UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
NAHANNA ZIMMERMANN MENEZES DE CARVALHO
“REGENERAÇÃO NERVOSA APÓS ESMAGAMENTO DE
RAÍZES VENTRAIS MEDULARES NA INTERFACE DO
SNC E SNP E TRATAMENTO COM DIMETIL-FUMARATO
(DMF)”
CAMPINAS 2019
REGENERAÇÃO NERVOSA APÓS ESMAGAMENTO DE RAÍZES
VENTRAIS MEDULARES NA INTERFACE DO SNC E SNP E
TRATAMENTO COM DIMETIL-FUMARATO (DMF)
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Celular e Estrutural na área de Biologia Celular.
Orientador: ALEXANDRE LEITE RODRIGUES DE OLIVEIRA
CAMPINAS 2019
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA NAHANNA ZIMMERMANN MENEZES DE CARVALHO E ORIENTADA PELO DR. ALEXANDRE LEITE RODRIGUES DE OLIVEIRA.
Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Menezes-de-Carvalho, Nahanna Zimmermann,
M524r MenRegeneração nervosa após esmagamento de raízes ventrais medulares na interface do SNC e SNP e tratamento com dimetil-fumarato (DMF) / Nahanna Zimmermann Menezes de Carvalho. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
MenOrientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira.
MenDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Men1. Neuroproteção. 2. Plasticidade. 3. Neurônios motores. 4. Degeneração neural. 5. Imunomodulação. I. Oliveira, Alexandre Leite Rodrigues de, 1971-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Nervous regeneration after medullary ventral roots crushing at the
CNS and PNS interface and treatment with dimetyl-fumarate (DMF)
Palavras-chave em inglês: Neuroprotection Plasticity Motor neurons Nerve degeneration Immunomodulation
Área de concentração: Biologia Celular
Titulação: Mestra em Biologia Celular e Estrutural Banca examinadora:
Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira [Orientador] Danielle Bernardes
Bruno de Siqueira Mietto
Data de defesa: 13-12-2019
Programa de Pós-Graduação: Biologia Celular e Estrutural
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-8918-0452 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/4166151423571479
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Profa. Dra. Danielle Bernardes
Prof. Dr. Bruno de Siqueira Mietto
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Biologia Celular e Estrutural da Unidade do Instituto de Biologia.
levar pelas mãos quando pensei em desistir.
Agradeço aos meus pais, José Eduardo e Kátia, por todo amor, apoio, compreensão e paciência, sempre me conduzindo pelo caminho que mais contribui para o meu amadurecimento e sabedoria. Agradeço por serem o meu farol, o meu porto seguro, me proporcionando condições para navegar, sempre tendo vocês como minha maior e melhor referência, e assim, sei que nunca sigo sozinha.
Agradeço ao meu irmão Kaynã, por seu amor, suporte e ser o meu milagre, meu anjo guardião e melhor amigo.
Ao professor Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, pela oportunidade, pela confiança, pela orientação na realização desse projeto e principalmente por todo aprendizado e oportunidades que contribuem para o meu crescimento profissional e pessoal.
À todos os animais que cederam suas vidas para que este estudo fosse realizado. Ao meu filho de quatro patas, Manny, pela companhia e carinho.
Aos amigos de laboratório, Danielle Bernardes e André Luis Bombeiro, pelos ensinamentos, discussões, paciência e ajuda com a manipulação dos animais e análises dos resultados, além de todo apoio nos momentos difíceis. Aprendi muito com vocês.
À Luciana Cartarozzi pela amizade e por dividir comigo seus conhecimentos e experiência. À Gabriela Chiarotto pela amizade, ajuda e paciência em compartilhar seus conhecimentos para realização da PCR em tempo real.
Aos meus amigos Bruno Henrique e Alex, pelas experiências e conversas compartilhadas, pela amizade e todo amor e carinho. Amo vocês.
Aos meus amigos do laboratório, Amanda, Ana Laura, Eduarda, Mateusinho, Monize, Paula e Raffa, aprendi muito com cada um de vocês.
