SINTÉTICOS BIOATIVOS
CÁSSIO ILAN SOARES MEDEIROS
Atividades Antifúngica e Toxicológica In Silico dos Enantiômeros
(R)-(+)- e (S)-(-)-citronelal
Atividades Antifúngica e Toxicológica In Silico dos Enantiômeros
(R)-(+)- e (S)-(-)-citronelal
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, em cumprimento aos requisitos necessários para a obtenção do título de MESTRE EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS, área de concentração: FARMACOLOGIA.
Orientadora: Profª. Drª. Edeltrudes de Oliveira Lima
Atividades Antifúngica e Toxicológica In Silico dos Enantiômeros
(R)-(+)- e (S)-(-)-citronelal
Banca examinadora
_________________________________________________
Profª. Drª. Edeltrudes de Oliveira Lima (Universidade Federal da Paraíba)
Orientadora
_________________________________________________ Prof°. Dr°. José Pinto de Siqueira Júnior
(Universidade Federal da Paraíba) Examinador Interno
_________________________________________________ Profª. Drª. Lindomar Farias Belém
A minha mãe, Inês Rodrigues e aos meus avos
Ninfa Rodrigues† e Antônio Sobrinho†, por todo amor,
dedicação e por sempre me incentivar a seguir em frente
procurando o melhor, mas sempre mantendo a
humildade por todos que estão a minha volta.
A minha noiva, Mabelle Almeida, pelo amor,
companhia, apoio e compreensão, que foram esseciais
meu coração, para compreender os segredos das ciências farmacológicas e afins.
A minha mãe Inês que em sua simplicidade amor e carinho mim ensinou o caminho
do conhecimento desde o berço. Te amo mãe, e te agradeço por ter mim apoiado nessa trajetória vitoriosa da minha vida, obrigado.
Aos meus avos maternos Ninfa Rodrigues e Antônio Soares (in memória), que
ainda em vida sempre mim apoiaram no sentido mais amplo do que possa significar essa palavra. E apesar de não estarem mais em nosso meio, mas tenho certeza que ficariam muito felizes por mais uma etapa concluída em minha vida.
Agradeço ao grande amor da minha vida Mabelle Almeida, pelo seu amor,
paciência e carinho.
Aos meus colegas de turma, e do Laboratório de Micologia; agradeço pela
cumplicidade, companheirismo, amizade e respeito durante esses dois anos. Em especial a
Daniele de F. Silva, Ana Luíza A. L. Pérez e a Profª. Fátima.
A minha orientadora, Profª. Edeltruldes de O. Lima pela oportunidade, orientação e
confiança em mim depositada. E ao Prof°. Abrahão A. de O. Filho que pacientemente me
instruiu na escrita e em toda estética dos artigos frutos desse trabalho. Com certeza levarei vocês na minha vida como exemplos de um bom caráter e de profissionais.
À Coordenação e aos funcionários do Programa de Pós-graduação em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos, pela competência, seriedade e apoio.
A CAPES e a UFPB pelo apoio financeiro e estrutural para o desenvolvimento deste
“Somente um principiante que não sabe nada sobre ciência diria que a ciência descarta a fé. Se você realmente estudar a ciência, ela certamente o levará para mais perto de Deus”
RESUMO
Medeiros, C. I. S Atividades Antifúngica e Toxicológica In Silico dos Enantiômeros (R)-(+)- e (S)-(-)-citronelal 2016. Dissertação (Mestrado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, área de concentração: Farmacologia) CCS/UFPB, João Pessoa.
A incidência de infecções fúngicas vulvovaginais aumentou dramaticamente ao longo das últimas décadas, constituindo assim a segunda causa mais comum de candidíase vulvovaginal (CVV) após a vaginose bacteriana diagnosticada em 40% das mulheres com corrimento vaginal. O aumento da resistência dos micro-organismos patógenos aos antimicrobianos existentes no mercado tem impulsionado a busca de novas alternativas terapêuticas, como os produtos naturais a base de plantas pertencentes a várias famílias do reino vegetal, como por exemplo a Poaceae e a Myrtaceae, que se apresentam como uma solução viável devido ao baixo custo e fácil acesso da população. Em destaque, as plantas do gênero Cymbopogon e
Eucalyptus constitui uma das principais fontes de moléculas biologicamente ativas, dentre elas os monoterpenos são detentores de um enorme potencial biológico de interesse humano. No entanto, as pesquisas de compostos derivados de plantas com propriedades farmacológicas devem sempre ser unida aos estudos toxicológicos, afim de se comprovar a ausência de malefícios destas substâncias ao organismo humano. Diante deste contexto, foi estudado a atividade biológica dos enantiômeros (R)-(+)- e (S)-(-)-citronelal contra cepas de C. albicans
e C. tropicalis oriundas de secreções vulvovaginais in vitro, bem como os parâmetros toxicológicos para a previsão da toxicidade oral teórica in silico. Para a realização dos estudos antimicrobianos in vitro; determinação da concentração inibitória mínima (CIM) bem como da concentração fungicida mínima (CFM), utilizou-se o teste de microdiluição. Também foi aplicada a técnica de disco-difusão em meio sólido para estudo comparativo do perfil de resistência/sensibilidade a antifúngicos utilizados na terapêutica da candidíase vulvovaginal isolados e associados aos monoterpenos em estudo. As CIM’s e as CFM’s dos enantiômeros
(R)-(+)- e (S)-(-)-citronelal para 90% das cepas fúngicas foram respectivamente (R)CIM 90%
16µg/mL e (R)CFM
90% 32 µg/mL; (S)CIM90% 64µg/mL e (S)CFM90% 128 µg/mL (forte atividade
antifúngica contra C. albicans e C. tropicalis). Foram constatados alta resistência de C. albicans ao fluconazol e ao itraconazol 12 (92.30%) das cepas testadas. Mas, essa resistência foi revertida em 9 (75%) e 7 (58.33%) respectivamente, quando em associação com o (R )-(+)-citronelal e em 6 (50%) em combinação com o (S)-(-)-citronelal. Além disso, também foi observado alta resistência de C. tropicalis a anfotericina B, itraconazol e miconazol. Porém a resistência foi revertida para a anfotericina B e para o itraconazol, resultado do efeito sinérgico em 2 (66.65%) das leveduras. Para o miconazol a resistência foi revertida em 3 (100%) das cepas para ambos os enantiômeros. Na análise in silico, ambos os enantiômeros apresentaram boa biodisponibilidade oral teórica, no entanto, um potencial irritante foi observado como possível efeito tóxico para estes monoterpenos. Em conclusão, estes resultados sugerem que os enantiômeros (R)-(+)- e (S)-(-)-citronelal apresentam efeito antimicrobiano, e que também exercem efeito modificador de atividade aos agentes antifúngicos quando em combinação. No entanto, embora tenha apresentado boa biodisponibilidade oral teórica, o perfil toxicológico variado sugere a necessidade em avaliar o risco-benefício desse composto na produção de um novo medicamento antifúngico, por realização de ensaios in vivo.
ABSTRACT
Medeiros, C. I. S. Antifungal and Toxicological Activities In Silico of (R)-(+)- and (S )-(-)-citronellal Enantiomers 2016. Dissertation (Master in Natural and Synthetic Products Bioactive, area of concentration: Pharmacology) CCS/UFPB, João Pessoa.
