanto in vitro . Foram estudadas as características bioquímicas do meio, as quais variavam com o tempo de cultivo, indicando a existência de uma completa interação entre o metabolismo embrionário e os substratos do meio (PALMA et al., 2001).

É necessário, no cultivo embrionário, o uso de meio simples que suporte a nutrição celular e o desenvolvimento durante a fase de pré-implantação embrionária (GONÇALVES et al., 2002).

A fonte de energia dos embriões durante seu desenvolvimento in vitro, se baseia na fosforilação oxidativa, através da oxidação do piruvato e aminoácidos, durante os três primeiros dias do desenvolvimento embrionário e da glicose durante os próximos três a quatro dias. Os aminoácidos (AA) são componentes essenciais utilizados nos meios de cultivo, que também atuam como fonte de energia, reguladores de pH e precursores de proteínas e ácidos nucléicos. Seu uso permitiu o aumento da proporção de embriões viáveis de várias espécies domésticas (muares, ovina e bovina). A água constitui quase 99% do conteúdo do meio de cultivo (PALMA et al., 2001).

KIM et al. (1993) relataram que ovócitos bovinos maturados e fecundados in vitro podem desenvolver até blastocisto em meios simples, quimicamente definidos e livres de proteínas. Nesse caso, a adição de aminoácidos, fosfatos, piruvato e lactato é essencial.

No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem, o meio utilizado para cultivo dos embriões era o SOF.

QUADRO 5- Meio utilizado para cultivo de embriões

Produto Quantidade

5 mL 10 mL

SOF 4,75 mL 9,5 mL

Sol. Piruvato 50µl (Sol.II) / 82,5 µl (Sol. I) 100 µl(Sol. II)/165µl(Sol. I) Soro de égua em estro (10%)

ou soro fetal bovino (5%) 0,25 mL 0,5 mL

- Filtrar e depositar 400 µl de meio de cultivo sob 400 µl de óleo mineral, manter em estufa por 12 horas antes do uso.

Fonte: Protocolo para PIV utilizado no Laboratório de Reprodução Animal Prof.

Assis Roberto De Bem.

2.1.2.7) Avaliação da clivagem

A clivagem inicia-se com uma série de divisões mitóticas, por meio das quais o zigoto, que possui uma célula com grande volume, se divide em numerosas células nucleadas de menor tamanho, chamadas blastômeros, até a formação do blastocisto.

Era feita no dia 2 (D2), seguinte ao dia do desnudamento. As estruturas eram movimentadas com micropipeta fina, para melhor visualização e os zigotos não clivados e aglomerados de células do cumulus, aderidos à placa, eram removidos.

Separava-se um bag (pacote de plástico resistente), o vaporizador era retirado do banho-maria e conectado ao cilindro de CO2. Acondicionava-se a placa no bag, inflava-se com gás e selava-se na seladora. Os bags eram colocados na estufa, para posterior avaliação dos embriões. A taxa de clivagem considerada aceitável é de 80%, o que indica um correto e satisfatório desenvolvimento dos embriões.

FIGURA 4- Embriões clivados.

2.1.2.8) Avaliação embrionária

A ativação partenogenética deve ser considerada na avaliação da eficácia da PIV. Ovócitos bovinos não fecundados podem ser ativados e iniciarem a divisão celular, porém, esses ovócitos produzem baixos índices de blastocistos. Por isso, é interessante que cada laboratório tenha conhecimento dos seus índices de partenogênese, que deve variar, no máximo, entre 1% e 5%.

Para a avaliação da PIV, alguns laboratórios usam, como critério, o estágio de 2-4 células, todavia, a maioria dos laboratórios utiliza a produção de mórulas e blastocistos, considerando os índices de produção e qualidade embrionária,

ressaltando-se que o índice de blastocisto expandido é o parâmetro mais confiável da eficácia de todo o processo de PIV (GONÇALVES et al., 2002).

A avaliação dos embriões era realizada no dia 7 (D7), considerando-se a fecundação o D0. Os bags eram abertos para observação do número e tipo das estruturas.

A classificação dos embriões, conforme o estágio de desenvolvimento, era feita de acordo com as normas da Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões (SBTE), onde os embriões são divididos em sete categorias:

Mo – Mórula: apresenta-se como uma massa de células com separação nítida entre os blastômeros, ocupando quase a totalidade do espaço perivitelino (E.P.V.).

Mc – Mórula Compacta: os blastômeros estão agregados entre si, formando uma massa compacta e ocupam 60-70% do E.P.V.

