ATIVIDADE CITOTÓXICA E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO
ESSENCIAL EXTRAÍDO DO EUCALYPTUS SP.
Cláudio Costa dos Santos¹, Matheus Silva de Medeiros².
Resumo:O óleo essencial das folhas do Eucalyptus sp, coletadas em Mossoró-RN, foi extraído por meio o processo de hidrodestilação. A análise da composição química foi realizada por meio da cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas para as três amostras de folhas de Eucalyptus sp secas e frescas colhidas em fevereiro e julho de 2019. O composto majoritário nas três amostras foi o 1,8-cineol variando entre 45% e 53%. O teste de atividade citotóxica foi realizado em células cancerígenas do colo do útero (HCT-116), do cérebro (SNB-19) e da próstata (PC-3). Observou-se resultado promissor com relação à atividade citotóxica do óleo essencial de Eucalyptus sp da folha secada nas células cancerígenas da próstata (PC-3).
Palavras-chave:Eucalyptus sp; Óleo essencial; Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas; Atividade citotóxica.
1. INTRODUÇÃO
Os óleos essências são caracterizados como sendo substâncias voláteis extraídas de plantas aromáticas, constituindo matéria-prima para os mais diversos ramos da indústria. Essas substâncias são de extrema importância para as plantas e contêm propriedades medicinais de interesse [1].
Segundo Simões e Spitzer (1999), os óleos essenciais são geralmente produzidos por estruturas secretoras especializadas, tais como: pelos glandulares, células parenquimáticas diferenciadas, canais oleíferos ou em bolsas específicas. Tais estruturas podem estar localizadas em algumas partes específicas ou em toda a planta.
A composição química dos óleosvoláteisextraídos são diferenciados devido à ampla variedade de espécies e subespécies [2]. Os óleos das folhas de eucalipto, formados por uma complexa mistura de componentes, podem envolver mais de 100 compostos voláteis [3].
No caso dos eucaliptos, especificamente, as referências são as de que a ocorrência de óleo essencial estaria relacionada com a defesa da planta contra insetos, resistência ao frio quando no estágio de plântulas, ao efeito alelopático e a redução da perda de água, resultados estes que dependem ainda da realização de estudos mais comprobatórios [3].
Existem diversos métodos para o processo de extração do óleo essencial, que variam dependendo da matéria-prima a ser utilizada e da receita oriunda da extração. No processo de obtenção de óleo de eucalipto, o método mais comum trata-se da extração por hidrodestilação, através do processo de arraste a vapor.
O rendimento desse processo varia muito conforme a espécie de planta utilizada, podendo ocorrer perda nas propriedades sensoriais devido às altas temperaturas, sendo um método de uso geral para folhas e ervas [4].
O presente trabalho teve como matéria-prima as folhas doEucalyptus spcoletadas na cidade de Mossoró-RN e o método de extração do óleo foi a hidrodestilação. O objetivo foi a caracterização da composição química do
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMIÁRIDO - UFERSA CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA
óleo essencial de eucalipto e testar as ações biológicas no nível citotóxico, alelopático e inseticida. Para a caracterização da composição química do óleo essencial das folhas do eucalipto foi utilizada a cromatografia gasosas acoplada aespectrometria de massa.
2. DESENVOLVIMENTO 2.1 EUCALYPTUS SP
O eucalipto é uma árvore nativa da Austrália, do Timor e da Indonésia. Apresenta mais de 600 espécies que se adaptaram facilmente a diversas condições de solo e clima [5]. Podem alcançar 50 metros de altura, sendo sua madeira utilizada principalmente para a produção de lâminas, compensados, aglomerados, carvão vegetal, madeira serrada, celulose e móveis, além de outros produtos como óleo essencial e para a produção de mel. Os primeiros plantios dessa espécie foram realizados no início do século XVIII na Europa, Ásia e África. A partir do século XIX começou a ser cultivado também nos países da América do Sul [6].
No Brasil, em funçãodo clima tropical e subtropical, o período de crescimento vegetativo do eucalipto é de sete anos, enquanto nos países de clima temperado o ciclo é de cinquenta anos [7].
2.2 PROCESSO DE HIDRODESTILAÇÃO
A hidrodestilação é um dos processos mais antigos para a obtenção do óleo essencial. O processo consiste em colocar certa quantidade de insumo (partes da planta) em um balão de fundo redondo com uma quantidade suficiente de água. O balão é aquecido até a água entrar em ebulição e o calor é mantido por algumas horas de modo que o óleo essencial da planta irá evaporar junto com a água e, posteriormente, o óleo é separado no aparelho dosador. O aparelho onde o balão fica acoplado é chamado de clevenger e é por ele que passam os vapores até serem condensados e, por fim, o óleo essencial é extraído.
Figura 2: Aparelho Clevenger. [8]
2.3. CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA AO ESPECTRÔMETRO DE MASSA
Figura 3: Processo de cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massa. [12] 2.4 ÍNDICE DE KOVÁTS
O índice de retenção de um componente é um número que relaciona o tempo de retenção do componente em estudo com o tempo de retenção de dois padrões (geralmente hidrocarbonetos) eluídos antes e depois do pico do composto de interesse [13].