The incidence of vulvovaginal fungal infections has increased dramatically over the last decades, therefore being the second most common cause of vulvovaginal candidiasis (VVC) placed after bacterial vaginosis diagnosed in 40% of the women with vaginal discharge. The increasing resistance of micro-oganismos pathogens to existing antimicrobial market has driven the search for new therapeutic alternatives, such as natural herbal products belonging to various families of the plant kingdom, such as Poaceae and Myrtaceae, which are presented as a viable solution due to the low cost and easy access of the population. Highlighted, the genus Cymbopogon and the Eucalyptus plants is one of the main sources of biologically active molecules, among them the monoterpenes holds a huge biological potential of human interest. However, the research of plant-derived compounds with pharmacological properties must always be attached to toxicity studies in order to show the absence of these substances harm to the human body. Given this context, it has studied the biological activity of enantiomers (R)-(+)- and (S)-(-)-citronellal against C. albicans and C. tropicalis strains derived from in vitro vulvovaginal secretions, as well as the parameters toxicological to predict the theoretical oral toxicity in silico. To achieve the antimicrobial in vitro studies; determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) was used microdilution test. Also it was applied to disk diffusion technique on solid medium for comparative study of antifungal resistance/sensitivity profile used in the treatment of vulvovaginal candidiasis isolated and associated with monoterpenes studieds. The MIC's and MFC's of the (R)-(+)- and (S)-(-)-citronellal to 90% of fungal strains were respectively (R)MIC
90% 16μg/mL and (R)MFC90% 32μg/mL; (S)MIC90% 64μg/mL and (S)MFC
90% 128μg/mL (Strong antifungal activity against C. albicans and C. tropicalis). Were
observed high resistance of C. albicans to fluconazole and itraconazole 12 (92.30%) strains. However, this resistance was reversed in 9 (75%) and 7 (58.33%) respectively, when combined with (R)-(+)-citronellal and 6 (50%) in combination with (S)-(-)-citronellal. Furthermore, it was also observed C. tropicalis high resistance to amphotericin B, itraconazole and miconazole. However, the resistance was reversed to amphotericin B and itraconazole, as a result of the synergistic effect in 2 (66.65%) of yeast. For miconazole resistance was reversed in 3 (100%) of the strains for both enantiomers. In the in silico
analysis, both enantiomers have good oral bioavailability theoretically, however, a potential irritant was observed as possible toxic effect on these monoterpenes. In conclusion, these results suggest that the (R)-(+)- and (S)-(-)-citronellal have antimicrobial effect, and which also exert effect modifier activity when antifungal agents in combination. However, although presenting good oral bioavailability theoretically, the varied toxicological profile suggests the need to assess the risk-benefit of this compound in the production of a new antifungal drug, by conducting in vivo trials.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estruturas espaciais dos isômeros R e S do citronelal...09
5. 1 Study of the Antifungal Potential of (R)-(+)-citronellal and its Association with Therapeutic Agents Used in the Treatment of Vulvovaginal Candidiasis
Figura 1. Struture of Citronellal ((R)-3,7- dimethyloct-6-enal)………..26 Figure 2. Resistance profile and sensitivity of C. albicans front ketoconazole and in combination with (R)-(+)-CT, *p ≤ 0.05………. 31 Figure 3. Resistance profile and sensitivity of C. albicans front fluconazole and in combination with (R)-(+)-CT, *p≤ 0.05………. 32 Figure 4 Resistance profile and sensitivity of C. albicans front itraconazole and in combination with (R)-(+)-CT, *p≤ 0.05.……… 32 Figure 5. Resistance profile and sensitivity of C. albicans front miconazole and in combination with (R)-(+)-CT, *p≤ 0.05………. 33 5. 2 Sensitivity of the Candida albicans to the (S)-(-)-citronellal and association to four antifungal medications against vulvovaginal candidiasis isolates
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação das zonas de inibição dos antifúngicos em sensível (S) e resistente (R) segundo o CECON... 17
5. 1 Study of the antifungal potential of citronellal and the association to therapeutic agents of clinical importance used in the treatment of vulvovaginal candidiasis
Table 1. MIC90% values (µg/mL) of (R)-(+)-CT against C. albicans strains by broth
microdilution………... 29
Table 2. MFC90% values (µg/mL) of (R)-(+)-CT against C. albicansstrains………. 30
Table 3. Susceptibility testing of C. albicans strains to standard antifungal. Average diameters of halos expressed in (mm)………. 30 Table 4. Average diameters (in mm) of the test (R)-(+)-CT combination of patterns and antifungal against C. albicansin solid medium……….. 31
5. 2 Sensitivity of the Candida albicans to the citronellal and association to four antifungal medications against vulvovaginal candidiasis isolates
Table I. MIC90% values (µg/mL) of (S)-(-)-CT against C. albicans strains by broth………….. 49
Table II. MFC90% values (µg/mL) of (S)-(-)-CT against C. albicansstrains……….
49 Table III. Susceptibility testing of C. albicans strains to standard antifungal. Average diameters of halos expressed in (mm)………. 50 Table IV. Average diameters (in mm) of the test (S)-(-)-CT combination of patterns and antifungal against C. albicansin solid medium……….. 53 5. 3 Antifungal activity and study of the association of the enantiomer (R)-(+)-citronellal with amphotericin B, fluconazole, itraconazole and miconazole against C. tropicalis isolated from vulvovaginal secretions
Table 1. MIC values (µg/mL) of (R)-(+)-CT against C. tropicalis strains by broth
microdilution……… 66
5. 4 ACTIVITY ANTI-C. TROPICALIS AND EFFECTS OF THE COMBINATION OF (S)-(-)-CITRONELLAL WITH FOUR ANTIFUNGAL APPLIED IN VULVOVAGINAL CANDIDIASIS
Table 1: MIC values (µg/mL) of (S)-(-)-CT against C. tropicalis strains by broth
microdilution……… 81
Table 2: MFC values (µg/mL) of (S)-(-)-CT against C. tropicalis strains………. 81
Table 3: Susceptibility testing of C. tropicalis strains to standard antifungal. Average diameters of halos expressed in (mm)………. 82 Table 4: Average diameters (in mm) of the test (S)-(-)-CT combination of patterns and antifungal against C. tropicalis in solid medium………. 82 5. 5 Pharmacological and toxicological analysis of two enantiomers derived from citronellal monoterpene: An in silico approach
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-FC - 5-Fluorocitosina 5-FU - 5-Fluoracil
ADMET - Absorção, distribuição, metabolização, excreção e toxicidade AIDS - Síndrome da imunodeficiência adquirida
AMB - Anfotericina B
ASD - Ágar Saboraud Dextrose ASD - Ágar Sabouraud dextrose
ATCC - American Type Culture Collection
CCLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute CCS - Centro de Ciências da Saúde
CFM - Concentração Fungicida Mínima CFM - Concentração Fungicida Mínima CIM - Concentração Inibitória Mínima CIM - Concentração Inibitória Mínima CSD - Caldo Saboraud Dextrose CSD - Caldo Sabouraud dextrose CVV - Candidíase vulvovaginal
CVVR - Candidíase vulvovaginal recorrente DMSO - Dimetilsulfóxido
KET - Cetoconazol MCZ - Miconazol mL - mililitro mm - milímetro NY - Nistatina
PgPNSB - Programa de Pós-graduação em produtos Naturais e Sintéticos Bioativos q.s.p - Quantidade suficiente para
RNA - Ácido Ribonucleico
RPMI - Roswell Park Memorial Institute
SINITOX - Sistema Nacional de Informações Toxicológicas UFC - Unidade Formadora de Colônia
SUMÁRIO
RESUMO ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO ... 01
2 REFERENCIAL TEÓRICO ... 04
2.1 FUNGOS COMO PATOGÊNOS ... 04
2.2 PRODUTOS NATURAIS ... 08
2.3 TERPENOS E TERPENÓIDES ... 08
2.4 ESTUDOS DA TOXICIDADE DE PRODUTOS NATURAIS: UMA ABORDAGEM IN SILICO ... 10
3 OBJETIVOS ... 12
3.1 Objetivo Geral ... 12
3.2 Objetivos Específicos ... 12
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 14
4.1 LOCAL DA PESQUISA ... 14
4.2 OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DAS SUBSTÃNCIAS TESTES ... 14
4.3 ENSAIOS ANTIMICROBIANOS ... 14
4.3.1 Meios de Cultura ... 14
4.3.2 Cepas de Micro-organismos ... 15
4.3.3 Inóculo ... 15
4.3.4 Antifúngicos ... 15
4.3.5 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ... 16
4.3.6 Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) ... 16
4.3.7 Determinação do Perfil de Sensibilidade e/ou Resistência Antifúngica ... 17
4.3.8 Efeitos da Associação dos Monoterpenóides com os Antifúngicos... 17
4.4 ENSAIOS IN SILICO ... 18
4.4.1 Pass Online ... 18
4.4.2 Análises Teórica da Toxicidade e dos Parâmetros Farmacocinéticos dos Monoterpenóides (Osiris)... 19
4.4.3 Molinspiratio ... 19
1 INTRODUÇÃO
Os fungos são organismos eucarióticos, estruturalmente e metabolicamente semelhantes as células dos mamíferas e mais complexo do que as bactérias, com capacidade de invadir os tecidos dos hospedeiros e provocar infecções (SUN et al., 2014).
