UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação
ANDRÉ LUÍS MORÁS JUNIOR
DESENVOLVIMENTO, FABRICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BIOSSENSOR ÓPTICO BASEADO EM MICROCAVIDADES RESSONANTES ACOPLADAS
CAMPINAS 2017
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação
ANDRÉ LUÍS MORÁS JUNIOR
DESENVOLVIMENTO, FABRICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BIOSSENSOR ÓPTICO BASEADO EM MICROCAVIDADES RESSONANTES ACOPLADAS
Orientador: Prof. Dr. José Wilson Magalhães Bassani Coorientador: Prof. Dr. Newton Cesário Frateschi
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica da Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do título de Mestre em Engenharia Elétrica, na área de Engenharia Biomédica.
CAMPINAS 2017
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO ANDRÉ LUÍS MORÁS JUNIOR E ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ WILSON MAGALHÃES BASSANI
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura
Luciana Pietrosanto Milla - CRB 8/8129
Morás Junior, André Luís,
M796d MorDesenvolvimento, fabricação e caracterização de biossensor óptico
baseado em microcavidades ressonantes acopladas / André Luís Morás Junior. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.
MorOrientador: José Wilson Maglhães Bassani. MorCoorientador: Newton Cesário Frateschi.
MorDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação.
Mor1. Biossensores. 2. Microcavidades ópticas. I. Bassani, José Wilson Magalhães, 1953-. II. Frateschi, Newton Cesário, 1962-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Development, fabrication and characterization of optical biosensor
based on coupled microcavities
Palavras-chave em inglês:
Biosensors
Optical microcapsules
Área de concentração: Engenharia Biomédica Titulação: Mestre em Engenharia Elétrica Banca examinadora:
José Wilson Magalhães Bassani Lucas Heitzmann Gabrielli Gustavo Silva Wiederhecker
Data de defesa: 31-08-2017
Programa de Pós-Graduação: Engenharia Elétrica
COMISSÃO JULGADORA – DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Candidato: André Luís Morás Junior Data da Defesa: 31 de Agosto de 2017
Título da Tese: “Desenvolvimento, fabricação e caracterização de biossensor óptico baseado em microcavidades ressonantes acopladas”.
Prof. Dr. José Wilson Magalhães Bassani (Presidente, FEEC/UNICAMP) Prof. Dr. Gustavo Silva Wiederhecker (IFGW/UNICAMP)
Prof. Dr. Lucas Heitzmann Gabrielli (FEEC/UNICAMP)
A ata de defesa, com as respectivas assinaturas dos membros da Comissão Julgadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno
Agradecimentos
Agradeço primeiramente à minha família por todo o amor, carinho, paciência e gratidão dados, os quais foram cruciais nos momentos de maior pressão.
Agradeço à agência de fomento CNPq pela bolsa de estudo que tornou possível a realização deste trabalho, enfatizando a importância do apoio financeiro oferecido por essas agências para o desenvolvimento da pesquisa no país.
Agradeço aos meus orientadores prof. Dr. José Wilson Magalhães Bassani e prof. Dr. Newton Cesário Frateschi pela grande paciência e atenção, e também pela ótima orientação dada sempre em que eu precisei.
Agradeço aos pesquisadores Mário C. M. M. Souza, Antônio A. G.Von Zuben e Luis A. M. Barea pela grande colaboração.
Agradeço a todos os colegas de laboratório que participaram diretamente e indiretamente do desenvolvimento deste trabalho, lembrando que são tantas contribuições que se eu agradece um por um aqui, acabaria me esquecendo de alguém.
Por fim, agradeço ao Centro de Engenharia Biomédica (CEB), Departamento de Física Aplicada (DFA), Laboratório de Pesquisas em Dispositivos (LPD), Centro de Componentes Semicondutores (CCS) e Centro de Tecnologia e Informação Renato Archer (CTI) pelo oferecimento do apoio técnico de alta qualidade e de toda a infraestrutura necessária para a conclusão deste trabalho.
Resumo
Nas últimas décadas foi observado um grande interesse e avanço no desenvolvimento e fabricação de dispositivos de fotônica integrada para detecção analítica em diversas aplicações, tais como monitoramento ambiental, biotecnologia, diagnósticos clínicos e análises farmacêuticas. Nesse sentido, diversos tipos de dispositivos ópticos baseados em cavidades ressonantes de alto fator de qualidade têm sido propostos e utilizados como biossensores. No entanto, devido à grande sensitividade proveniente do alto fator de qualidade, esses dispositivos fotônicos também são altamente sensíveis a variações provocadas por perturbações ambientais, tais como, por exemplo, variações de temperatura; o que compromete sua confiabilidade. Nesse trabalho, é proposto utilizar um dispositivo baseado em duas cavidades ressonantes acopladas, uma interna no formato de disco e outra externa no formato de anel, para biosensoriamento. Nesse dispositivo, somente o disco interno é exposto ao meio ambiente e opera como elemento de detecção, porém, como ambos os ressonadores estão expostos à variações de temperatura, as ressonâncias do anel externo não exposto são utilizadas como parâmetro de referência. Assim, a instabilidade na resposta do sensor devida a perturbações ambientais, por exemplo, é reduzida significativamente. O dispositivo proposto foi fabricado, testado e caracterizado com soluções de etilenoglicol em água de diferentes concentrações. A sensibilidade RI (Refractive Index Sensitivity) e o limite de detecção RI (Refracive Index Limit Of Detection) obtidos foram, respectivamente, (26 ± 2) nm/RIU e (3,9 ± 0,2) RIU, com RIU (Refractive Index Units) dado em unidades de índice de refração. Além disso, a dependência da resposta do sensor com a temperatura é reduzida em aproximadamente 10 vezes quando a medição da resposta é realizada em relação ao parâmetro fixo conforme proposto. A partir da caracterização do dispositivo, também foi possível estimar que o biossensor desenvolvido deva ser capaz de detectar soluções proteicas tão baixas quanto 0,16 % de concentração em massa, particularmente para soluções de BSA em água.
Abstract
In the past decades there has been great interest and progress in the development of integrated photonic devices for analytic detection in many applications, such as environmental monitoring, biotechnology, clinical diagnosis and pharmaceutical analysis. Moreover, many types of optical devices based on high quality factor resonant cavities have been proposed and used as biosensors. However, due to the intrinsic high sensitivity related to the high quality factor, these photonic devices are also highly sensitive to environmental disturbances, for instance, temperature variations, which compromise the sensor reliability. In this work, we propose to use a device based on two coupled resonant cavities, one internal, a disk, and an external ring, for biosensing. In this device, the inner disk operates as the detection element, and, since both resonators are exposed to temperature variations, the resonances of the outer non-exposed ring are used as a referential parameter. Thereby, the instability of the sensor’s response due to environmental disturbances, for instance, is significantly reduced. The proposed device was fabricated, tested and characterized with solutions of ethylene glycol on water with different concentrations. The Refractive Index Sensitivity (RI Sensitivity) and Refractive Index Limit Of Detection (LOD) obtained were, respectively, (26 ± 2) nm/RIU and (3.9 ± 0.2).10-4 RIU, with RIU given by Refractive Index Units. Additionally, the sensor’s response to temperature was shown to reduced 10 fold when the response measurement was relative to the referential parameter. From the device characterization, it was also possible to theoretically estimate, using an empirical equation, that the developed biossensor should be capable of detecting protein solutions with concentrations as low as 0.16 % in weight, particularly for BSA aqueous solutions.