À todos os meus amigos que estão sempre presentes, fisicamente ou dentro do meu coração. À UNICAMP, por ser a casa para minha formação, cedendo espaço e profissionais que contribuiram para essa conquista.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia, sua coordenação, funcionários e professores, por toda paciência e ensinamentos
Ao CNPq pelo apoio financeiro – Processo 169690/2017-2.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
―Suba o primeiro degrau com fé. Não é necessário que você veja toda a escada. Apenas dê o primeiro passo.‖ Martin Luther King
problema na área médica. A fim de investigar a neuroproteção/degeneração e a plasticidade sináptica de motoneurônios, além do potencial de uma variedade de tratamentos, diferentes modelos experimentais de lesão axonal têm sido propostos. Recentes estudos realizados com uso da droga imunomoduladora dimetil-fumarato (DMF), para tratamento de doenças neurodegenerativas apresentaram efeitos promissores. Portanto, nesse trabalho investigamos os efeitos do DMF no que tange a neuroproteção e sua influência sobre a resposta glial, em animais C57BL/6, submetidos ao esmagamento de raízes motoras, na intumescência lombar da medula espinal. Os animais foram divididos em grupo lesão tratado com veículo (grupo controle, n=7) e grupos lesão associado ao tratamento com DMF, em diferentes doses (15, 30, 45, 90 e 180mg/Kg; n=7 por dose, sendo o DMF diluído em solução 0,08% de metilcelulose). Avaliou-se sobrevivência neuronal, através da coloração de Nissl, recuperação funcional, pelo sistema CatWalk e mecanocepção pelo teste de von-Frey, sendo a sobrevida de 4 semanas pós-lesão. A dose que apresentou melhores resultados diante destes testes (90mg/kg) foi utilizada para o tratamento num período de oito semanas, sendo este grupo posteriormente submetido às mesmas análises. Imunoistoquímica foi empregada para avaliar a cobertura sináptica, reatividade astroglial e reatividade microglial, utilizando os anticorpos primários anti-sinaptofisina (terminais pré-sinápticos), GAD65 (terminações pré-sinápticas GABAérgicas - inibitórias), VGLUT1 (terminações pré-sinápticas glutamatérgicas - excitatórias), IBA1 (marcador para micróglia) e GFAP (marcador para astrócitos). Análises moleculares, em relação à expressão gênica, por qRT-PCR, levaram em conta a produção de citocinas pró e anti-inflamatórias, utilizando primers para amplificação de IL-3, IL-4, TNF-α, IL-6, TGF-β, iNOS-M1 e arginase-M2. Os resultados indicaram que o tratamento com DMF, na dose de 90mg/kg, promoveu neuroproteção e imunomodulação. Ainda, resultou em maior preservação dos inputs sinápticos e contribuiu para a regeneração axonal, pois reduziu a reatividade astroglial, propiciando um ambiente mais favorável à recuperação motora e sensitiva.
medical field. In order to investigate neuroprotection/degeneration and synaptic plasticity of motor neurons, in addition to the potential for a variety of treatments, different experimental models of axonal injury have been proposed. Recent studies with the use of the immunomodulatory drug dimethyl-fumarate (DMF), for the treatment of neurodegenerative diseases have shown promising outcomes. Therefore, in this work we investigated the effects of DMF with regard to neuroprotection and its influence on the glial response, in C57BL/6 animals, submitted to the crushing of motor roots, in the lumbar intumescence of the spinal cord. The animals were divided into a vehicle-treated injury group (control group, n = 7) and injury groups associated with DMF treatment, at different doses (15, 30, 45, 90 and 180mg/kg; n = 7 per dose, with DMF diluted in 0.08% methyl cellulose solution). Neuronal survival was assessed through Nissl staining, functional recovery using the CatWalk system and mechanoreception using the von-Frey test, with a 4-week survival after injury. The dose that showed the best results in the face of these tests (90mg/kg) was used for the treatment over a period of eight weeks, and this group was subsequently subjected to the same above mentioned analyzes. Immunohistochemistry was used to assess synaptic coverage, astroglial reactivity and microglial reactivity, using the primary antibodies anti-synaptophysin (presynaptic terminals), GAD65 (GABAergic presynaptic terminations - inhibitory), VGLUT1 (glutamatic presynaptic terminations - excitatory). Glial reaction was accessed with anti-IBA1 (marker for microglia) and GFAP (marker for astrocytes). Molecular analyzes, in relation to gene expression, by qRT-PCR, took into account the production of pro- and anti-inflammatory cytokines, using primers for amplification of IL-3, IL-4, TNF-α, IL-6, TGF- β, iNOS-M1 and arginase-M2. The results indicated that treatment with DMF, at a dose of 90mg/kg, promoted neuroprotection and immunomodulation. It also resulted in greater preservation of synaptic inputs and contributed to axonal regeneration, as it reduced astroglial reactivity, providing a more favorable environment for motor and sensory recovery.