Bi – Blastocisto Inicial: formação da blastocele e ocorre o início da diferenciação entre trofoblasto e botão embrionário. O embrião ocupa 70-80% do E.P.V.

Bl – Blastocisto: evidente diferenciação entre células do trofoblasto e do botão embrionário; as células do botão embrionário estão compactas, a blastocele é proeminente e o embrião ocupa a totalidade do E.P.V.

Bx – Blastocisto expandido: o embrião aumenta 1,5 x o seu diâmetro e a membrana pelúcida diminui em 1/3 sua espessura.

Bn – Blastocisto em Eclosão: o embrião está iniciando o processo de saída da membrana pelúcida.

Be – Blastocisto Eclodido: o embrião está completamente livre da membrana pelúcida; ainda é nítida a presença da blastocele.

Só serão considerados os Blastocistos Iniciais (Bi), Blastocistos (Bl), Blastocistos Expandidos (Bx), Blastocistos em Eclosão (Bn) e Blastocistos Eclodidos (Be). Visto que, neste dia os embriões deveriam ter alcançado no mínimo, o estágio de Blastocisto Inicial, a maioria estando no estágio de Blastocisto e alguns no estágio de Blastocisto Expandido. Alguns embriões só alcançarão estes estágios no dia 8 ou 9, sendo estes considerados embriões de baixa qualidade (GALLI et al., 2003).

A taxa mínima aceitável de embriões, para se ter sucesso com a PIV é de 30%, a partir dos zigotos desnudados.

A avaliação da qualidade dos embriões era feita segundo os parâmetros de qualidade propostos pela IETS (Sociedade Internacional de Transferência de embriões) (1998):

Excelente ou Bom: estágio de desenvolvimento correspondente ao esperado; massa embrionária simétrica esférica com blastômeros individuais que são uniformes em tamanho, cor e densidade; forma regular, a zona pelúcida (ZP) não deve apresentar superfície côncava ou plana, deve ser lisa, preferencialmente intacta, especialmente se o embrião é destinado à exportação;

células extrusadas da massa celular do embrião compreendem menos de 15% do material celular total.

Regular: estágio de desenvolvimento correspondente ao esperado; forma regular, ZP intacta ou não, irregularidades moderadas na forma geral da massa embrionária ou no tamanho, cor e densidade das células individuais; células extrusadas da massa celular do embrião compreendem mais de 15% do material total celular; pelo menos 50% das células compõem uma massa embrionária viável, intacta.

Pobre: estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado;

irregularidades maiores na forma geral da massa embrionária ou no tamanho, cor e densidade das células individuais; menos de 75% das células degeneradas;

pelo menos 25% das células compõem uma massa embrionária viável, intacta.

Morto ou degenerado: estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado, embrião em degeneração; massa embrionária de menos de 25% de todo material presente no interior da ZP; ovócitos ou estruturas unicelulares degeneradas.

TABELA 4 - Desenvolvimento de embriões produzidos in vitro, utilizando dois meios de cultivo

MEIO DE CULTIVO % CLIVAGEM % EMBRIÕES

SOF Lab 70,5% 25,38%

SOF Nutricell 58,0% 17,33%

TOTAL 64,25% 21,35%

2.2) OPU (OVUM PICK-UP)

É uma técnica de alta flexibilidade e repetibilidade para produção in vitro de embriões, vindos de qualquer doadora viva. Este método, associado a PIV, é ainda de fundamental importância para produzir embriões de vacas prenhes, de vacas que não respondem a superovulação, de animais portadores de patologias reprodutivas adquiridas, de animais senis e pré-púberes. Esses podem ser coletados semanalmente, sem causar transtornos para o ciclo estral ou para a prenhez (EMBRAPA/CENARGEN, 2000).

Essa técnica, conhecida como aspiração folicular guiada por ultra-som, é feita utilizando-se uma sonda ultra-sonográfica, via vaginal, de maneira a obter imagem do ovário e dos folículos. Tem-se acoplada à sonda, uma agulha e a esta uma bomba de vácuo, para aspiração do líquido folicular e juntamente os ovócitos.

Em terneiras, pela limitação de tamanho, a aspiração dos folículos era realizada por laparotomia ou laparoscopia, mas devido ao acesso limitado aos ovários e traumas consideráveis, atualmente foi desenvolvida uma sonda que permite a aspiração transvaginal em terneiras a partir de 6 meses de idade (EMBRAPA/CENARGEN, 2000).