Lista de figuras
FIGURA 1.1 Ilustração dos princípios básicos de operação de ressonadores do tipo anel e disco ... 14 FIGURA 1.2 Espectro de transmissão dos dispositivos tipo anel ou disco ... 16 FIGURA 1.3 Dispositivo com duas cavidades acopladas ... 19 FIGURA 1.4 Detecção analítica de biossensores ópticos baseados em cavidades ressonantes ... 20 FIGURA 1.5 Dispositivo proposto para operar como biossensor ... 22 FIGURA 2.1 Ilustração geométrica de aplicação do método de elementos finitos para resolução de uma EDP qualquer em um espaço unidimensional ... 26 FIGURA 2.2 Ilustração do domínio e malha utilizados nas simulações do COMSOL ... 27 FIGURA 2.3 Resultados das simulações efetuadas no COMSOL para a cavidade disco ... 28 FIGURA 2.4 Resultados das simulações realizadas no COMSOL para a cavidade anel ... 29 FIGURA 3.1 Esquema de litografia óptica positiva seguida de corrosão e deposição ... 32 FIGURA 3.2 Fotos de um dos dispositivos disponíveis já com o disco interno exposto através de litografia óptica seguida de corrosão ... 33 FIGURA 3.3 Equipamento utilizado para polir o chip ... 34 FIGURA 3.4 Montagem experimental utilizada para medir o espectro de transmissão dos dispositivos ... 35 FIGURA 3.5 Fotos do material e capela utilizados nas preparações ... 37
FIGURA 4.1 Imagens de microscopia óptica do chip obtidas (a) aproximadamente 10 segundos antes e (b) após a aplicação de água deionizada pura sobre a superfície do chip ... 41 FIGURA 4.2 Desvios ressonantes relativos em função do tempo obtidos para água deionizada pura e soluções de etilenoglicol em água de 10, 15 , 20 e 25 % de concentração ... 41 FIGURA 4.3 (a) Espectro de transmissão obtido para água deionizada pura e soluções de etilenoglicol em água de 5, 10, 15, 20 e 25 % de concentração e (b) Desvio ressonante relativo, ou resposta do biossensor, em função do índice de refração da solução ... 42 FIGURA 4.4 Resposta do biossensor desenvolvido (pontos pretos) e temperatura no dispositivo (pontos vermelhos) em função do tempo ... 45 FIGURA 4.5 Resultados obtidos do segundo experimento com temperatura ... 46
Sumário
INTRODUÇÃO ... 12
CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS BÁSICOS ... 14
1.1 Princípios fundamentais de operação ... 14
1.2 Modelagem do problema ... 15 1.3 Espectro de transmissão ... 16 1.4 Detecção analítica ... 19 1.5 Funcionalização ... 20 1.6 Microfluídica ... 21 1.7 Proposta ... 22 1.8 Caracterização ... 23 1.9 Conclusão do capítulo ... 24 CAPÍTULO 2. SIMULAÇÕES ... 25
2.1 Métodos dos elementos finitos (FEM) ... 25
2.2 COMSOL Multiphysics ... 26
2.3 Resultados das simulações ... 27
2.4 Conclusão do capítulo ... 29
CAPÍTULO 3. METODOLOGIA ... 31
3.1 Fabricação dos guias e ressonadores ... 33
3.3 Corte e polimento do chip ... 33
3.4 Obtenção do espectro de transmissão ... 34
3.5 Preparação das soluções de etilenoglicol em água ... 36
3.6 Experimentos com soluções de etilenoglicol em água ... 37
3.7 Experimentos de temperatura ... 38
3.8 Conclusão do capítulo ... 38
CAPÍTULO 4. ANÁLISE DOS DADOS E RESULTADOS ... 40
4.1 Caracterização do biossensor ... 40
4.2 Influência da temperatura na resposta do biossensor ... 44
4.3 Conclusão do capítulo ... 47
CONCLUSÃO ... 49
Introdução
Métodos analíticos para identificação e determinação quantitativa e qualitativa de compostos bioquímicos têm sido largamente utilizados em diversas aplicações, tais como monitoramento ambiental, biotecnologia, diagnósticos clínicos e análises farmacêuticas. Em particular, existe uma grande demanda de dispositivos analíticos portáteis de rápida resposta e baixo custo para detecção de doenças cardiovasculares, atualmente principais responsáveis pela mortalidade adulta no mundo ocidental[1,2,3]. Nesse quesito, a proteína troponina I cardíaca (cTnI) por exemplo, além de ser uma ótima indicadora de lesões cardíacas, também é o biomarcador preferencial para o diagnóstico de infarto do miocárdio[1,2,4,5,6]. Esses métodos analíticos convencionais, apesar de bastante precisos, requerem tempo, um laboratório próprio e técnicos especializados para a aquisição e análise dos resultados. Nesse sentido, diversas técnicas e alternativas de diagnóstico clínico capazes de superar essas dificuldades estão sendo desenvolvidas pela comunidade científica. Dentre elas, biossensores ópticos baseados em cavidades ressonantes prometem todas as capacidades necessárias para uma tecnologia futura de microssistemas de detecção bioquímica, particularmente grande potencial de integração e fabricação em larga escala a baixo custo, capacidade de realização de ensaios múltiplos no mesmo chip e alta sensibilidade, especificidade e resolução[7-12].Por outro lado, esses dispositivos também são altamente sensíveis a perturbações provocadas por fatores ambientais, como por exemplo, variações de temperatura, o que compromete sua confiabilidade.
Nesse trabalho, um dispositivo biossensor baseado em cavidades ressonantes ópticas acopladas foi proposto, fabricado e caracterizado. Nesse dispositivo, somente o disco interno é exposto ao meio ambiente e opera como elemento de detecção, porém, como ambos os ressonadores estão expostos à variações de temperatura, as ressonâncias do anel externo não exposto são utilizadas como parâmetro de referência, o que reduz significativamente as flutuações provocadas por perturbações ambientais.
A influência da temperatura na resposta do biossensor desenvolvido foi investigada e analisada experimentalmente, e o dispositivo foi caracterizado com soluções de etilenoglicol em água de diferentes concentrações. A sensibilidade RI (Refractive Index Sensitivity) e o limite de detecção RI (Refractive Index Limit Of Detection) obtidos foram (25,61 ± 1,56) nm/RIU e (3,9 ± 0,2). 10−4 RIU, respectivamente, com RIU (Refractive Index Units) dado em unidades de índice de refração. Além disso, a partir da sensibilidade RI
obtida na caracterização do sensor, foi possível estimar, usando uma equação empírica, que o biossensor desenvolvido deva ser capaz de detectar soluções proteicas de até 0,16 % de concentração em massa, em particular para soluções de BSA em água.
Assim, no primeiro capítulo dessa dissertação, os princípios básicos de operação e os parâmetros fundamentais para detecção e caracterização dos dispositivos propostos serão apresentados. Em seguida, no segundo capítulo, as simulações efetuadas e seus resultados serão exibidos e discutidos. No terceiro capítulo, as etapas de fabricação e pós-processamento dos dispositivos propostos e a metodologia dos experimentos realizados serão apresentadas e explicadas. Por fim, no último capítulo, os resultados obtidos serão mostrados e analisados.
Capítulo 1: Fundamentos básicos
Nesse capítulo, os princípios fundamentais de operação de cavidades ressonantes em forma de anel e disco serão inicialmente apresentados, destacando o que se observa no espectro de transmissão desses dispositivos e quais os parâmetros importantes que podem ser obtidos. Em seguida, serão mostradas as principais diferenças observadas quando acoplamos duas dessas cavidades entre si, enfatizando as vantagens que podem ser obtidas desse acoplamento. Logo após, os princípios de detecção analítica de cavidades ressonantes serão explicados e a importância da funcionalização e implementação microfluídica em biossensores será rapidamente discutida. Por fim, será apresentado o tipo de dispositivo proposto para biosensoriamento, destacando os parâmetros envolvidos na detecção e o procedimento de caracterização adotado.
1.1 Princípios fundamentais de operação
Os princípios básicos de operação de ressonadores do tipo anel e disco estão ilustrados na Figura 1.1. Inicialmente, um laser sintonizável é alinhado à entrada do guia de alimentação (bus waveguide), enquanto o espectro de transmissão do dispositivo é registrado por um Analisador de Espectro Óptico (OSA) posicionado na saída do guia de alimentação. Na região de acoplamento, uma porção da potência de entrada é acoplada à cavidade ressonante por meio da componente evanescente do campo eletromagnético propagante no guia, e o restante da potência é transmitido diretamente para o analisador de espectro. Nessas condições, certas frequências, denominadas frequências de ressonância, sofrem interferência construtiva dentro da cavidade aumentando consideravelmente a potência intracavitária do dispositivo.