espinal. Corte transversal da medula espinal, mostrando a formação do nervo espinal, a partir da união das raízes nervosas. O sítio exato de uma lesão radicular exclusiva do componente motor (raiz ventral) está indicado pelo ―X‖. Fonte: Koeppen and Stanton: Berne and Levy Physiology, 6th Edition. Modificado.
Figura 2. Esquema ilustrativo da estrutura do nervo espinal. Modificado de KULIASHA et al., 2019.
Figura 3. Bandas de RNAr 28S e 18S. É possível observar que a banda 28S é o dobro da 18S, indicando que o RNA tem boa integridade.
Figura 4. Cortes histológicos da coluna anterior da medula espinal corados com cresil violeta (Coloração de Nissl), representando a sobrevivência neuronal mediante o efeito neuroprotetor do DMF sobre os motoneurônios, quatro semanas após a lesão. A e B) Lados contra e ipsi à lesão do grupo esmagamento + veículo. C, D) Lados contra e ipsi à lesão do grupo esmagamento + DMF 15. E, F) Lados contra e ipsi à lesão do grupo esmagamento + DMF 30. G, H) Lados contra e ipsi à lesão do grupo esmagamento + DMF 45. I,J) Lados contra e ipsi à lesão do grupo esmagamento + DMF 90. K,L ) Lados contra e ipsi à lesão do grupo esmagamento + DMF 180. Barra de escala = 50µm. Observa-se a diminuição do número de motoneurônios, os quais apresentam grande corpo celular, enquanto que no grupo tratado com DMF na dose de 90mg/kg houve redução na perda desses neurônios.
Figura 5. Porcentagem de sobrevivência neuronal, quatro semanas após esmagamento das raízes motoras L4-L6. O grupo tratado com DMF 90 apresentou significativa preservação neuronal.
Figura 6. Cortes histológicos da coluna anterior da medula espinal corados com cresil violeta (Coloração de Nissl), representando a sobrevivência neuronal mediante o efeito neuroprotetor do DMF sobre os motoneurônios, oito semanas após a lesão. A e B) Lados contra e ipsi à lesão do grupo esmagamento + veículo. C, D) Lados contra e ipsi à lesão do grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 50µm. Observa-se a diminuição do número de motoneurônios, os quais apresentam grande corpo celular. No grupo tratado com DMF na dose de 90mg/kg há redução na perda destes neurônios.
significativo aumento da sobrevivência neuronal.
Figura 8. Análise imunoistoquímica da coluna anterior da medula espinal marcada com anti-sinaptofisina, quatro semanas após a lesão. Observa-se, nos grupos esmagamento e esmagamento + veículo, significativa redução na imunorreatividade anti- sinaptofisina, indicando uma pequena cobertura sináptica nestes neurônios. Já o grupo esmagamento + DMF 90 apresenta menor redução na expressão de sinaptofisina, indicando maior cobertura sináptica nesse grupo. A,B) Lados contra e ipsilateral à lesão no grupo esmagamento + veículo. C,D) Lados contra e ipsilateral à lesão no grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 75µm.
Figura 9. Representação gráfica da quantificação da cobertura sináptica quatro semanas após a lesão. Observa-se uma significativa redução do processo de eliminação sináptica no grupo tratado com DMF 90.