Dos fungos considerados como patógenos humanos, as espécies do gênero Candida
são os mais frequentemente recuperados nas infecções. Candida albicans éum dos principais fungos patogênicos de caráter oportunista, responsável por um amplo espectro de infecções que variam entre manifestações superficiais, a síndromes sistêmicas potencialmente fatais, especialmente em pacientes imunocomprometidos (SILVA, et al., 2012; LINARES et al., 2013).
Desta forma, a candidíase vulvovaginal (CVV) também denominada de vaginite por
Candida é uma infecção fúngica comum que afeta mulheres saudáveis de todas as idades, principalmente durante a idade reprodutiva (BEHZADI, RANJBAR, 2015).
Estima-se que 75% de todas as mulheres adultas experimentem pelo menos um período de episódios de CVV durante a vida, com 6 a 9% desses indivíduos desenvolvendo infecções recorrentes ou candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR) (FOXMAN et al., 2013; JACK, SOBEL, 2016). Felizmente a infecção é raramente fatal, mas normalmente está associada a algumas morbidades, tais como desconforto, dor, disfunções sexuais, secura vulvar, rachaduras, prurido, queimação, ulceração, corrimento vaginal anormal e finalmente custos de cuidados de saúde (DHARMIK, GOMASHE, UPADHYAY, 2013).
O principal agente etiológico da CVV é C. albicans, causando 85-95% destas infecções, mas outras espécies conhecidas geralmente como C. não-albicans (C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guillermondii) também são isoladas dessas infecções (AKORTHA, NWAUGO, CHIKWE, 2009; ILKIT, GUZEL, 2011).
O aparecimento de cepas resistentes aos medicamentos, reforça a necessidade de estudos desses patógenos, e à vigilância da suscetibilidade antimicrobiana é comumente usada na terapia e acompanhamento das rápidas mudanças nos padrões de resistência (KELEN et al., 2011; LATA et al., 2012).
substâncias majoritárias de óleos essenciais de plantas aromáticas, como as do gênero
Cymbopogon e Eucalyptus que apresentam essa propriedade (MONDELLO et al., 2006; SAMY, GOPALAKRISHNAKONE, 2008; BATUBARA et al., 2015).
Além disso, existe um interesse crescente na utilização de terapia de combinação que inclui o uso de combinações de substâncias sintéticas, bem como de produtos naturais juntamente com os medicamentos convencionais contra várias doenças infecciosas, tais como candidíase. Alguns óleos essenciais e fitoconstituintes são relatados para melhorar sinergicamente atividades de antibióticos como a anfotericina B, cetoconazol e fluconazol (ROSATO et al., 2008; WAGNER, ULRICH-MERZENICH, 2009).
Neste contexto, sabendo-se da importância da descoberta de produtos naturais com efeitos terapêuticos, buscou-se determinar a suscetibilidade antifúngica de cepas do gênero
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 FUNGOS COMO PATÓGENOS
Os fungos são micro-organismos eucarióticos desprovidos de pigmentação fotossintetizantes que possuem parede celular delgada composta basicamente por quitina e membrana plasmática fosfolipídica que contém vários esteróis, com predomínio do ergosterol (MAHTO et al., 2014).
Os fungos de interesse médico são de dois tipos morfológicos: as leveduras, que são unicelulares e fungos filamentosos que são multicelulares. As leveduras, de maneira geral, são unicelulares, esferoidais ou ovais (4-6µ m) e podem se reproduzir assexuada ou sexuadamente. Os fungos filamentosos são multicelulares, com células tubulares denominadas hifas, cujo conjunto é denominado micélio (ZAITZ et al., 2010).
Os fungos formam uma classe de micro-organismos que possuem reservatório ambiental e infecta indivíduos que são expostos a grandes quantidades do micro-organismo ou que são incapazes de montar uma resposta imunológica adequada. Os fungos que são patógenos podem ser divididos em duas classes gerais: patógenos primários e oportunistas. Patógenos primários são aqueles fungos que causam doenças em indivíduos imunocompetentes. Patógenos oportunistas causam infecções em pacientes que possuem o sistema imunológico comprometido, local ou sistemicamente (PFALLER et al., 2007).
A patogênese das infecções oportunistas envolve a produção de fatores de virulência inerentes ao micro-organismo, tais como: aderência, secreção de enzimas degradativas, comutação morfológica e formação de biofilmes que confere habilidade ao patógeno de colonizar e posteriormente causar a infecção, e que permite ao organismo do indivíduo ser comensal durante o período em que o sistema imunológico está normal (RIBEIRO, 2008; SANTANA et al., 2013). Quando o sistema imune se torna comprometido, os micro-organismos multiplicam-se mais facilmente em função da perda de efetividade das respostas imunes. Este crescimento desregulado pode levar a infecções invasivas. Alguns fungos são classicamente oportunistas, como
Cryptococcus neoformans, porém às vezes podem causar doenças em indivíduos
Coccidioides immitis, são muito mais virulentos em pacientes imunocomprometidos. Os patógenos oportunistas humanos têm ganhado importância nos últimos 20 anos, paradoxalmente por causa do sucesso da prática médica moderna, que aumenta o tempo de vida de pacientes debilitados e imunocomprometidos (ORTEGA et al., 2011).
Infecções graves causadas em sua maioria por fungos patogênicos oportunistas são cada vez mais comuns em pacientes imunocomprometidos (KHAN et al., 2010). Candida albicans é um dos principais patógenos fúngicos oportunistas de seres humanos, causando uma variedade de infecções em pacientes suscetíveis, que variam desde lesões mucosas até candidíase sistêmica com risco de morte, em pacientes imunocomprometidos, tais como pacientes com vírus da imunodeficiência humana (AIDS) e pacientes transplantados em terapia imunossupressora (JIN et al., 2010; SILVA et al., 2012).
Infecções de corrente sanguínea devido a Candida spp. são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes internados em todo o mundo. Candida albicans é a espécie mais comum que causa infecções invasivas por leveduras do gênero Candida, sendo associada com 70-90% dos isolados de candidemia e candidíase invasiva (HA et al., 2011). Além disso é classificada como a quarta causa mais comum de doença infecciosa adquirida em hospital e é associada com taxas de mortalidade de quase 50% (PFALLER; DIEKEMA, 2007).