Figura 1.1: Ilustração dos princípios básicos de
operação de ressonadores do tipo anel e disco. O anel e o guia de alimentação estão destacados pelas cores violeta e azul, respectivamente. A área ampliada corresponde à região de acoplamento. Nas frequências de ressonância da cavidade, ocorre um aumento considerável da potência intracavitária do dispositivo. Figura alterada de [13].
Os comprimentos de onda associados às frequências ressonantes da cavidade são dados por[8]:
𝜆𝑟𝑒𝑠 =𝐿𝑛𝑒𝑓
𝑚 , 𝑚 = 1,2,3, … (1.1)
onde λres refere-se ao comprimento de onda do modo ressonante de ordem m, nef é o índice de
refração efetivo associado ao modo ressonante excitado da cavidade, e 𝐿 = 2𝜋𝑅 corresponde ao comprimento do ressonador, com R sendo o raio do anel ou disco. Aqui, é importante observar que as ressonâncias da cavidade dependem tanto da geometria quanto do material do ressonador. A geometria está diretamente associada ao comprimento L e o material indiretamente relacionado ao índice de refração efetivo nef.
1.2 Modelagem do problema
O dispositivo ilustrado na Figura 1.1, composto basicamente de uma cavidade anel acoplada a um guia de alimentação, pode ser modelado por meio do método proposto por Yariv em [30]. A partir deste método, pode-se obter as seguintes expressões para a potência transmitida na saída do guia de alimentação (𝑃𝑇) e a potência na cavidade após uma volta completa (𝑃𝑐𝑎𝑣):
𝑃𝑇 = |𝐸𝑇|2 = 𝐴2+𝑡2−2𝐴𝑡 cos 𝜃
1+𝐴2𝑡2−2𝐴𝑡 cos 𝜃 (1.2)
𝑃𝑐𝑎𝑣 = |𝐸𝑐𝑎𝑣|2 = 𝐴2(1−𝑡2)
1−2𝐴𝑡 cos 𝜃+𝐴2𝑡2 (1.3)
Nas expressões acima, |𝐸𝑇|2 e |𝐸𝑐𝑎𝑣|2 correspondem ao módulo quadrado do campo elétrico na saída do guia de alimentação e na cavidade, respectivamente, 𝑡 refere-se a um parâmetro de acoplamento relacionado à fração da potência de entrada que é transmitida através do anel na região de acoplamento, e 𝐴 representa o coeficiente de perdas do anel. Aqui é importante comentar que 𝐴 é uma constante real que está relacionada com o coeficiente de atenuação de potência 𝛼, dado em [1/cm], através da expressão
𝐴 = 𝑒−𝛼𝐿 (1.4)
lembrando que 𝐿 representa o perímetro do anel. Pode-se observar da expressão 1.4 que o aumento das perdas internas da cavidade, isto é, aumento do parâmetro 𝛼, corresponde à
diminuição da atenuação. De fato, o parâmetro 𝐴 assume o valor unitário quando as perdas na cavidade são nulas (𝛼 = 0).
Além disso, 𝜃 na equação 1.3 corresponde ao desvio de fase sofrido pelo campo elétrico propagante após uma volta completa no anel, e pode ser obtido através da seguinte relação:
𝜃 =𝜔𝐿
𝑐 = 𝑘𝑛𝑒𝑓𝐿 = 2𝜋𝑛𝑒𝑓𝐿
𝜆 (1.5)
onde 𝑘 = 2𝜋 𝜆⁄ é o número de onda.
Por fim, é importante comentar que, na dedução das expressões 1.2 e 1.3, as perdas de acoplamento entre o anel e o guia de alimentação não são consideradas, e que a norma do campo elétrico na entrada do guia de alimentação é unitária.
1.3 Espectro de transmissão
O espectro de transmissão dos dispositivos tipo anel ou disco, dado pela equação 1.2, apresenta vales característicos nos comprimentos de onda ressonantes da cavidade conforme mostrado na Figura 1.2. Basicamente, na condição de ressonância, quase toda a potência de entrada é acoplada ao ressonador, resultando nestes vales característicos do espectro, isto é, a potência transmitida é praticamente nula. Por outro lado, fora das ressonâncias, quase toda a potência de entrada é transmitida diretamente ao analisador de espectro e a potência transmitida é praticamente máxima.
Figura 1.2: Espectro de
transmissão dos dispositivos tipo anel ou disco. Estão destacados em vermelho os parâmetros principais da cavidade ressonante. EF: fator de extinção, λres: comprimento de
onda ressonante, FSR: espaçamento espectral livre, Δλ: largura de linha. Figura alterada de [13].
Além disso, é possível determinar os parâmetros principais da cavidade por meio de seu espectro de transmissão. São eles: (i) os comprimentos de onda ressonantes λres, (ii) a
largura de linha Δλ associada a cada ressonância, isto é, largura à meia altura da ressonância, (iii) o espaçamento espectral livre (Free Spectral Range) FSR, que corresponde à distância entre duas ressonâncias consecutivas do mesmo modo da cavidade, o fator de extinção (Extinction Factor) EF, que se refere basicamente à profundidade dos vales ressonantes, a
Finesse, definida como o quociente entre o FSR e a largura de linha ∆𝜆, e o fator de qualidade ou fator Q, dado por:
𝑄 =𝜆𝑟𝑒𝑠
Δ𝜆 (1.6)
O fator de qualidade pode ser considerado o parâmetro mais importante de cavidades ressonantes. De certa forma, ele representa a eficiência da cavidade em armazenar energia e seu valor está intimamente associado à sensibilidade e resolução de biossensores, isto é, cavidades de alto fator-Q resultam em sensores com alta sensibilidade e resolução.
A partir da expressão 1.3 e da aproximação cos 𝜃 ≈ 1 −∆𝜃2
2 , válida somente para pequenas variações em torno da frequência ressonante (𝜃𝑟𝑒𝑠± ∆𝜃 ≈ 𝜃𝑟𝑒𝑠), pode-se concluir que
∆𝜃2 =(1−𝐴𝑡)2
𝐴𝑡 (1.7)
Assim, usando a equação 1.7 e tomando o diferencial da expressão 1.5 com relação a 𝜆 pode-se chegar à seguinte relação para a largura de linha das ressonâncias:
∆𝜆 =𝜆𝑟𝑒𝑠2 (1−𝐴𝑡)
𝜋𝑛𝑒𝑓𝐿√𝐴𝑡 (1.8)
Analisando a expressão 1.8, pode-se concluir que a diminuição do parâmetro de atenuação 𝐴, o que pode ocorrer por exemplo devido ao aumento das perdas internas da cavidade (vide eq. 1.4), provoca o aumento da largura de linha ∆𝜆 da ressonância, ou seja, quanto maior for as perdas internas da cavidade, maior será o alargamento do vale ressonante. Esse resultado é mais evidente assumindo 𝐴 ≈ 1 − 𝛼, com 𝛼 ≈ 0 representando as perdas internas da cavidade. Nesse caso, a expressão 1.8 torna-se
∆𝜆 = 𝜆𝑟𝑒𝑠2 𝜋𝑛𝑒𝑓𝐿[( 1−𝑡 √𝑡) + 𝛼 2( 1+𝑡 √𝑡)] (1.9)
e assim fica claro que o aumento das perdas internas da cavidade provoca um aumento proporcional na largura de linha das ressonâncias.
Substituindo 1.8 em 1.6, tem-se ainda que
𝑄 =𝜆𝑟𝑒𝑠 ∆𝜆 =
𝜋𝑛𝑒𝑓𝐿√𝐴𝑡
𝜆𝑟𝑒𝑠(1−𝐴𝑡) (1.10)
Pode-se observar da equação 1.10 que o fator de qualidade da cavidade é diretamente proporcional ao comprimento do anel/disco, sugerindo que cavidades de maiores dimensões resultam em alto fatores de qualidade. No entanto, isso não é necessariamente verdade, pois ao aumentar o tamanho da cavidade, também estamos aumentado as perdas internas do dispositivo, o que contribui para a redução do fator-Q.