Figura 10. Análise imunoistoquímica da coluna anterior da medula espinal marcada com anti-sinaptofisina, oito semanas após a lesão. Observa-se, no grupo esmagamento + veículo significativa redução na imunorreatividade anti-sinaptofisina, indicando uma pequena cobertura sináptica nestes neurônios. Já o grupo esmagamento + DMF 90 apresenta menor redução na expressão de sinaptofisina, indicando maior cobertura sináptica nesse grupo. A,B) Lados contra e ipsilateral à lesão no grupo esmagamento + veículo. C,D) Lados contra e ipsilateral à lesão no grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 75µ.
Figura 11. Representação gráfica da quantificação da cobertura sináptica oito semanas após a lesão. Observa-se uma significativa redução do processo de eliminação sináptica no grupo tratado com DMF 90.
Figura 12. Análise imunoistoquímica da coluna anterior da medula espinal marcada com anti-VGLUT1, quatro semanas após a lesão. Observa-se em ambos grupos redução na expressão de VGLUT1. A,B) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + veículo. C,D) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 75µ. Figura 13. Representação gráfica da quantificação da cobertura sináptica por terminações glutamatérgicas quatro semanas após a lesão. Não há diferença significativa entre os grupos.
VGLUT1. A,B) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + veículo. C,D) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 75µ. Figura 15. Representação gráfica da quantificação da cobertura sináptica por terminações glutamatérgicas oito semanas após a lesão. Não há diferença significativa entre os grupos. Figura 16. Análise imunoistoquímica da coluna anterior da medula espinal marcada com anti-GAD65 quatro semanas após a lesão. Observa-se maior redução na imunoreatividade anti-GAD65 no lado ipsilateral à lesao no grupo esmagamento + veiculo, comparativamente ao grupo esmagamento + DMF 90, que apresentou aumento da marcação. A,B) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + veiculo. C,D) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 75µm.
Figura 17. Quantificação da cobertura sináptica de terminações GABAérgicas, quatro semanas após a lesão. Observa-se aumento das terminações GABAérgicas nos grupos esmagamento + DMF 90 comparativamente ao grupo esmagamento + veículo.
Figura 18. Analise imunoistoquímica da coluna anterior da medula espinal marcada com anti-GAD65 oito semanas apos a lesao. Observa-se maior redução na imunoreatividade anti-GAD65 no lado ipsilateral à lesao no grupo esmagamento + DMF 90, comparativamente ao grupo esmagamento + veiculo, que apresentou aumento da marcação. A,B) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + veiculo. C,D) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 50µm.
Figura 19. Representação gráfica da quantificação da cobertura sináptica para terminações GABAérgicas oito semanas após a lesão. Observa-se um aumento das terminações GABAérgicas nos grupos esmagamento + veiculo comparativamente ao grupo esmagamento + DMF 90.
Figura 20. Imunoreatividade relativa à proteína ácida fibrilar glial (GFAP) no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal quatro semanas após a lesão. A,B) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + veiculo. C,D) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 75µm.
comparativamente ao grupo esmagamento + veículo.
Figura 22. Imunoreatividade relativa à proteína ácida fibrilar glial (GFAP) no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal oito semanas apos a lesao. A,B) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + veiculo. C,D) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 75µm.
Figura 23. Representação gráfica da quantificação de astrogliose oito semanas após a lesão. Observa-se uma redução da astrogliose no grupos esmagamento + DMF 90 comparativamente ao grupo esmagamento + veículo.
Figura 24. Imunoreatividade relativa à molécula adaptadora ligante de cálcio ionizado-1 (Iba1) no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal quatro semanas apos a lesao. A,B) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + veiculo. C,D) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 75µm.
Figura 25. Representação gráfica da quantificação de microgliose quatro semanas após a lesão. Observa-se um aumento da microgliose no grupos esmagamento + DMF 90 comparativamente ao grupo esmagamento + veículo.
Figura 26. Imunoreatividade relativa à molécula adaptadora ligante de cálcio ionizado-1 (Iba1) no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal oito semanas apos a lesao. A,B) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + veiculo. C,D) Lados contra e ipsilateral à lesão do grupo esmagamento + DMF 90. Barra de escala = 75µm.