Os principais fatores relacionados com o êxito da OPU, podem ser divididos em duas grandes categorias. A primeira categoria se refere aos aspectos técnicos: procedimento de aspiração, tipo e diâmetro da agulha, pressão de aspiração e a possibilidade de influência do bisel da agulha. A segunda categoria inclui os fatores biológicos, como: estimulação hormonal prévia a punção folicular, o momento do ciclo estral em que é realizado o procedimento, raça e estado fisiológico da doadora (PETER BOLS, 2001).

Segundo dados da EMBRAPA/CENARGEN (2000), a média de ovócitos viáveis obtidos por coleta in vivo de vacas, é de cinco ovócitos viáveis por punção, o que pode ser duplicado, se os animais receberem uma estimulação hormonal prévia. As taxas de blastocisto, após a PIV, estão em torno de 30%, com 40-50%

de prenhez. Entretanto, existe uma grande variação na produção de blastocisto, que pode ser devida não só à doadora, mas também ao sêmen utilizado. Tendo como base as taxas médias relatadas na literatura, pode-se considerar a obtenção de 10 ovócitos viáveis por semana (duas punções semanais), com 30%

de blastocisto, o que resultaria em 3 embriões transferíveis por semana. Em um período de 3 meses, a aspiração folicular associada a PIV, renderia em torno de 36 embriões, valores três vezes maiores que os obtidos com transferência clássica, no mesmo espaço de tempo.

Nas rotinas de OPU, realizadas na Fazenda Arapari, localizada no município de Água Doce-SC, era utilizado um ultra-som da marca Pie Medical, com probe retilínea de 8MHz e agulhas 40 x 10 ou 40 x 8, acoplada a um tubo cônico de 50 mL contendo PBS e heparina (para evitar a formação de coágulos sangüíneos) e também a uma bomba de vácuo para aspiração do líquido folicular e também dos ovócitos. A velocidade de aspiração era de 10mL/minuto.

Os CCOs recuperados pela OPU, durante o procedimento, eram mantidos em PBS com heparina. Após eram filtrados com PBS e colocados em placas de Petri milimetradas, para busca dos CCOs. Estes eram colocados em placas de Petri pequenas, contendo TCM Hepes, sobre placa aquecedora. Depois de terminada a busca, os CCOs eram classificados, conforme descrição anterior. Os CCOs de grau I e II eram vitrificados. Posteriormente, o processo de vitrificação será descrito.

TABELA 5- Resultados da OPU realizada durante o estágio

DESCRIÇÃO Nº

Vacas aspiradas* 24

Ovócitos recuperados 138

Ovócitos selecionados 88

Ovócitos vitrificados 83

* As vacas aspiradas eram todas da raça Devon.

Durante as coletas foram utilizadas duas agulhas: 40 x 10, com a qual se obtinha maior número de ovócitos, porém de baixa qualidade, provavelmente pelo maior turbilhonamento dos ovócitos; e 40 x 8, com a qual o número de ovócitos recuperados era menor, entretanto a qualidade destes era melhor.

2.3) VITRIFICAÇÃO

A criopreservação de embriões produzidos in vitro é uma alternativa importante se o objetivo é obter índices de prenhez semelhantes àqueles obtidos com embriões produzidos in vivo (CABODEVILA & TERUEL, 2001).

Apesar da grande quantidade de trabalhos realizados, os resultados de desenvolvimento in vitro e as porcentagens de prenhez após a transferência de embriões congelados produzidos in vitro são menores que os obtidos com embriões frescos. Diversos fatores seriam responsáveis por tais resultados, entre eles características morfológicas, bioquímicas e fisiológicas pertencentes aos embriões produzidos in vitro, as condições de cultivo, o método de congelamento utilizado, o crioprotetor, o estado de desenvolvimento e a idade do embrião. Por sua vez, a suplementação da solução utilizada para o congelamento, com diferentes açúcares tem sido realizada em busca de uma maior sobrevivência após o descongelamento. Também se tem suplementado a solução de estabilização utilizada para o congelamento de blastocistos, com Albumina Sérica Bovina (BSA), buscando uma maior tolerância das membranas celulares as baixas temperaturas (CABODEVILA & TERUEL, 2001).

A vitrificação é um processo termodinâmico, no qual um fluido incrementa sua viscosidade durante o resfriamento, adquirindo propriedades de um sólido. A diferença do que ocorre durante o congelamento, é que na vitrificação não se formam cristais e sim o fluido passa do estado líquido para o sólido, formando uma estrutura semelhante ao vidro, de onde vem a denominação da técnica (BAUTISTA & KANAGAWA, 1998).