Quando acoplamos dois ressonadores de raios distintos é possível observar algumas diferenças no espectro de transmissão do dispositivo (Figura 1.3). Primeiramente, os vales ressonantes de ambas as cavidades interna e externa aparecem no espectro. Segundo, o formato dos vales ressonantes das cavidades são ligeiramente distintos, com a cavidade interna apresentando um vale mais estreito. Isso implica que a cavidade interna apresenta um fator de qualidade maior do que a cavidade externa, já que o fator-Q é inversamente proporcional à largura de linha do vale ressonante (eq. 1.6). De fato, o fator-Q é maior na cavidade interna fundamentalmente devido ao fato da cavidade interna apresentar menor perda extrínseca para o guia de alimentação quando comparada à cavidade externa, justamente por não estar em contato direto com o guia de alimentação conforme pode ser observado na figura. Além disso, nessa nova condição, quando a ressonância da cavidade interna encontra-se próxima à ressonância da cavidade externa, ambos os modos ressonantes passam a interferirem entre si, gerando modos acoplados (ou supermodos), os quais encontram-se em posições espectrais distintas quando comparados à posição espectral dos modos individuais que os geraram.
Figura 1.3: Dispositivo com duas cavidades acopladas. (a) Ilustração do dispositivo; (b) Espectro de
transmissão do dispositivo de duas cavidades. Os vales ressonantes da cavidade interna e externa, assim como seus respectivos fatores de qualidade, estão destacados em vermelho e azul, respectivamente. Figura alterada de [14].
1.4 Detecção analítica
A detecção do analito alvo em biossensores ópticos baseados em cavidades ressonantes acontece basicamente da seguinte maneira. Conforme ilustrado na Figura 1.4a, a própria presença das moléculas do analito alvo altera o índice de refração (𝑛0) adjacente ao ressonador no meio externo, consequentemente induzindo uma variação no índice de refração efetivo (𝑛𝑒𝑓) experienciado pelo campo eletromagnético do modo ressonante excitado na cavidade. Dessa forma, a alteração no índice de refração efetivo provoca uma variação proporcional nos comprimentos de onda ressonantes da cavidade (eq. 1.1), o que resulta em um deslocamento dos vales ressonantes no espectro de transmissão do dispositivo (Figura 1.3b). Esse deslocamento espectral é proporcional à concentração do analito alvo e pode ser obtido pela seguinte relação:
∆𝜆𝑟𝑒𝑠= ∆𝑛𝑒𝑓𝐿
𝑚 , (𝑚 = 1, 2, 3, … ) (1.11)
com ∆𝑛𝑒𝑓 representando a alteração no índice de refração efetivo associada à ligação das moléculas do analito alvo.
Figura 1.4: Detecção analítica de biossensores ópticos baseados em cavidades ressonantes. (a) Ilustração do
modo óptico propagante na cavidade (corte longitudinal). (b) Ilustração da resposta espectral do sensor devido à interação com as moléculas do analito alvo. Figura retirada de [8].
De fato, ao considerarmos a dispersão do material do ressonador, a alteração do índice de refração efetivo proveniente da ligação do analito alvo provoca uma mudança do comprimento de onda ressonante da cavidade que, por sua vez, induz uma nova alteração no 𝑛𝑒𝑓 devido à dispersão não nula do material (𝜕𝑛𝑒𝑓⁄𝜕𝜆 ≠ 0). Assim, considerando o efeito da dispersão do material somente até a primeira ordem, a equação 1.11 se torna[27]:
∆𝜆𝑟𝑒𝑠 =∆𝑚𝑜𝑙𝑛𝑒𝑓𝜆𝑟𝑒𝑠
𝑛𝑔 (1.12)
onde 𝑛𝑔 = 𝑛𝑒𝑓− 𝜆0𝑑𝑛𝑒𝑓
𝑑𝜆 refere-se ao índice de grupo e ∆𝑚𝑜𝑙𝑛𝑒𝑓 = ( 𝜕𝑛𝑒𝑓
𝜕𝜆 ) ∆𝑛𝑚𝑜𝑙 à alteração do índice de refração efetivo provocada exclusivamente pela ligação das moléculas do analito alvo.
1.5 Funcionalização
A funcionalização de biossensores refere-se basicamente ao processo físico-químico realizado sobre o dispositivo que deverá garantir que somente as biomoléculas do analito alvo se ligarão à região de sensibilidade do sensor, isto é, serão reconhecidas pelo biossensor. Nesse processo, a superfície do dispositivo geralmente é tratada fisicamente e bioquimicamente por diversos agentes em diferentes etapas. Além disso, a funcionalização está diretamente relacionada com a especificidade do biossensor, assim como exerce grande influência sobre a sensibilidade do dispositivo por aumentar a concentração do analito alvo próxima a superfície do sensor. Por isso, trata-se de uma etapa muito importante no desenvolvimento de biossensores. Ademais, é importante comentar aqui que o próprio
tratamento de funcionalização da região de sensibilidade do sensor induz variações no modo do campo eletromagnético propagante na cavidade, consequentemente alterando a posição de suas ressonâncias no espectro de transmissão. Nesse sentido, é possível monitorar o procedimento completo de funcionalização através do espectro de transmissão do biossensor. Aqui, Janissen e colaboradores apresentam um protocolo simples e eficiente para funcionalização de peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos[15]. Resumidamente, o procedimento completo consiste em quatro etapas fundamentais, (i) pré-ativação da superfície a ser funcionalizada por meio da geração de grupos silanóis na superfície, (ii) geração de grupos aminos sobre a superfície do dispositivo como pontos de enxerto, (iii) ligação de um vinculador poli(etilenoglicol) (PEG) com um grupo carboxílico pré-ativado em uma de suas terminações e, (iv) acoplamento de biomoléculas do analito alvo por meio de ligação peptídica.
1.6 Microfluídica
Um problema chave relacionado ao desenvolvimento de biossensores ópticos de dimensões micrométricas refere-se ao processo de coleta e distribuição das soluções envolvidas em suas aplicações. Nesse sentido, é necessário desenvolver e implementar uma maneira efetiva para levar poucos microlitros de solução até as proximidades da cavidade ressonante onde a detecção efetivamente ocorre, ou região de sensibilidade do biossensor. Uma forma de resolver esse problema, usualmente empregada por pesquisadores, é integrar ao dispositivo canais e bombas microfluídicas[16-20]. Usando componentes da microfluídica, é possível criar uma rede de distribuição de líquidos sobre um chip contendo diversos ressonadores, estabelecendo uma porta de entrada e saída e controlando o fluxo dos fluídos[21]. Assim, além de garantir a interação efetiva entre a solução em análise e a cavidade ressonante de detecção, o que pode aumentar consideravelmente a sensibilidade do dispositivo, e diminuir o tempo de resposta do sensor, a integração microfluídica também facilita o procedimento de funcionalização.
No entanto, a integração microfluídica pode ser extremamente complexa dependendo do material e dimensões do chip onde se encontra os biossensores. Nesse sentido, deve haver uma boa afinidade química entre o material onde deseja-se integrar os canais microfluídicos e o material da camada onde os próprios canais se encontram, principalmente com a finalidade de evitar vazamentos desnecessários de líquidos. Além disso, quanto menor for a área total disponibilizada para integração microfluídica, mais complicado é o processo,
pois para haver uma integração eficiente, a área de contanto entre a camada onde se encontram os canais, geralmente feita de Polidimetilsiloxano (PDMS), e a superfície do dispositivo deve ser maior do que um limite pré-determinado, o qual pode ser obtido por meio de sucessivos testes de adesão da camada microfluídica e vazamento de líquidos realizados sobre amostras para teste de dimensões variadas. O valor esperado para esse limite geralmente é da mesma ordem de grandeza das dimensões do chip onde os biossensores se encontram. 1.7 Proposta
Nesse trabalho é proposto desenvolver e caracterizar um dispositivo biossensor baseado em duas cavidades ressonantes acopladas, uma interna no formato de disco e outra externa no formato de anel (Figura 1.5a). Nesse dispositivo, somente a cavidade interna é exposta ao meio ambiente e opera como elemento de detecção. A cavidade externa, não exposta ao meio ambiente, funciona como um elemento de referência. Dessa forma, durante o processo de detecção, somente os vales ressonantes do disco interno deverão sofrer um desvio devido à interação com as moléculas do analito alvo, enquanto que os vales ressonantes do anel externo, não exposto, deverão permanecer fixos (Figura 1.5b).