Dentre os índices de retenção encontrados na literatura pode-se citar o índice Kováts e o índice de retenção linear (LRI) como sendo amplamente divulgados. O índice Kováts é sempre calculado sob condições isotérmicas de temperatura. Quando se utilizam temperaturas programadas de coluna, um valor similar pode ser calculado utilizando os números extraídos de seus algoritmos, sendo que este valor é chamado de índice de retenção linear – LRI [13].
A fórmula do índice de Kováts é mostrado pela equação (1) abaixo:
RI= 100n + 100 쏈ᨤ쏈ᨤ t ဇ 쏈ᨤ쏈ᨤ thth (1)
t’ = Tempo de retenção ajustado i = Analito
n = número de carbonos do padrão adjacente menos retido n +1 = número de carbonos do padrão adjacente mais retido
3. MATERIAIS E MÉTODOS
isolando o óleo essencial do Eucalyptus sp. Para o tratamento do óleo volátil utilizou-se sulfato de sódio e clorofórmio, posteriormente, foi utilizado nitrogênio gasoso para evaporação completa do clorofórmio.
A análise da composição química do óleo deEucalyptus spfoi realizada no laboratório da EMBRAPA em equipamento CG-MS Shimadzu. Os analitos da matriz do óleo essencial das folhas do eucalipto (OEFE) foram resolvidos por cromatografia gasosa nas condições de temperatura em rampa 70-180°C (4°C/min) e depois 180-250°C (10°C/min) por meio de injeção direta em coluna RTX5 com 30m de comprimento. A caracterização foi feita por detecção de massas por meio da interpretação dos espectros e posterior comparação com dados descritos na literatura.
Figura 4: Processo de extração do óleo (Autoria própria)
A avaliação do efeito citotóxico das frações obtidas foi realizada pelo método colorimétrico do 3-(4,5-dimetil-2-tiazol) -2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazólio – MTT após 72 horas de incubação. Este é um ensaio quantitativo in vitro usado para estimar a proliferação e sobrevivência celular. Baseia-se na capacidade da succinato desidrogenase, uma enzima do ciclo de Krebs ativa em mitocôndrias de células viáveis, em converter o sal de tetrazólio, que é hidrossolúvel e de cor amarela, em cristais de formazan, que são de cor púrpura [14].
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
O óleo essencial foi retirado das folhas frescas e secas do eucalipto em meses distintos (fevereiro e julho de 2019) pelo processo de hidrodestilação, o mesmo recebeu a nomenclatura OEFE. O óleo tinha uma coloração amarelo pálido. A composição química foi especificada para as três situações onde houve seis compostos majoritários. O composto majoritário em todos os óleos voláteis analisados foi o 1,8-cineol com valores percentuais obtidos entre 53%, 48,04% e 45,83%, que correspondem aos óleos essenciais das folhas de eucalipto secadas e frescas coletadas em fevereiro e frescas coletadas em julho, respectivamente. A figura 05, abaixo, mostra o cromatograma do óleo essencial das folhas do Eucalyptus sp coletadas e secadas em fevereiro de 2019.
Figura 5: Cromatograma de CG-EM do OEFES coletada em 02.2019. (Autoria própria)
A caracterização dos componentes, resolvidos por cromatografia gasosa, foi baseada na análise dos espectros de massa obtidos por alta ionização gerados pelo impacto eletrônico no espectrômetro de massa em comparação com dados coletados na literatura [15]. Os valores dos tempos de retenção foram corrigidos pelo índice de Kováts (IK) e, juntamente com a composição química, foram registrados na Quadro 1.
Figura 6: Espectro de massa e estrutura química do 1,8-cineol, composto majoritário dos OEFE [15].
sp. Os resultados das análises inibitória para o HCT-116 e SNB-19 não tiveram relevância significativa para nenhum dos OEFEs testados no presente estudo.
Quadro 1: Variação da composição química sazonal do óleo essencial do eucalipto.
Componentes KI
corrigido OEFEF-fevÁrea (%) OEFES-fevÁrea (%) OEFEF-JulÁrea (%)
-pineno 940 10,71 1,97 11,5 canfeno 955 0,54 - -- pineno 983 11,48 5,00 19,48 mirceno 992 - - 0,65 o-cimeno 1029 0,81 0,73 0,43 limoneno 1033 5,50 4,47 7,43 1,8-cineol 1037 48,04 53,00 45,83 -terpineno 1063 - - 0,34 terpinoleno 1091 0,20 0,46 0,53 endo-Fenchol 1117 1,64 3,03 0,79 Z-sabinol 1144 - - 0,44 trans-pinocarveol 1144 3,05 5,00 -hidrato de canfeno 1154 - 0,5 -acetato de benzila 1167 0,43 1,08 -borneol 1169 1,86 2,97 0,90 terpinen-4-ol 1181 - 1,90 1,47 -terpineol 1193 5,43 - 5,45 mirtenol 1198 2,14 3,20 0,41 trans-carveol 1222 - 0,44 -cis-ρ-menta-1(7),8-dien-2-ol 1230 0,39 - -α- acetate de terpinila 1352 0,36 - --guaieno 1442 1,09 0,93 -aromadendereno 1443 - - 1,11 allo-aromadendreno 1464 0,11 - -trans-dauca-4(11),7-dieno 1562 0,25 - -globulol 1583 - 3,57 2,07 carotol 1594 2,14 - -Total - 96,17 96,44 98,83
Fonte: Elaborado pelos autores, 2020.