A candidíase consiste em uma extensa variedade de síndromes clínicas causadas por um fungo do gênero Candida, constituído de aproximadamente 200 espécies diferentes de leveduras, que vivem normalmente nos mais diversos sítios corporais. Várias espécies de
Candida são colonizadoras da microbiota normal da pele, dos pulmões, do trato gastrointestinal e geniturinário. Como colonizantes, essas espécies não causam infecção a não ser que haja um desequilíbrio nos mecanismos de defesa ou fatores externos, como por exemplo, o uso de antimicrobianos, que podem alterar a microbiota normal. A infecção por
Candida acomete preferencialmente as crianças e as pessoas idosas, numa frequência de 5% dos recém-nascidos, 5% de pessoas com doenças neoplásicas e 10% dos pacientes idosos com saúde precária. Portanto a candidíase é mais frequente em pessoas nos extremos da idade (ACHKAR; FRIES, 2010; PEIXOTO et al., 2014).
ser infecciosas, porém com menor frequência como a Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida lusitaniae e Candida
guilliermondii (GIOLO; SVIDZINSKY, 2010; MELETIADIS; ROILIDES, 2013; PEIXOTO
et al., 2014).
A infecção por fungos, da vulva e da vagina é estimada como sendo a segunda causa mais comum de inflamação/infecção após a vaginose bacteriana diagnosticada em 40% das mulheres com corrimento vaginal. A candidíase vulvovaginal (CVV) afeta 75% de todas as mulheres pelo menos uma vez durante a vida, mais frequentemente durante a idade fértil (GANDHI, PATEL, JAIN, 2015). Outro grupo menor de mulheres 6-9% experimentam a recorrência desta enfermidade (CVVR), definida como pelo menos 3 episódios sintomáticos nos 12 meses anteriores, embora alguns investigadores exigi ainda um episódio adicional (FOXMAN et al., 2013; JACK, SOBEL, 2016). Embora várias espécies de Candida tenham sido implicadas na CVV e CVVR, Candida albicans é o agente etiológico predominante, causando 85-95% destas infecções (BEHZADI, RANJBAR, 2015).
A CVV pode manifestar-se de forma simples, com casos esporádicos de infecções leves causadas por C. albicans. Entretanto casos complexos ou complicados são causados por outras espécies do gênero Candida, infecção grave, CVV durante a gravidez e associada a outras condições médicas, como imunossupressão ou diabetes (LI et al., 2014). No entanto, é difícil avaliar a incidência exata de CVV devido à elevada taxa de uso indiscriminado de medicamentos. Além disso, o diagnóstico é frequentemente e inteiramente baseado em sinais e sintomas sem quaisquer testes diagnóstico para confirmar, e o tratamento depende se a infecção é complexa ou simples (DOVNIK, 2015).
A terapia antimicrobiana para infecções por Candida tornou-se um desafio, pois o tratamento é difícil devido à natureza eucariótica das células fúngicas, que são semelhantes às células hospedeiras (ALCZUK et al., 2015). Há poucos antifúngicos disponíveis para tratar infecções fúngicas. Infelizmente os azóis são geralmente fungistáticos, em vez de fungicida, e seu uso prolongado contribui para o desenvolvimento de resistência (KHAN et al., 2010; KENIYA et al., 2015).
parede celular do fungo, enquanto os fármacos antimetabólicos tem como alvo o RNA da célula fúngica (CHANDRASEKAR, 2011; ALCZUK et al., 2015).
A nistatina e a anfotericina B com suas formulações lipofilicas, são antifúngicos polienicos e se ligam aos esteróis (ergosteral, colesterol...), no entanto mostram especificidade pelo ergosterol um componente da membrana citoplasmática fúngica, formando poros, que aumentam a permeabilidade da membrana, o que leva à morte celular (CUENCA-ESTRELLA, 2010). Os azóis são a maior classe de antifúngicos sintéticos e são classificados em duas famílias conforme o número de átomos de nitrogênio presente em seu anel azol. Os imidazólicos, tais como o cetoconazol, miconazol e clotrimazol, possuem dois átomos de nitrogênio. Os triazólicos, como itraconazol, fluconazol e voriconazol, apresentam três átomos de nitrogênio em seu anel azol (MURRAY et al., 2014). Os azóis interrompem a biossíntese do ergosterol, por inibir a enzima lanosterol C-14α-demetilase e produzir o acúmulo de um produto tóxico para as células fúngicas denominado de 14-α-metilesterois e consequentemente inibem a replicação das células fúngicas. As equinocandinas tais como micafugina, caspofungina e anidulafungina, interferem com a síntese da parede celular
fúngica através da inibição não competitiva da síntese de β-1,3-D-glicano, um componente integral da parede celular fúngica, provocando um enfraquecimento da parede celular fúngica, lise e morte celular (KHAN et al., 2010; KENIYA et al., 2015). A flucitosina (5-fluorocitosina, 5-FC) pertencente à classe das pirimidinas, é o único antifúngico, antimetabólico, no qual sua ação, se dá pela conversão intracelular de fluorocitosina a 5-fluoracil (5-FU) no citoplasma, o qual é convertida em ácido 5-fluorídico que compete com uracil na síntese de RNA, gerando assim, RNA defeituoso, bloqueando o DNA e a síntese proteica (MURRAY et al., 2014).
Em consequência do aumento da resistência aos antifúngicos, é necessário o desenvolvimento de novos antifúngicos com ampla faixa de ação fungicida e poucos efeitos colaterais que limitem a dose (BARRET, 2002).
2.2 PRODUTOS NATURAIS
Plantas terrestres e marinhas, animais, fungos e bactérias (entre outros) são conhecidos por produzir uma multiplicidade de metabolitos secundários, geralmente referidos como produtos naturais. Estes possuem uma ampla diversidade molecular e diferentes atividades biológicas principalmente os recursos vegetais (MILLER, TSUKAMOTO, WILLIAMS, 2009; FINEFIELD et al., 2012).
O atual interesse por substâncias biologicamente ativas provenientes de plantas se deve a vários motivos, e os principais são: a ineficiência da medicina convencional (efeitos colaterais indesejaveis e terapias ineficazes) ou por uma grande parte da população não ter acesso ao tratamento farmacológico convencional, principalmente aos medicamentos de custos mais elevados. Em consequência dos custos elevados dos medicamentos e da baixa condição financeira de boa parte da população global, fazem com que haja interesse por terapias alternativas e o uso de produtos oriundos das plantas se tornem importantes aliados na prevenção e combate a doenças (FRIAS et al., 2011; MA et al., 2016).
No entanto, o uso potencial de plantas como fonte de drogas é ainda pouco explorado. Apenas uma pequena proporção das espécies de plantas estimadas tem sido investigada fitoquimicamente, e uma fração ainda menor têm suas propriedades farmacológicas estudadas. No Brasil, as plantas medicinais são amplamente usadas nas zonas rurais e urbanas. A maioria é usada de acordo com a tradição popular desenvolvidas pelos nativos ou trazida para o país pelos europeus, africanos e asiáticos (AGRA et al., 2008).
Dentre os compostos com atividade antimicrobiana extraídos de plantas estão os flavonóides, os taninos, os alcalóides, os terpenos e os óleos essenciais e seus fitoconstituintes (ROMANO et al., 2013).
2.3 TERPENOS E TERPENÓIDES
óleos voláteis, que variam entre dois grandes grupos de estruturas de baixo peso molecular: os terpenos e terpenóides (grupo I) e compostos aromáticos alifáticos (grupo II) (BAKKALLI et al., 2008).
Os terpenos são o grupo mais importante na composição dos óleos essenciais. São derivados biossinteticamente de condensações de unidade de isopreno C5a partir da via do ácido mevalônico. Os terpenos são classificados segundo a quantidade de unidades existente no seu esqueleto de carbono. Os terpenos mais frequentemente encontrados são monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15) e diterpenos (C20). No entanto, a partir do instante em que esses
contêm compostos de oxigênio na molécula, tais como grupos de hidroxilo, carbonila, cetona e aldeído, resultam em compostos denominados como terpenóides (BAKKALLI et al., 2008; LORENZI et al., 2009).