Figura 1.5: Dispositivo proposto para operar como biossensor. (a) Ilustração do dispositivo. Em azul e
vermelho estão destacadas as cavidades anel (externa) e disco (interna), respectivamente. Somente o disco é exposto ao meio ambiente. (b) Espectro de transmissão do dispositivo durante a detecção. Estão destacados em azul e vermelho os vales ressonantes associados à cavidade externa e interna, respectivamente. Somente o vale ressonante do disco (ressonância de detecção) sofre desvio, enquanto que os vales do anel (ressonâncias de referência) permanecem fixos. Também estão destacados na figura os parâmetros de detecção ∆𝜆𝑖𝑛𝑖, ∆𝜆𝑓𝑖𝑛 e ∆𝜆𝑟𝑒𝑠. 𝑛𝑠𝑖𝑛𝑖e 𝑛𝑠
𝑓𝑖𝑛
correspondem ao índice de refração da solução antes e após a detecção, respectivamente. Figura alterada de [14].
Aqui, alguns parâmetros de detecção podem ser definidos. As distâncias relativas inicial ∆𝜆𝑖𝑛𝑖 e final ∆𝜆𝑓𝑖𝑛, que correspondem à distância espectral entre o vale ressonante do
anel (ressonância de referência) e do disco (ressonância de detecção), respectivamente antes e após a detecção, são dadas por:
∆𝜆𝑖𝑛𝑖 = 𝜆𝑖𝑛𝑖− 𝜆𝑟𝑒𝑓 e ∆𝜆𝑓𝑖𝑛 = 𝜆𝑓𝑖𝑛− 𝜆𝑟𝑒𝑓 (1.13) onde 𝜆𝑟𝑒𝑓 corresponde ao comprimento de onda da ressonância de referência e 𝜆𝑖𝑛𝑖 e 𝜆𝑓𝑖𝑛 aos comprimentos de onda inicial e final da ressonância de detecção, respectivamente.
A partir desses dois parâmetros pode-se definir o desvio ressonante relativo ∆𝜆𝑟𝑒𝑠, que corresponde basicamente à resposta do biossensor. O desvio ressonante relativo é dado por:
∆𝜆𝑟𝑒𝑠= ∆𝜆𝑓𝑖𝑛− ∆𝜆𝑖𝑛𝑖 (1.14)
Aqui, é importante destacar que, como o desvio ressonante relativo é determinado a partir de dois parâmetros relativos à mesma referência, os erros associados a flutuações nas medidas provenientes de perturbações ambientais, como por exemplo, variações na temperatura, são reduzidos consideravelmente. Além disso, o desvio ressonante será tanto maior quanto maior for a concentração do analito alvo na solução em análise.
Antes de iniciar a próxima seção, é importante salientar ainda que, se a ressonância de detecção encontrar-se muito próxima de alguma das ressonâncias da cavidade externa, poderá ocorrer interferência entre elas e consequente geração de supermodos. Nessa condição, pode ocorrer um desvio espectral da ressonância de detecção associado exclusivamente a essa interferência. Esse desvio não está incluído na expressão 1.13 e pode alterar a resposta do sensor.
1.8 Caracterização
O dispositivo biossensor proposto pode ser caracterizado por meio da sua sensibilidade RI e limite de detecção RI[22], que correspondem respectivamente à magnitude da resposta do sensor a variações do índice de refração da solução em análise e à variação mínima do índice de refração da solução que o dispositivo é capaz de detectar. No caso do dispositivo proposto, a sensibilidade RI (𝑆𝑅𝐼) e o limite de detecção RI (𝐿𝐷𝑅𝐼) podem ser determinados através das seguintes relações:
𝑆𝑅𝐼 = ∆𝜆𝑟𝑒𝑠
∆𝑛𝑠 (nm/RIU) e 𝐿𝐷𝑅𝐼 =
𝑅𝑒𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜
onde ∆𝑛𝑠= 𝑛𝑠𝑓𝑖𝑛− 𝑛𝑠𝑖𝑛𝑖 corresponde à variação do índice de refração da solução durante a detecção.
Aqui é importante destacar que existem várias formas de caracterizar biossensores, dependendo do tipo do dispositivo proposto para sensoriamento e que, no caso de biossensores ópticos baseados em cavidades ressonantes, a sensibilidade RI e o limite de detecção RI são os parâmetros mais relevantes para comparação do desempenho entre esses dispositivos.
1.9 Conclusão do capítulo
Neste capítulo, os princípios fundamentais para compreensão dos dispositivos propostos para biosensoriamento foram apresentados e discutidos. Neste sentido, inicialmente os princípios básicos de operação de um dispositivo composto de uma cavidade anel ou disco acoplada a um guia de alimentação foi apresentado, enfatizando o que é observado em seu espectro de transmissão e quais os parâmetros que podem ser obtidos deste espectro. Em seguida, foi mostrado o que acontece no espectro de transmissão do dispositivo e quais as principais diferenças observadas, quando acoplamos internamente a ele outra cavidade disco ou anel. Logo após, os fundamentos básicos de detecção analítica foram explicados e os conceitos de funcionalização e integração microfluídica foram introduzidos, destacando a importância de ambas essas etapas no que diz respeito ao desenvolvimento de biossensores. Por fim, o tipo de dispositivo proposto para biosensoriamento foi apresentado, definindo e destacando seus parâmetros de detecção e caracterização.
Dessa forma, no próximo capítulo, a resposta do dispositivo biossensor proposto, ou desvio ressonante relativo, será estudada em detalhes em função do índice de refração da solução na região de sensibilidade do dispositivo por meio de simulações numéricas e computacionais. Essas simulações, além de fornecer informações sobre a distribuição do campo elétrico do modo ressonante excitado na cavidade de detecção, permitirão estimar a sensibilidade RI esperada pelo biossensor proposto no trabalho.
Capítulo 2: Simulações
O objetivo principal das simulações foi obter a sensibilidade RI esperada do dispositivo biossensor proposto no trabalho para posterior comparação com os resultados experimentais. Nesse sentido, foi utilizado o software COMSOL Multiphysis, o qual baseia-se fundamentalmente no método de elementos finitos (FEM), para simular a frequência de ressonância do modo transversal elétrico (TE) fundamental da cavidade interna em forma de disco do dispositivo, responsável pela detecção analítica, em função do índice de refração da solução em análise. Sendo assim, nesse capítulo, inicialmente os princípios fundamentais do método de elementos finitos serão introduzidos e explicados sucintamente. Logo depois, as simulações realizadas no COMSOL serão exibida e, por fim, os resultados obtidos dessas simulações serão apresentados e discutidos.
2.1 Método dos elementos finitos (FEM)
O método dos elementos finitos é basicamente uma ferramenta numérica comumente utilizada para resolver problemas de engenharia e física matemática que envolvem equações diferenciais parciais (EDP) difíceis ou até mesmo impossíveis de serem resolvidas analiticamente[23,24]. Resumidamente, o método consiste em aproximar a EDP por um conjunto de equações numéricas, as quais podem ser facilmente resolvidas em um computador através de métodos numéricos. Assim, a combinação linear das soluções dessas equações numéricas é na verdade, uma aproximação da solução real da EDP.
Para ilustrar o método, suponha que 𝑇(𝑥) é uma função dependente da variável x em uma EDP qualquer. Considere também que a função 𝑇(𝑥) representa a temperatura na posição x em uma barra metálica que é aquecida de forma não uniforme. Pelo método dos elementos finitos, a função 𝑇(𝑥) pode ser aproximada por uma função 𝑇ℎ(𝑥) que é dada pela combinação linear de funções de base 𝜓𝑖(𝑥).
𝑇(𝑥) ≈ 𝑇ℎ(𝑥) = ∑ 𝑇𝑖 𝑖𝜓𝑖(𝑥) (2.1)
onde 𝑇𝑖 corresponde ao coeficiente da função de base 𝜓𝑖. Essa aproximação pode ser entendida como uma discretização do domínio da EDP em subdomínios mais simples denominados elementos finitos.