Os valores apresentados no Quadro 2 estão expressos na concentração de g . mL-1. Serão considerados
promissores para que o estudo in vivo seja realizado, valores abaixo de 50 g . mL-1.
Quadro 2: Atividade citotóxica (CI50) do OEFE para as células de câncer humano PC-3, HCT-116 e SNB-19.
PC-3
SNB-19
HCT-116
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O óleo essencial foi obtido através das folhas frescas e secadas do Eucalyptus sp pelo processo de hidrodestilação. A aparência do óleo era de um amarelo claro e ele foi chamado de OEFE. A identificação dos componentes químicos dos óleos voláteis foram realizados por análises em CG-EM e foi observado que o composto majoritário em todos os OEFEs foi o 1,8-cineol.
No teste de atividade citotóxica em MTT foi averiguado um potencial inibidor (CI-50) interessante das folhas secadas do Eucalyptus sp para células cancerígenas da próstata (PC-3) com concentração 34 g . mL-1.
A facilidade do cultivo do Eucalyptus sp no Brasil é principalmente para a produção de celulose ou de extração da madeira. Os resultados achados neste trabalho apresentam uma justifica nova e mais nobre para o manejo do eucalipto como o uso na terapêutica do câncer.
O próximo passo da pesquisa do óleo essencial de Eucalyptus sp será o teste in vivo visando confirmar a eficácia e averiguar a segurança em um organismo complexo.
Devido ao aroma do óleo essencial do Eucalyptus sp uma outra aplicação possível seria na área cosmética.
6. AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi auxiliado pelo Dr. Kirley Marques Canuto da EMBRAPA Agroindústria Tropical, onde foram realizadas as análises cromatográficas e pelo Dr. Bruno Coêlho Cavalcanti do NPDM-UFC, que realizou o teste do MTT para a atividade citotóxica (CI-50) com as linhagens de células de câncer humano PC-3. HCT-116 e SNB-19.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1]VIVIAN, G. A. et al. Estudo técnico e econômico de um sistema móvel de extração de óleo essencial de eucalipto. Cerne, Lavras, v. 17, n. 1, p.23-31, jan./mar. 2011. FapUNIFESP (SciELO).
http://dx.doi.org/10.1590/S0104-77602011000100004
[2] DAFERERA, D. J.; TARANTILIS, P. A.; POLISSIOU, M. G. Characterization of essential oils from lamiaceae species by fourier transform raman spectroscopy. Journal of Agriculture and Food Chemistry,
Athenas, 2002.
[3] DORAN, J.C Commercial sources, uses, formation, and biology. In: BOLAND, D.J; BROPHY, J.J; HOUSE, A.P.N.Eucalyptus leaf oils: use, chemistry, distillation and marketing. Mel-boume: Inkata, 1991. p. 11-28.
[4] VITTI, A. M. S.; BRITO, J. O.Óleo essencial de eucalipto. Piracicaba: ESALQ, 2003. 26 p. (Documentos
florestais, 17).
[5] CONSELHO DE INFORMAÇÃO SOBRE BIOTECNOLOGIA – CBI.Guia do Eucalipto: oportunidade para um desenvolvimento sustentável. 2014.
[8] SERAFINI, Luciana Atti et al (Org.). Óleos Essenciais: Extrações e aplicações de óleos essenciais de plantas aromáticas e medicinais. Caixias do Sul: Educs, 2002. 55 p.
[9]Vékey, K.; J.Chromatogr., A 2001, 921, 227.
[10]Ardrey, R. E.; Liquid Chromatography-Mass Spectrometry: An Introdution, Wiley: Huddersfield,
2003.
[11]Kitson, F. G.; Larsen, B. S.; McEwen, C. N.;Gas Chromatography and Mass Spectrometry - A Pratical Guide, Academic: London, 1996.
[12] NASCIMENTO, Ronaldo Ferreira do et al.CROMATOGRAFIA GASOSA ASPECTOS TEÓRICOS E PRÁTICOS. São Carlos: Nunca, 2015. 179 p.
[13] Inczedy, J.; Lengyel, T.; Ure, A. M.; Compendium of Analytical Nomenclature. Definitive Rules 1997, "The Orange Book", 3rded., Blackwell Science: Oxford, 1998.
[14] MOSMANN T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survivor: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983.