Em condições práticas, a vitrificação consiste na imersão direta da palheta em nitrogênio líquido, o que representa uma velocidade de resfriamento de,

aproximadamente, 2500ºC/minuto, sendo necessário o emprego de soluções altamente concentradas com um ou mais crioprotetores permeáveis, os quais podem ser tóxicos para as células (PALASZ & MAPLETOFT, 1996).

No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem, os protocolos utilizados para vitrificação de ovócitos e embriões eram os seguintes:

2.3.1) Protocolo para vitrificação de ovócitos:

1) Solução de Vitrificação:

- Poço 1: 400 µl de meio de manutenção + 50 µl EG + 50 µl DMSO - 30 seg;

- Poço 2: 300 µl Sol. de Sacarose + 100 µl EG + 100 µl DMSO - 20 seg;

- Poço 3: 400 µl de meio de manutenção;

- Poço 4: 400 µl de meio de manutenção.

2) Solução Reaquecimento:

- Poço 1: 800 µl meio de manutenção + 400 µl de Sol. de Sacarose

(0,30M);

- Poço 2: 400 µl de meio de manutenção + 200 µl de Sol. de Sacarose

(0,15M) - 5 minutos;

- Poço 3: 400 µl de meio de manutenção + 100 µl de Sol. de Sacarose (0,30M) - 5 minutos;

- Poço 4: 400 µl de meio de manutenção.

2.3.2) Protocolo para vitrificação de embriões:

1) Protocolos:

• Protocolo 1:

- 400 µl meio de manipulação + 50 µl EG + 50 µl DMSO - 1 min;

- 300 µl meio de manipulação + 100µl EG + 100 µl DMSO -20 seg;

• Protocolo 2:

- 9 mL PBS (Dulbbecos) + 1 mL G - 5 minutos;

- 7 mL PBS (Dulbbecos) + 1 mL G + 2 mL EG - 1 minuto;

- 5 mL PBS (Dulbbecos) + 2,5 mL G + 2,5 mL EG - 30 segundos;

• Protocolo 3:

- Exposição por 2 minutos a uma solução com 1,5 M de EG;

- Exposição por 2 minutos a uma solução com 3,5 M de EG;

- Exposição por 30 segundos a uma solução com 7,0 M de EG;

• Protocolo 4:

- 8 mL PBS (Dulbbecos) + 1mL EG + 1 mL Propanediol – 1 minuto;

- 6mL PBS (Dulbbecos)+ 2mL EG + 2mL Propanediol - 20 segundos;

Durante o período de estágio, o protocolo utilizado para a vitrificação dos embriões era o Protocolo 1.

2) Envase:

- Envase em OPS (palhetas espichadas) , com grupos de 3 embriões em cada recipiente;

- Após o envase, as OPS devem ser submersas em nitrogênio líquido e armazenadas em botijões criogênicos até o momento do reaquecimento.

3) Reaquecimento e Remoção dos Crioprotetores:

- Soluções decrescentes de sacarose (0,3M; 0,15M; 0,0M) permanecendo 5 minutos em cada solução em todos os tratamentos;

- Em seguida, os blastocistos serão cultivados em estufa a 38,5°C, por 72 horas;

- A avaliação da viabilidade será procedida com 12 horas, pelas taxas de re-expansão e com 48 e 72 horas pelas taxas de eclosão.

• Reaquecimento:

- Poço 1: 400 µl TCM 400 µl Sacarose - Poço 2: 200 µl TCM

200 µl Sacarose - Poço 3: 400 µl TCM

200 µl Sacarose - Poço 4: 400 µl TCM

Obs.: Adicionar 250 µl de SEE (Soro de Égua em Estro) na sacarose.

No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem, foi desenvolvido, artesanalmente, um aparelho que produzia vácuo no interior do recipiente onde era colocado o nitrogênio líquido, baixando mais ainda a temperatura do nitrogênio líquido, que é de -196ºC, passando para -200ºC.

Acredita-se que a temperatura obtida com o vácuo, era inferior a -200ºC, mas sem a possibilidade de um termômetro adequado, a medida correta da temperatura não foi realizada. A figura 5 demonstra o aparelho produtor de vácuo utilizado para a vitrificação.

FIGURA 5- Aparelho produtor de vácuo utilizado no processo de vitrificação.

Durante o estágio foram acompanhadas algumas rotinas de vitrificação, as quais estão descritas na tabela 6. Destas rotinas acompanhadas, apenas em uma foi realizado o reaquecimento dos embriões vitrificados, sendo os resultados apresentados na tabela 7.