A Figura 2.1 representa uma ilustração geométrica de aplicação do FEM para o problema em questão para 𝑖 variando de 0 a 11. Na figura, pode-se observar que as funções de base escolhidas assumem o valor unitário em seus respectivos nós e zero nos outros nós, de tal forma que o valor de 𝑇 em um nó qualquer 𝑖 é equivalente ao coeficiente 𝑇𝑖 da base 𝜓𝑖. Dessa forma, nesse caso, basta encontrar os valores de 𝑇𝑖 e substituir na equação 2.1 para obter uma solução aproximada do problema. Além disso, pode-se observar também que as funções de base escolhidas nesse exemplo representam triângulos, e que o espaçamento entre os nós é menor na região de aclive da curva de temperatura (curva azul), o que resulta em uma melhor aproximação da solução real nessa região. Nesse sentido, funções de bases retangulares, quadradas ou com outras formas geométricas e diferentes espaçamentos entre nós poderiam ser escolhidos, dependendo do problema em questão, o que pode ser considerado como uma vantagem deste método.
Figura 2.1: Ilustração geométrica de
aplicação do método de elementos finitos para resolução de uma EDP qualquer em um espaço unidimensional. A função 𝑇 (curva azul) é aproximada pela função 𝑇ℎ
(curva vermelha tracejada), que é dada por uma combinação linear de funções de base 𝜓𝑖 (curvas pretas) de coeficientes 𝑇𝑖.
Figura alterada de [25].
2.2 COMSOL Multiphysics
Conforme comentado na introdução deste capítulo, o software COMSOL Multiphysics foi utilizado para obtenção da frequência de ressonância do modo TE fundamental da cavidade disco do dispositivo biossensor em função do índice de refração da solução. Para essa finalidade, foi necessário utilizar somente o modo de estudo de ondas eletromagnéticas no domínio da frequência fornecido pelo programa. Basicamente, nesse modo de estudo, o programa resolve a equação de Helmholtz para o campo elétrico na geometria de uma cavidade ressonante qualquer através do método de elementos finitos e calcula o valor das frequências de ressonância dos modos suportados por essa cavidade. A
Figura 2.2 representa o domínio simulado no COMSOL e a malha utilizada para aplicação do FEM.
Figura 2.2: Ilustração do domínio e malha utilizados nas simulações do COMSOL. (a) Domínio simulado no
programa. O domínio simulado corresponde somente à região de sensibilidade do biossensor, ilustrada no canto superior direito da figura. 𝑛𝑠𝑜𝑙, 𝑛𝑆𝑖 e 𝑛𝑆𝑖𝑂2 representam os índices de refração da solução em análise, do
silício e sílica, respectivamente. (b) Malha utilizada pelo programa para aplicação do FEM. A malha é composta de elementos triangulares e mais refinada sobre a cavidade disco.
Na figura, é importante observar que somente a região onde efetivamente ocorre a detecção analítica foi simulada. Essa região é denominada região de sensibilidade do biossensor, que no caso desse trabalho corresponde à região onde a cavidade disco de silício se encontra. Aqui, a frequência de ressonância do modo TE fundamental do disco depende do índice de refração 𝑛𝑠𝑜𝑙 da solução em análise, que por sua vez depende da concentração do analito alvo. Assim, para cada valor de 𝑛𝑠𝑜𝑙 simulado, foi obtido um comprimento de onda 𝜆𝑟𝑒𝑠 para o modo TE fundamental da cavidade disco. A Figura 2.2b corresponde à malha utilizada pelo programa para aplicação do método de elementos finitos. Nesse caso, pode-se observar que a malha utilizada é composta de elementos triangulares e é mais refinada na região compreendida pela cavidade disco, onde é esperado encontrar o modo fundamental. Além disso, esse refinamento da malha na região compreendida pelo disco permitiu simular o valor da frequência de ressonância do modo fundamental com uma precisão de quatro casas decimais.
2.3 Resultados das simulações
Os resultados das simulações encontram-se na Figura 2.3. A Figura 2.3a corresponde à simulação do modo TE fundamental do disco interno quando o índice de
refração da solução 𝑛𝑠𝑜𝑙 é igual a 1,3365. Pode-se observar que o modo TE fundamental encontra-se localizado na extremidade do disco e ainda que, nesse caso, a frequência de ressonância obtida equivale a 1,9177x1014 Hz. A mesma simulação foi repetida para diferentes índices de refração da solução e, a partir das frequências de ressonância encontradas, foi possível obter o gráfico da Figura 2.3b. Dessa forma, a sensibilidade RI esperada foi determinada através do ajuste linear dos pontos do gráfico. Aqui, os valores de índice de refração da solução utilizados foram determinados por meio da equação empírica obtida de [26], a qual relaciona o índice de refração de algumas soluções aquosas com sua concentração em massa. Nesse sentido, a própria equação permite utilizar a precisão de quatro casas decimais no valor do índice de refração.
Figura 2.3: Resultados das simulações efetuadas no COMSOL para a cavidade disco. (a) Simulação do modo
ressonante TE fundamental do disco interno de detecção para 𝑛𝑠𝑜𝑙= 1,3365. O disco simulado tem 5 μm de
raio e 220 nm de altura. A escala de cores corresponde à norma do campo elétrico. (b) Ressonância simulada em função do índice de refração da solução. O coeficiente angular da reta ajustada corresponde à sensibilidade RI do dispositivo e equivale a 28,45 nm/RIU.
Para efeito de comparação, as mesmas simulações foram realizadas para uma cavidade anel no lugar da cavidade disco. Os resultados obtidos encontram-se na Figura 2.4. Em analogia à figura anterior, a Figura 2.4a corresponde à distribuição espacial da norma do campo elétrico do modo TE fundamental na região de sensibilidade do biossensor, particularmente quando 𝑛𝑠𝑜𝑙 é igual a 1,3431, e a Figura 2.4b representa o gráfico da ressonância obtida nas simulações em função do índice de refração da solução. Aqui, a sensibilidade RI também foi determinada através do ajuste linear dos pontos do gráfico e o valor obtido foi de 59,86 nm/RIU, pouco mais do que duas vezes maior daquele obtido para a cavidade disco (28,45 nm/RIU). A sensibilidade RI do dispositivo é maior para a cavidade
anel porque, neste caso, conforme pode ser observado comparando-se as Figuras 2.3a e 2.4a, também existe contribuição da parede interna (parede esquerda na figura) da cavidade para efeitos de detecção, isto é, a sobreposição espacial entre o modo TE fundamental e a região compreendida pela solução em análise é maior na cavidade anel do que na cavidade disco. Por outro lado, é esperado que a resolução do dispositivo para o anel seja maior (i. e. pior), visto que, nesse caso, existe uma contribuição maior de perdas internas na cavidade devido justamente à parede interna do anel. Assim, das equações 1.19, apesar da maior sensibilidade RI, é esperado que o biossensor baseado em uma cavidade anel apresente um limite de detecção pior do que aquele baseado em uma cavidade disco.
Figura 2.4: Resultados das simulações realizadas no COMSOL para a cavidade anel. (a) Modo ressonante TE
fundamental simulado para 𝑛𝑠𝑜𝑙= 1,3431. O anel simulado tem 5 μm de raio externo, 450 nm de comprimento
e 220 nm de altura. A escala de cores representa a norma do campo elétrico. (b) Ressonância simulada em função do índice de refração da solução em análise. O coeficiente angular da reta ajustada corresponde à sensibilidade RI do dispositivo e, nesse caso, equivale a 59,86 nm/RIU.
Aqui, é importante salientar que, apesar das simulações terem sido realizadas somente para a cavidade interna e não para o dispositivo inteiro, o qual também envolve uma cavidade anel externa e um guia de alimentação, a resposta do biossensor proposto depende unicamente das ressonâncias do disco interno de detecção. Logo, os resultados das simulações efetuadas também valem para o dispositivo real proposto.