A atividade anti-Candida de óleos essenciais extraídos de plantas tem sido evidenciado em vários trabalhos nos últimos anos, e em consequência disso os óleos essenciais bem como alguns dos seus fitoconstituintes são usados topicamente na forma de cremes, géis e pessários para o tratamento de infecções microbianas (MONDELLO et al., 2006).
O fitoconstituinte citronelal, pertencente ao grupo dos monoterpenóides é uma das substâncias majoritárias de óleos essenciais de plantas aromáticas como as do gênero
Cymbopogon e Eucalyptus. O citronelal é isolado como uma mistura não-racémica dos enantiômeros R e S revelando ter inúmeras atividades biológicas, dentre elas ação antimicrobiana, antioxidante, herbicida, inseticida e repelente (Figura 1) (TOMAZ et al., 2014; BATUBARA et al., 2015).
(R) (S)
2.4 ESTUDOS DA TOXICIDADE DE PRODUTOS NATURAIS: UMA ABORDAGEM IN SILICO
O surgimento do conceito “natural” em muito contribuiu para o aumento do uso das
plantas medicinais nas últimas décadas. Para muitas pessoas esse conceito significa a
“ausência de produtos químicos”, que são aqueles que podem causar algum dano ou que, de
alguma forma, representam perigo. Assim, produtos naturais passaram a ser sinônimos de saudáveis, seguros e benéficos. Entretanto, esse conceito é extremamente equivocado, já que muitas plantas contêm substâncias capazes de produzir potencial toxicidade em organismos vivos (MENGUE et al., 2001; FERREIRA; PINTO, 2010; ZHANG et al., 2012).
Diante disso, é evidente a importância da avaliação do balanço entre a atividade farmacológica versus toxicidade de um determinado produto natural, como por exemplo um terpeno, para verificar sua aplicabilidade terapêutica.
Cerca de 50% das razões que levam à insuficiência do desenvolvimento de um fármaco estão associadas com o perfil farmacocinético e toxicológico. Assim, a determinação do perfil farmacocinético juntamente com a toxicidade (Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade) (ADMET) são parâmetros importantes na definição de biodisponibilidade e efeitos tóxicos de uma molécula, ajudando na redução do tempo e do custo do processo de investigação e desenvolvimento de novas drogas (HANSCH et al, 2004). Modelos de previsão assistida por computador, as chamadas ferramentas de previsão, desempenham um papel essencial no repertório proposto de métodos alternativos para a avaliação das características farmacológicas e toxicológicas de um composto, além de modelos in vitro. Por isso, essas ferramentas são usadas para estudar os compostos existentes e hipotéticas, que são rápidos, reprodutíveis e são normalmente baseados em biorreguladores humanos (ANGELO et al, 2006; SRINIVAS et al, 2014).
3 OBJETIVOS
3. 1 GERAL
Investigar a atividade antifúngica in vitro dos enantiômeros monoterpenicos (R)-(+)- e (S)-(-)-citronelal e os efeitos sinérgicos, antagônicos e indiferentes da associação com antifúngicos de uso clínico, bem como a atividade toxicológica in silico.
3.2 ESPECÍFICOS
Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos monoterpenos (R)-(+)- e (S )-(-)-citronelal frente as cepas de C. albicans e C. tropicalis oriundas de secreções vulvovaginais;
Determinar a Concentração Fungicida Mínima (CFM) dos monoterpenos (R)-(+)- e (S )-(-)-citronelal contra C. albicans e C. tropicalis;
Estudar o perfil de sensibilidade e/ou resistência das cepas fúngicas frente aos antifúngicos mais utilizados terapeuticamente na clínica médica para o tratamento da candidíase vulvovaginal;
Investigar os possíveis efeitos sinérgicos, antagônicos e indiferentes dos monoterpenos (R)-(+)- e (S)-(-)-citronelal em associação com antifúngicos de uso clínico;
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 LOCAL DA PESQUISA
Os ensaios referentes ao estudo da atividade antimicrobiana foram realizados no Laboratório de Micologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas (DCF), Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal da Paraíba (UFPB).
4.2 OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS TESTES
Para a realização dos estudos in vitro utilizaram-se os enantiômeros do monoterpeno citronelal [(R)-(+)-citronelal (pureza: 90 %) e (S)-(-)-citronelal (pureza: 96 %)]. Ambos os fitoconstituintes foram adquiridos da Sigma-Aldrich®, São Paulo, SP, Brasil.
Durante os procedimentos dos ensaios farmacológicos as substâncias testes foram solubilizadas em Tween 80 a 0.02 % e no dimetilsulfóxido (DMSO) em uma proporção que não exsedeu 0.5 % no ensaio e posteriomente diluída em água destilada esteril para alcançar a concentração inicial de 2048 μg/mL (NASCIMENTO et al., 2007; PEREIRA et al., 2014).
4.3 ENSAIOS ANTIMICROBIANOS
4.3.1 Meios de Cultura
Os meios de cultura utilizados nos ensaios de avaliação da atividade antimicrobiana foram o meio sólido ágar Sabouraud dextrose (ASD) adquirido da DifcoLaboratories, USA, com o meio líquido RPMI-1640-L-glutamina, sem bicarbonato de sódio, adquirido da Sigma-Aldrich®, Sao Paulo, SP, Brasil. O meio ágar Sabouraud dextrose (peptona 5 g, caseína 5 g,
4.3.2 Cepas de Micro-organismos
Para os ensaios de atividade antifúngica foi selecionado um total de 16 cepas fúngicas leveduriformes do gênero Candida as quais são causadoras de candidíase vulvovaginal, obtidas da coleção do Laboratório de Micologia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba. Treze cepas são da espécie
albicans e foram codificadas respectivamente como LM 852, LM 157, LM 152, LM 240, LM 0202, LM 246, LM 228, LM 227, LM 319, LM 16, LM 15 e três são da espécie tropicalis LM 665 e LM 255. Três cepas padrão da “American Type Culture Collection” (ATCC) também
foram utilizadas, C. albicans ATCC 76485, ATCC 76645 e C. tropicalis ATCC 13803. Todas as cepas foram mantidas em meio ASD a uma temperatura de 4 °C. Foram utilizados para os ensaios repiques de 24 horas incubados a 35±2°C.
4.3.3 Inóculo
Para a preparação do inóculo as culturas de micro-organismos foram semeadas em meio ASD inclinado e incubadas a 35±2 °C por 24-48 horas. Após a incubação foram transferidas cerca de 4-5 colônias de leveduras (com uma alça microbiológica estéril) para tubos de ensaios contendo 3.0 mL de solução salina estéril (NaCl 0.85%). Posteriormente cada suspensão teve sua turbidez ajustada e comparada à suspensão padrão do tubo 0.5 McFarland 1-5 x 106 Unidades Formadoras de Colônias/mL, (UFC/mL). Em seguida as
suspensões microbianas foram preparadas na proporção de 1:9 para obter-se um inóculo final de 105 UFC/mL (KONEMAN et al., 2008; OSTROSKY et al., 2008).