2.4 Conclusão do capítulo
Neste capítulo, o valor esperado para a sensibilidade RI do dispositivo biossensor proposto no trabalho foi obtido por meio de sucessivas simulações realizadas no software COMSOL Multiphysics. Nesse sentido, inicialmente, o problema a ser resolvido e simulado,
referente particularmente a obtenção dos comprimentos de onda ressonantes da cavidade interna de detecção, foi apresentado e resolvido analiticamente usando diversas considerações e aproximações teóricas para facilitar os cálculos. Em seguida, o método de elementos finitos, utilizado pelo COMSOL, foi introduzido e explicado sucintamente através de um exemplo analítico mais simples. Depois de entender melhor o FEM, as simulações efetuadas no COMSOL foram apresentadas, dando particular ênfase para a estrutura e malha utilizadas nessas simulações. Por fim, os principais resultados obtidos das simulações, relativos à distribuição espacial da norma do campo elétrico e comprimento de onda ressonante em função do índice de refração da solução, ambos simulados para o modo TE fundamental do disco de detecção, foram mostrados e discutidos rapidamente. Aqui, o valor obtido para a sensibilidade RI do biossensor proposto foi de 28,45 nm/RIU, isto é, um desvio ressonante de 28,45 nanômetros por cada incremento unitário no índice de refração da solução em estudo. Além disso, as mesmas simulações foram realizadas para uma cavidade interna de detecção no formato de anel ao invés de disco e, para esse caso particular, a sensibilidade RI obtida foi de 59,86 nm/RIU, mais do que duas vezes maior do que aquela obtida para o disco. Conforme comentado, esse resultado é decorrente do fato de que no anel existe maior sobreposição e interação entre o campo elétrico do modo TE fundamental da cavidade e a região de sensibilidade do biossensor. Por outro lado, da mesma forma que a parede interna do anel contribui para um aumento da sensibilidade do sensor, ela também contribui para o aumento das perdas internas do dispositivo e consequente aumento do limite de detecção.
Assim, no próximo capítulo, referente basicamente à metodologia experimental, as principais etapas de fabricação e pós-processamento dos dispositivos biossensores serão introduzidas e explicadas detalhadamente. Nesse sentido, algumas fotos de microscopia óptica e eletrônica dos sensores fabricados também serão mostradas e discutidas. Além disso, a bancada e procedimento experimental para medição do espectro de transmissão dos dispositivos fabricados e as metodologias dos experimentos realizados neste trabalho serão apresentadas em detalhes.
Capítulo 3: Metodologia
Neste capítulo, inicialmente serão mostradas e explicadas as quatro etapas fundamentais de fabricação e pós-processamento dos dispositivos propostos, particularmente (i) fabricação dos guias e ressonadores por meio de litografia óptica seguida de corrosão e deposição, (ii) abertura das janelas para exposição do disco interno de detecção, (iii) corte e (iv) polimento do chip. Na segunda parte do capítulo, o procedimento e bancada experimental para medição do espectro de transmissão serão apresentados e, em seguida, a metodologia dos experimentos realizados no trabalho será exibida em detalhes.
3.1 Fabricação dos guias e ressonadores
A fabricação dos guias e ressonadores de interesse é geralmente feita sobre uma plataforma de silício sobre isolante (Silicon On Insulator, SOI) por meio de litografia óptica, seguida de corrosão e deposição. Um processo típico está esquematizado na Figura 3.1 e consiste basicamente na transferência de um padrão projetado em uma máscara para a superfície da plataforma SOI.
Inicialmente, um fotoresiste (polímero sensível à luz ultravioleta) é espalhado sobre a superfície da plataforma SOI através de um Spinner (Figura 3.1b). Aqui, a espessura do fotoresiste espalhado é determinada pela velocidade e tempo de rotação do Spinner. Em seguida, a máscara projetada e fabricada é alinhada sobre o fotoresiste aplicado e exposta à luz ultravioleta, provocando a sensibilização do resiste nas regiões de interesse (Figura 3.1c-d). Essa etapa do processo é denominada exposição e é efetuada em uma fotoalinhadora. Aqui, o tempo de exposição é um parâmetro extremamente importante. Depois, as regiões sensibilizadas do resiste são removidas através da aplicação de um revelador (Figura 3.1e). O fator determinante dessa etapa, conhecida como revelação, é o tempo de revelação, de forma que, um tempo abaixo do ideal não remove totalmente o resiste sensibilizado e acima do ideal resulta na remoção indesejada de resiste não sensibilizado. Após a remoção do fotoresiste sensibilizado, a amostra é submetida a um processo de corrosão seletiva, resultando na remoção do silício somente nas regiões de interesse (Figura 3.1f). Essa etapa é denominada de corrosão ou etching e pode ser feita de diferentes maneiras. Por fim, o resiste restante, não sensibilizado, é removido com acetona e dióxido de silício (SiO2) é depositado sobre a amostra, preenchendo completamente os espaços vazios (Figura 3.1g-h). É importante salientar que o processo descrito acima corresponde à litografia óptica positiva. A litografia
óptica negativa, apesar de ser muito parecida com a positiva, apresenta algumas diferenças peculiares.
Apesar do Laboratório de Pesquisas em Dispositivos (LPD) e o Centro de Componentes Semicondutores (CCS), ambos localizados na Unicamp, terem instrumentação e condições tecnológicas suficientes para a fabricação dos guias e ressonadores de interesse, os dispositivos são geralmente fabricados na foundry Europractice, localizada na Bélgica e especializada nesse tipo de fabricação, devido principalmente ao fato desses processos sobre SOI serem bem conhecidos e estabelecidos, tanto na literatura quanto nas empresas, e da excelente qualidade e precisão oferecidas pela empresa. No entanto, é importante salientar aqui que o procedimento de litografia óptica descrito na Figura 3.1 não é necessariamente o mesmo utilizado pela foundry Europractice.
Figura 3.1: Esquema de litografia óptica positiva seguida de corrosão e deposição. a) Plataforma SOI crua. b)
Espalhamento do fotoresiste. c) Alinhamento da máscara. d) Exposição à luz ultravioleta. e) Revelação. f) Corrosão. g) Remoção do resiste restante. h) Deposição de SiO2.
3.2 Exposição do disco interno de detecção
O mesmo processo de litografia óptica seguido de corrosão foi proposto para expor somente a cavidade interna do dispositivo. Nesse sentido, o aluno foi devidamente treinado pelo físico de processos em fabricação Antônio A. Von Zuben no procedimento de litografia óptica e corrosão descrito na Figura 3.1. Apesar disso, é importante salientar que a cavidade interna do dispositivo medido pelo aluno nesse trabalho já encontrava-se exposta,
tornando desnecessária a realização dessa etapa. Essa exposição foi realizada pelo aluno de Doutorado Mário C. M. M. Souza na University of California San Diego (UCSD), localizada nos Estados Unidos. A Figura 3.2a abaixo é uma imagem de microscopia óptica de um desses dispositivos disponíveis já com o disco interno exposto. A Figura 3.2b corresponde a uma imagem de microscopia eletrônica com mais detalhes da região exposta. Nessa figura, é possível observar que as regiões de acoplamento entre o disco interno e o anel externo, e entre o anel externo e os guias de alimentação, não foram expostas, principalmente porque a proposta do trabalho foi de utilizar somente o disco interno do dispositivo como elemento de detecção. Além disso, pode-se observar que, de fato, o disco interno não foi completamente exposto ao meio ambiente, o que contribui para a redução da sensibilidade do sensor, dado que, nessas condições, ocorre menor sobreposição entre o modo da cavidade e a região de sensibilidade.
Figura 3.2: Imagens de um
dos dispositivos disponíveis já com o disco interno exposto através de litografia óptica seguida de corrosão.
(a) Imagem de microscopia
óptica. (b) Imagem de microscopia eletrônica mais detalhada da região exposta.
3.3 Corte e polimento do chip
Na verdade, vários tipos distintos de dispositivos de outros pesquisadores do grupo são fabricados sobre a mesma plataforma SOI crua a fim de economizar tempo e reduzir os gastos. Por esse motivo, é necessário realizar o corte do chip nas regiões de interesse para separar os dispositivos desejáveis dos demais. Esse corte geralmente é realizado no Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer (CTI) por uma máquina de alta resolução (Disco DAD321) que utiliza uma lâmina de níquel de precisão micrométrica. Basicamente, o chip é colocado sobre um filme altamente adesivo, alinhado e cortado pela lâmina anular refrigerada por água.