4.3.4 Antifúngicos
4.3.5 Determinações da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Os ensaios de atividade antifúngica foram realizados conforme os protocolos de Cleeland; Squires (1991), Hadacek; Greger (2000) e o NCCLS/CLSI (2002). A determinação da CIM dos monoterpenos sobre as cepas de Candida foi realizada através da técnica da microdiluição em caldo em placa para cultura de células (TPP/ SWITZERLAND/EUROPA) contendo 96 poços. Inicialmente foram distribuídos 100 μL de RPMI-1640-L-glutamina duplamente concentrado nos orifícios das placas de microdiluição. Em seguida, 100 μL da emulsão do produto teste duplamente concentrado foram dispensados nas cavidades da primeira linha da placa. E por meio de uma diluição seriada a uma razão de dois, foi obtido
concentrações de 1024 μg/mLaté 4 μg/mL. Por fim, foi adicionado 10 μL dos inóculos de C. albicans e C. tropicalis nas cavidades, onde cada coluna da placa refere-se a uma cepa fúngica especificamente. Paralelamente, foram realizados controles de viabilidade das leveduras com nistatina (100 UI/mL) como controle (droga padrão) e RPMI-1640-L-glutamina com inóculo das leveduras. As placas preparadas e assepticamente fechadas foram submetidas à incubação numa temperatura de 35±2 °C por 24-48 horas. A CIM foi definida como a menor concentração do produto capaz de produzir inibição visível sobre o crescimento fúngico verificado nos orifícios quando em comparação com seu controle. O
resultado foi expresso pela média aritmética das CIM’s obtidas nos ensaios realizados em duplicata.
A atividade antifúngica dos produtos foi interpretada e considerada como ativa ou inativa, conforme os seguintes critérios: (50-500 μg/mL) forte/ótima atividade; (600-1500
μg/mL) moderada atividade; acima de (1500 μg/mL) fraca atividade ou produto inativo
(HOLETZ et al., 2002; SARTORATTO et al., 2004; HOUGHTON et al., 2007).
4.3.6 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
Após leitura da CIM, alíquotas de 10 μL do sobrenadante das cavidades onde foi
em duplicata e o resultado expresso pela média aritmética das CFM’s obtidas nos dois ensaios
(ESPINEL-INGROFF et al., 2002).
4.3.7 Determinação do Perfil de Sensibilidade e/ou Resistência Antifúngica
A determinação do perfil de sensibilidade e/ou resistência das cepas fúngicas foram realizados com base na técnica de disco-difusão em meio sólido (BAUER, et al., 1966; KONEMAN et al., 1993; HADACEK; GREGER, 2000). Em placas de Petri descartáveis e estéreis, foram colocados 20 mL do meio ASD fundido a 50°C. Após a solidificação do meio e com o auxilio de Swab estéril, cerca de 1 mL de cada suspensão fúngica foram semeadas e em seguida os discos de antifúngicos CECON®, São Paulo, SP, Brasil foram depositados na
superfície do meio de cultura. Todo o sistema foi incubado a 35±2 °C por 24-48 h. Os ensaios foram realizados em duplicata e o resultado expresso pela média aritmética dos halos de inibição obtidos nos dois ensaios. A interpretação dos resultados dos halos de inibição foi classificada como sensível ou resistente segundo as especificações recomendadas pelo fabricante dos discos de antifúngicos e o CLSI, 2009 (Tabela 1).
Tabela 1. Classificação das zonas de inibição dos antifúngicos em sensível (S) e resistente (R) segundo o CECON.
4.3.8 Efeitos da Associação dos Monoterpenóides com os Antifúngicos
Para o estudo das interferências dos fitoconstituintes em associação com os antifúngicos foi aplicada a técnica de disco-difusão em meio sólido em que, uma alíquota de
10 μL dos fitoconstituintes na mesma concentração das CIM’s foram transferidas para os discos de antifúngicos. Posteriormente os discos foram depositados em placas de Petri estéreis contendo o meio ASD previamente inoculado com um volume aproximado de 1 mL das suspensões fúngicas. Em seguida as placas foram incubadas a 35±2°C por 24-48 h. Os ensaios
Antifúngicos Zona de inibição
Anfotericina B 100 µg ≤ 15 (R); 15 (S)
Cetoconazol 50 µg ≤ 20 (R); 20 (S)
Fluconazol 25 µg 20 (R); ≥ 20 (S)
Itraconazol 10 µg 20 (R); ≥ 20 (S)
foram realizados em duplicata e os resultados expressos pela média aritmética dos halos de interferências obtidos nos dois experimentos. (BAUER, et al., 1966; KONEMAN et al., 1993; DUTTA et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2006; OSTROSKY et al., 2008).
Os efeitos interferentes da combinação dos fitoconstituintes com os antifúngicos foram avaliados conforme a metodologia descrita por Cleeland e Squires (1991), onde os efeitos interferentes destas associações podem produzir um halo de inibição do crescimento microbiano igual ou superior a 2 mm quando comparados com o halo de inibição produzido pelo antifúngico isoladamente, o qual dar-se a denominação de efeito sinérgico. Quando a resultante da interferência da associação produzir um halo de inibição do crescimento menor ou igual a 2 mm quando em comparação com o halo produzido pelo antifúngico isoladamente, dar-se a denominação de efeito antagônico. A coincidência entre os halos de inibição do crescimento microbiano podem ocorrer quando são comparados os efeitos antifúngicos dos produtos. Quando não houver diferenças no tamanho do diâmetro dos halos de inibição entre os antifúngicos isolados e em combinação com os fitoconstituintes, dar-se-a à denominação de efeito indiferente.
4.4 ENSAIOS IN SILICO
4.4.1 Pass Online
4.4.2 Análises Teórica da Toxicidade e dos Parâmetros Farmacocinéticos dos Monoterpenóides (Osiris)
Para a análise da toxicidade teórica e dos parâmetros farmacocinéticos a estrutura dos monoterpenóides foram submetidos ao estudo in silico dos parâmetros (absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade) (ADMET) usando o programa Osiris Property Explorer (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/drugScore.html).
Nesta análise foram determinados o potencial de druglikeness e o drug-score que são relacionados a descritores topológicos, além de outras propriedades como cLogP e massa molecular (CHAND et al., 2011). A avaliação in silico da toxicidade de moléculas também incluiu a análise teórica de efeitos mutagênico, tumorigênico, irritante e sobre a reprodução como descrito por (ABREU, 2008).
Finalmente, como os monoterpenóides foram planejados para ser administrados por via oral e portanto devam ser capazes de ser absorvido no trato gastrintestinal. Foram avaliados de acordo com a “Regra dos Cinco” de Lipinski, que estabelece que pelo menos três
de quatro requisitos devam ser apresentados para que o composto possua uma boa biodisponibilidade oral teórica. Assim, os compostos para serem absorvidos devem possuir peso molecular ≤ 500 daltons (Da), coeficiente de partição octanol/água calculado (cLogP) ≤
5, número de aceptores de ligação hidrogênio (nALH) ≤ 10 e número de grupos doadores de ligação hidrogênio (nDLH) ≤ 5 (LIPINSKI et al., 2001; LIPINSKI et al., 2004).
4.4.3 Molinspiration
O drug likeness dos enantiômeros (R)-(+)- e (S)-(-)-citronelal foram calculados considerando o miLogP (coeficiente de partição), peso molecular, número de átomos pesados, número de aceptores de hidrogênio, número de doadores de hidrogênio, número de violações, número de ligações rotativas e volume molecular. A bioatividade dos compostos foi verificada por cálculos do índice de atividade de ligantes de GPCR, modulador de canais iônicos, ligantes de receptores nucleares, inibidor de cinase e inibidor de enzima com a ajuda do software (Ertl, Rohde, Selzer, 2000).
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos nos experimentos tiveram seus valores expressos em média ± erro padrão da média (e.p.m.) e analisados empregando-se o teste t de Student não pareado, para análise de duas colunas. Os resultados foram considerados significativos quando p ≤
5.1 Study of the Antifungal Potential of (
R
)-(+)-citronellal and its
Association with Therapeutic Agents Used in the Treatment of
Vulvovaginal Candidiasis
STUDY OF THE ANTIFUNGAL POTENTIAL OF (R)-(+)-CITRONELLAL AND ITS ASSOCIATION WITH THERAPEUTIC AGENTS USED IN THE TREATMENT OF
VULVOVAGINAL CANDIDIASIS
ESTUDO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DO (R)-(+)-CITRONELAL E SUA ASSOCIAÇÃO COM AGENTES TERAPÊUTICOS UTILIZADOS NO TRATAMENTO DA CANDIDÍASE VULVOVAGINAL
Medeiros CIS1*; Silva DF1; Pérez ALAL2; Almeida Filho GG3; Oliveira Filho AA1; Lima
EO1
1. Mycology Laboratory, Department of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brazil; 2. Department of Odontological Sciences, Federal University of Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brazil; 3. Department of Molecular Biology, Federal University of Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brazil.