Após o corte, é necessário polir a entrada e saída do guia de alimentação dos dispositivos para reduzir as perdas de acoplamento durante os experimentos. Esse polimento foi realizado manualmente utilizando um equipamento adequado para essa tarefa. O equipamento utilizado (Figura 3.3) consiste de uma máquina de rotação excêntrica, suportes de tamanhos distintos para fixação do chip, diversas lixas de superfície rugosa contendo grãos de 9, 6, 3, 2 e 1 μm, uma cola sensível a temperatura e água destilada. Inicialmente, o chip é fixado precisamente no suporte mais adequado para seu tamanho por meio da cola termo sensível. Deve-se fixar o chip de tal forma que o plano da faceta a ser polida esteja paralelo ao plano da superfície do suporte. Posteriormente, a lixa com grãos de 9 μm deve ser encaixada na máquina de rotação excêntrica (Figura 3.3b), e logo em seguida, o conjunto amostra mais suporte deve ser colocado sobre a lixa de maneira que a faceta do chip a ser polida encoste fisicamente na superfície da lixa. Dessa forma, ao ligar a máquina de rotação excêntrica, o próprio peso do suporte é suficiente para pressionar a faceta do chip contra a lixa em rotação, provocando o desbaste da amostra. Conforme o polimento vai sendo realizado, é necessário trocar a lixa para tamanhos cada vez menores (isto é, com grãos cada vez menores) a fim de deixar as facetas correspondentes à entrada e saída dos guias de alimentação mais espelhadas, evitando perdas de espalhamento durante o acoplamento do laser de entrada nos experimentos. A água destilada é utilizada para lavar os resíduos do chip desbastado da superfície das lixas. Esse mesmo procedimento foi utilizado para polir tanto a faceta correspondente à entrada dos guias de alimentação quanto àquela correspondente à saída dos guias de alimentação.
Figura 3.3:
Equipamento utilizado para polir o chip. (a) Componentes do equipamento. (b) Lixa posicionada na máquina de rotação excêntrica.
3.4 Obtenção do espectro de transmissão
O laboratório 45 do LPD dispõe de uma montagem experimental preparada para medição do espectro de transmissão dos dispositivos devidamente cortados e polidos (Figura 3.4).
Figura 3.4: Montagem experimental utilizada para medir o espectro de transmissão dos dispositivos. (a)
Esquema da montagem com os diversos componentes. DAQ: Conversor analógico/digital. ILX+Peltier: Controlador de temperatura. (b) Foto da bancada experimental.
Para medição do espectro de transmissão, inicialmente, o laser sintonizável de bombeio deve ser alinhado à entrada do guia de alimentação do dispositivo em análise por meio de um microposicionador XYZ piezoeléctrico (ThorLabs MAX302/M). Esse laser de InGasP possui dois módulos de operação, Agilent 81980A e Agilent 81940A, e pode atingir até 14dBm de potência. O primeiro módulo opera na faixa de comprimentos de onda de 1465 a 1575 nm e o segundo de 1520 a 1630 nm. Além disso, antes de chegar até os dispositivos, o feixe do laser, que é guiado por fibras ópticas monomodo, passa por um rotor de polarização e é focalizado e colimado por um sistema de microlentes projetado para 1,55 μm. Após o alinhamento do laser de bombeio, é necessário alinhar a saída do guia de alimentação com o detector (Agilent Lightwave Multimeter 81636B). Esse alinhamento também é feito por meio de um microposicionador XYZ piezoeléctrico e também conta com um sistema de microlentes.
Ao passar pelo detector, o sinal óptico é convertido para elétrico e em seguida para digital por meio de um conversor analógico digital (DAQ, NI USB -6212). Assim, os dados digitalizados são enviados para um computador para processamento e armazenamento
via conexão USB. Ademais, esse mesma conexão USB é utilizada pelo computador para controle do laser de bombeio.
A base onde é posicionada a amostra contendo os dispositivos possui pequenos orifícios ligados a uma bomba de vácuo. Isso garante que a amostra permaneça fixa na base durante as medidas. Além disso, a base conta com um sistema de controle de temperatura dotado de um peltier (CP1.0-63-08L da Melcor) e um termostato (ILX-Lightwave – LDT-5525– Laser Diode Temperature Controller). Por fim, é importante salientar que essa base encontra-se abaixo de um microscópio óptico que possui uma câmera de infravermelho e uma câmera comum (para o espectro visível), as quais permitem a obtenção de imagens em tempo real do dispositivo durante todo o experimento.
3.5 Preparação das soluções de etilenoglicol em água
Para preparação das soluções aquosas, o aluno foi, antes de mais nada, devidamente instruído e treinado pela pesquisadora Elisângela S. de Oliveira no Centro de Engenharia Biomédica (CEB) da Unicamp. Neste treinamento, diversas soluções de BSA (Soro de Albumina Bovina) em água destilada e deionizada de baixas concentrações foram preparadas por diluição. Tanto a BSA quanto a água deionizada utilizadas nessas preparações foram fornecidas pelo CEB.
Por outro lado, as soluções de etilenoglicol em água utilizadas nos experimentos foram preparadas por diluição de uma solução aquosa de etilenoglicol de 50 % de concentração em água destilada e deionizada. A solução 50 % de etilenoglicol em água foi comprada da empresa Dinâmica Quimica Contemporânea Ltda e a água deionizada produzida na própria sala limpa do Departamento de Física Aplicada (DFA). Cada solução usada nos experimentos foi devidamente preparada na capela de orgânicos da sala limpa do DFA pelo próprio aluno, armazenada em um frasco de vidro e utilizada no mesmo dia da preparação. Após o uso da solução preparada, o frasco onde ela encontrava-se armazenada foi devidamente lavado com água deionizada para posterior utilização. É importante ressaltar também que foram utilizadas ferramentas devidamente esterilizadas e livres de contaminantes para preparação dessas soluções. A Figura 3.5 abaixo corresponde a fotos do material e capela de orgânicos utilizados para preparação das soluções.
Figura 3.5:Fotos do material e capela utilizados nas preparações. (a) Foto do material utilizado na preparação
das soluções aquosas de etilenoglicol. (b) Foto da capela de orgânicos da sala limpa do DFA, onde as soluções foram devidamente preparadas.
3.6 Experimentos com soluções de etilenoglicol em água
O objetivo principal dos experimentos com etilenoglicol em água foi basicamente medir a resposta do dispositivo biossensor para soluções de etilenoglicol em água de diferentes concentrações, e consequentemente, diferentes índices de refração, com a finalidade de caracterizá-lo em seguida, isto é, obter os valores experimentais da sensibilidade RI e limite de detecção RI. Nesse sentido, 10 ml de solução 5% de concentração (ml/ml) de etilenoglicol em água foram preparados na sala limpa através do procedimento descrito na seção anterior deste capítulo e posteriormente levados ao laboratório 45 do LPD para medição do espectro de transmissão. No laboratório, o chip foi cuidadosamente colocado e fixado sobre o suporte de medidas, e a entrada e saída do guia de alimentação foram devidamente alinhadas. Dessa forma, o espectro de transmissão do dispositivo foi medido de dois em dois minutos após a aplicação de 0,5 μl da solução de etilenoglicol 5% sobre a região de sensibilidade do sensor. Decorridos aproximadamente dez minutos após a aplicação da solução, o biossensor foi retirado da bancada experimental e lavado com álcool etílico e em seguida com água deionizada para posterior reutilização. A aplicação da solução de etilenoglicol foi realizada manualmente por meio de uma seringa (Hamilton) de escala micrométrica equipada com uma agulha de calibre 33G (0,22 mm de diâmetro externo). Além disso, a temperatura foi controlada e ajustada em 25 ºC durante o experimento. Esse procedimento foi repetido cinco vezes consecutivas para avaliação da reprodutibilidade do biossensor desenvolvido.