*Correspondence; e-mail: cassioism@hotmail.com
Abstract
miconazole increased the inhibition zones of these antifungal drugs, reducing the resistance against C. albicans.
Keywords: Monoterpenoid, Anti-C. albicans, Antifungal agents, Secondary metabolites, citronellal
Resumo
Candidíase vulvovaginal (CVV) é uma infecção fúngica comum que afeta mulheres saudáveis de todas as idades. Pelo menos 75% das mulheres irão desenvolver uma ou mais infecções uma vez durante a vida, com 6 a 9% dos indivíduos desenvolvendo infecções recorrentes. Diante deste contexto, buscou-se avaliar neste estudo o potencial antifúngico do (R )-(+)-citronelal [(R)-(+)-CT] isolado e associado a agentes terapêuticos de importância clínica. O enantiômero foi solubilizado em Tween 80 e dimetilsulfóxido (DMSO). Posteriormente diluiu-se em água destilada estéril até a concentração de 2048µg/mL. A concentração inibitória mínima (CIM) do produto foi determinada por microdiluição em meio RPMI-1640 obtendo diluições de 4-1024µg/mL. A concentração fungicida mínima (CFM) foi determinada pela técnica de esgotamento em agar Sabouraud dextrose (ASD) a partir de alíquotas de 1mL da CIM, CIM × 2 e CIM × 4. A CIM e a CFM do (R)-(+)-CT para 90% das cepas de C. albicans foram 16 e 32µg/mL respectivamente. No ensaio de suscetibilidade, C. albicans
apresentou alta resistência ao fluconazol e ao itraconazol, 12 (92.30%) das cepas. No em tanto, para o cetoconazol e o miconazol a resistência foi de 4 (30.76%) e 3 (23.07%) das cepas respectivamente. No ensaio de combinação do (R)-(+)-CT com cetoconazol e miconazol, a resistência foi completamente revertida. Para o fluconazol e o itraconazol, a resistências foi revertida em 9 (75%) e 7 (58.33%) das cepas respectivamente. O (R)-(+)-CT apresentou atividade fungicida com CFM igual a CIM×2. Quando em combinação com cetoconazol, fluconazol, itraconazol e miconazol ampliou as zonas de inibição desses antifúngicos, diminuindo a resistência contra C. albicans.
Palavra-chave: Monoterpenoide, Anti-C. albicans, Agentes antifúngicos, Metabólitos secundários, citronelal
Introduction
additional episode (FOXMAN et al., 2013, JACK, SOBEL, 2016). Although various species of Candida have been involved in VVC and RVVC, Candida albicans is the predominant etiological agent, causing 85-95% of these infections (HONG et al., 2014, BEHZADI et al., 2015).
VVC can be manifested as a simple form, as sporadic cases of light infection caused by C. albicans. However, complex or complicated cases are caused by other species of the genus
Candida, and severe infections, VVC during pregnancy and associated to other medical conditions, such as immunosuppression or diabetes (LI et al., 2014). However, it is difficult to assess the exact incidence of VVC, due to the high rate of indiscriminate use of medicines. Furthermore, the diagnosis is frequently and entirely based on signs and symptoms without any diagnostic tests to confirm, and the treatment depends on whether the infection is complex or simple (BEHZADI et al., 2015, DOVNIK et al., 2015).
A variety of antifungal agents have been widely used to treat these infections. The azoles including the ketoconazole, fluconazole, itraconozole and miconazole have been used in a variety of therapeutic schemes for the treatment of VVC and RVVC (SEKHAVAT et al., 2011). However, due to the dynamics of antimicrobial resistance, which involves a complex association of multiple factors inherent to both the host and to the fungus itself, therapeutic failure has been significant (ESPINEL-INGROFF, 2008). Particularly, the azoles, the most common antifungal medication used in this disease, have been presenting an unfavorable picture (PFALLER, 2012).
The essential oils, a large group of secondary metabolites of plants involved in the defense processes and synthesized in response to microbes and plague attacks by herbivore insects, display excellent antimicrobial, insecticide, as well as anticancer activity (PICHERSKY, GERSHENZON, 2002). The terpenoids are condensation products of isoprene, containing 5 carbon atoms in its structure. Are important components of essential oils with vast biological activity (SAMY, GOPALAKRISHNAKONE, 2008, LORENZI et al., 2009). The
anti-Candida activity of essential oils extracted from plants has been reported in several scientific papers over the last years, and consequently the essential oils, as well as some of their phytoconstituents, are used topically in the form of creams, gels and pessaries for the treatment of microbial infections (MONDELLO et al., 2006).
natural products, together with conventional medicines against several infectious diseases, such as candidiasis. Some essential oils and phytoconstituents are reported to synergically improve the activity of antibiotics such as amphotericin B, ketoconazole and fluconazole (ROSATO et al., 2008, HEMAISWARYA et al., 2008, WAGNER, ULRICH-MERZENICH, 2009).
The phytoconstituent (R)-(+)-CT, belonging to the group of the monoterpenoids, is one of the major substances of essential oils of aromatic plants, such as the ones of the genus
Cymbopogon and Eucalyptus (AVOSEH et al., 2015, BATUBARA et al., 2015). The citronellal is isolated as a non- racemic mixture of the R and S enantiomers, and has shown to have several biological activities, among them, antimicrobial, antioxidant, herbicide, insecticide and repellent action (SCHERER et al., 2009, QUINTANS-JÚNIOR et al., 2011, BRITO et al., 2012, TOMAZ et al., 2014). In this context, it was aimed to assess the antifungal potential of the isolated (R)-(+)-CT, and associated to therapeutic agents of clinical importance frequently used in the treatment of the vulvovaginal candidiasis.
Material and Methods
Phytoconstituent, antifungal standards and substances
The following substances used in this work were obtained commercially: enantiomer (R )-(+)-CT [(3R)-3.7-dimethyloct-6-enal] (Figure 1), (Purity > 90%), dimethylsulfoxide (DMSO) and Tween-80 (0.02%) (all from Sigma-Aldrich, São Paulo, SP, Brazil). The Tween-80 and the DMSO were solubilized in a proportion that did not exceed 0.5% in the test, and was posteriorly diluted in sterile distilled water in order to reach the initial concentration of 2048 µg/mL (HOOD et al., 2003, BRUNI et al., 2004; NASCIMENTO et al., 2007; PEREIRA et al., 2014). Furthermore, ketoconazole, fluconazole, itraconazole and miconazole were respectively, purchased from Control Center and Products for Diagnosis (CECON) Ltd. (São Paulo, SP, Brazil).
Culture media
To test the biological activity of the products, Sabouraud dextrose broth (SDB) and Sabouraud dextrose agar (SDA) were purchased from Difco Laboratories (Detroit, MI, USA). Furthermore, RPMI-1640-L-glutamine (without sodium bicarbonate) (Sigma-Aldrich, São Paulo, SP, Brazil) culture media were used. They were prepared and used according to the
manufacturers’ instructions.
Fungal strains
The assays were performed with 13 strains of C. albicans: LM 852, LM 157, LM 152, LM 240, LM 0202, LM 246, LM 228, LM 227, LM 319, LM 16, and LM 15 (isolated from vaginal), and two standard C. albicans strains: ATCC 76485 and ATCC 76645. All strains belong to the collection of the Mycology Laboratory, Department of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Paraíba (LM, DCF, UFPB). These strains were maintained in SDA at 35±2 °C and 4 °C until used in tests.
Inoculum
The suspensions were prepared from recent C. albicans cultures, plated on SDA, and incubated at 35±2 °C for 24-48h. After incubation, was transferred roughly 4-5 yeast colonies (with a sterile loop) to test tubes containing 5.0 mL of sterile saline (NaCl 0.85%). The resulting suspensions were stirred for 15 seconds with the aid of a Vortex apparatus (Fanem Ltd., Guarulhos, SP, Brazil). The turbidity of the final inoculum was standardized using a barium sulfate suspension (tube 0.5 on the McFarland scale). The final concentration obtained was about 1-5 × 105 colony forming units per milliliter (CFU/mL) (KONEMAN et al., 2008;
OSTROSKY et al., 2008).
Determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC)
The determination of the products’ MIC on the thirteen strains used in the biological assays was determined by the broth microdilution method (CLEELAND, SQUIRES, 1991, HADACEK, GREGER, 2000, NCCLS/CLSI, 2002). One hundred microliters (100 µL) of liquid medium RPMI-1640 was transferred into the wells of a 96-well microdilution plate
suspension was added to each well of the plate, where each column represented a yeast strain. In parallel, controls were made for yeast viability and for susceptibility with the standard antifungal nystatin (100 IU/mL). The plates were incubated at 35±2 °C for 24-48 h. After the appropriate incubation time, the presence (or absence) of growth was observed visually. The
formation of cell clusters or “buttons” in the plate wells was considered. The MIC was
defined as the lowest (R)-(+)-CT concentration that produced visible inhibition of yeast growth.
The antimicrobial activity of the products was interpreted (considered active or not), according to the criteria proposed by Morales et al., 2008: strong/good activity (MIC: <100 µg/mL); moderate activity (MIC: 100-500 µg/mL); weak activity (MIC: 500-1000 µg/mL); and inactive product/no antimicrobial effect (MIC: >1000 µg/mL).
To determine the MFC, we subcultured 1 µL aliquots of MIC, MIC × 2 and MIC × 4 of the product, nystatin (100 IU/mL), and the control yeast growth onto Petri dishes containing SDA. After 24-48 hours of incubation at 35±2 °C, a reading was made to evaluate the MFC, as based on the growth of the controls. The MFC was defined as the lowest product concentration that inhibited growth of the yeast or permitted less than three CFUs to occur, resulting thus in 99.9% fungicidal activity (ERNST et al., 1996, ESPINEL-INGROFF, 2002). Biological activity assays were performed in duplicate, and the results were expressed as the arithmetic mean of the MIC and MFC.
Susceptibility assays
The fungal susceptibility test was carried out based on the disk-diffusion method in solid mean (BAUER, et al., 1966; KONEMAN et al., 1993; HADACEK, GREGER, 2000). In this test, the following antifungal medications were used: ketoconazole (50 µg), fluconazole (25 µg), itraconozole (10 µg) and miconazole (50 µg). The interpretation of the results was carried out using the sensitive or resistant criteria recommended by the (CECON) Ltd. (São Paulo, SP, Brazil) and the CLSI, 2009.
Combination studies in vitro
The susceptibility tests of the combination of (R)-(+)-CT with the antifungal agents were also carried out based on the disk-diffusion method in solid media (OLIVEIRA et al., 2006, OSTROSKY et al., 2008).
The interactions of the (R)-(+)-CT with the antifungal agents were considered as being
positive (synergism), when the inhibition zone of the combined application was (≥ 2 mm) in
relation to the antifungal medication alone, and as being negative (antagonism), when the
inhibition zone of the association was (≤ 2 mm) to the presented by the isolated antifungal medication and “ 0 interaction” (indifferent), when the inhibition zone of the combination
was the same as the antifungal medication alone (CUENCA-ESTRELLA, 2004, CLEELAND, SQUIRES, 1991).
The tests were carried out in duplicate and the results were expressed by the arithmetic mean of the diameters formed in the two tests in parallel.
Statistical analysis
For the statistical treatment the GraphPad Prism 6.0 software was used, and for the analysis
between the columns the Student’s t test was applied, and the results were considered
significant when p≤ 0.05.
Results
The results of the antifungal activity of the (R)-(+)-CT against the C. albicans strains were determined using the MIC and MFC by micro-dilution in broth. The MIC values of the (R )-(+)-CT varied between 32 and 16 µg/mL, however the latter corresponds to the inhibition of fungal growth in 90% of the tested strains (Table 1).
Table 1. MIC90% values (µg/mL) of (R)-(+)-CT against C. albicans strains by broth
microdilution.
Table 2. MFC90% values (µg/mL) of (R)-(+)-CT against C. albicans strains.
The results of the fungal susceptibility tests for C. albicans for the standard antifungal agents were determined by the disk-diffusion test in solid mean. The resistance profile was observed for 12 (92.30%) of the fungal strains to the fluconazole and to itraconazole. However, for ketoconazole and miconazole the resistance was of 4 (30.76%) and 3 (23.07%) of the strains respectively (Table 3).
Table 3. Susceptibility testing of C. albicans strains to standard antifungal. Average diameters of halos expressed in (mm).
Table 4. Average diameters (in mm) of the test (R)-(+)-CT combination of patterns and antifungal against C. albicans in solid medium.
Furthermore, it was also observed that for some of the strains previously resistant to isolated antifungal medications, became sensitive when faced with the combination of the phytoconstituent with the antifungal agents.
For ketoconazole, the strains that suffered exchange of profile from resistant to sensitive were
C. albicans LM 852, LM 157, LM 319 and LM 16 (Table 3, 4 and Figure 2).
Figure 2. Resistance profile and sensitivity of C. albicans front ketoconazole and in combination with (R)-(+)-CT, *p≤ 0.05.
Figure 3. Resistance profile and sensitivity of C. albicans front fluconazole and in combination with (R)-(+)-CT, *p≤ 0.05.
For the itraconazole, the effect of the combination with the phytoconstituent resulted in the change of the resistance profiles of the following yeasts: LM 852, LM 152, LM 0202, LM 246, LM 319, LM 16 and ATCC 76485 (Table 3, 4 and Figure 4).
Figure 4. Resistance profile and sensitivity of C. albicans front itraconazole and in combination with (R)-(+)-CT, *p≤ 0.05.
Figure 5. Resistance profile and sensitivity of C. albicans front miconazole and in combination with (R)-(+)-CT, *p≤ 0.05.
Discussion
The high incidence of infections by C. albicans and the emergence of resistance to the antifungal drugs accentuates the need of studying new sources of drugs, such as natural products and their phytoconstituents (LIMA et al., 2012).
Herbal substances are used in the treatment of several diseases, but their application as a potential source of new drugs is still very little exploited. Of the 250.000 to 500.000 plant species, only a small percentage have had, their pharmacological properties studied (RATES, 2001). Thus, the compounds derived from plants are potential sources of new and valuable therapeutic agents (TROMBETTA et al., 2005, SINGH et al., 2011). Therefore, the phytoconstituents are important, due to the various pharmacological activities such as the antifungal, antibacterial and antiparasitic (OLAGNIER et al., 2007, CARDOSO et al., 2010, ZORE et al., 2011a).
The terpenoids such as the (R)-(+)-CT, a major phytoconstituent of the essential oils of plants of the genus Cymbopogon and Eucalyptus presents excellent antifungal activity (AVOSEH et al., 2015, BATUBARA et al., 2015). In this study, it was observed that the (R)-(+)-CT showed excellent antifungal efficiency in 90% of the C. albicans strains. According to the criteria of Morales et al., 2008, this phytoconstituent showed strong anti-C. albicans activity because the value of the MIC90% was less than 100 µg/mL (MIC <100 µg/mL). In literature,