Figura 27. Representação gráfica da quantificação de microgliose oito semanas após a lesão. Observa-se uma diminuição da microgliose no grupos esmagamento + DMF 90 comparativamente ao grupo esmagamento + veículo.
Figura 28. Quantificação relativa da expressão gênica de IL-6 (A), TNF-α (B) e iNOS (C) duas semanas após axotomia das raízes ventrais.
Figura 29. Quantificação relativa da expressão gênica de IL-4 (A), IL-13 (B), TGF-β (C), Arg1 (D) duas semanas após axotomia das raízes ventrais.
axotomia das raízes medulares ventrais e tratamento com DMF em diferentes doses. Observa-se perda funcional a partir da primeira Observa-semana pós lesão em todos os grupos. Não foram observadas diferença na recuperação da mobilidade entre todos os grupos com quatro semanas de tratamento com DMF. Em relação à intensidade máxima do contato máximo, animais do grupo esmagamento + DMF 90 tendem a recuperar a sensibilidade mais cedo do que os animais do grupo esmagamento + veículo.
Figura 31. Análise da função motora dos animais quanto ao índice de recuperação motora do nervo isquiático (SFI) e da intensidade máxima do contato máximo oito semanas após a axotomia das raízes medulares ventrais e tratamento com DMF na dose de 90mg/kg.
Figura 32. Recuperação do arco-reflexo por quatro semanas após a lesão. O gráfico representa as médias por grupo das medidas pata esquerda (contralateral) e direita (ipsilateral). As análises do limiar de nocicepção revelaram que o grupo esmagamento + DMF 90 não apresentou perda da sensibilidade, que pôde ser verificado já na primeira semana após a lesão, sugerindo que os animais desse grupo experimental não apresentaram anestesia total na primeira semana pós lesão e que a recuperação da sensibilidade foi antecipada em relação aos demais grupos e gradual à medida que o limiar foi se aproximando do basal.
Figura 33. Recuperação do arco-reflexo por oito semanas após a lesão. O gráfico representa as médias por grupo das medidas pata esquerda (contralateral) e direita (ipsilateral). As análises do limiar de nocicepção revelaram que o grupo esmagamento + DMF 90 não apresentou perda da sensibilidade, que pôde ser verificado já na primeira semana após a lesão, sugerindo que os animais desse grupo experimental não apresentaram anestesia total na primeira semana pós lesão e que a recuperação da sensibilidade foi antecipada em relação aos demais grupos e gradual à medida que o limiar foi se aproximando do basal.
(L4-L6), administração do DMF via gavagem (n=7 por dose, sendo o DMF diluído em solução 0,08% de metil celulose) e técnicas utilizadas em cada grupo, bem como o objetivo de estudo de cada uma delas.
Tabela 2. Anticorpos primários usados no ensaio de imunoistoquímica. Cada anticorpo é seguido pelo fornecedor, animal hospedeiro,código do produto e concentração utilizada. Tabela 3. Condições de termociclagem das reações de qRT-PCR
Tabela 4. Razão percentual entre o número de motoneurônios presentes no lado ipsilateral e contralateral, obtendo-se as seguintes porcentagens de sobrevivência neuronal para cada grupo no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal quatro semanas apos a lesao. valores médios por grupo ± erro padrão; p = 0,0002.
Tabela 5. Razão percentual entre o número de motoneurônios presentes no lado ipsilateral e contralateral, obtendo-se as seguintes porcentagens de sobrevivência neuronal para cada grupo no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal oito semanas apos a lesao. valores médios por grupo ± erro padrão; p = 0,0015.
Tabela 6. Imunoreatividade relativa à cobertura sináptica no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal quatro (p=0,1602) e oito (p=0,9597) semanas apos a lesao. Dados apresentados como uma avaliação quantitativa da cobertura sináptica através da densidade integrada de pixels, que reflete a intensidade da imunomarcação. A marcação encontrada no corno anterior contralateral foi comparada com o lado ipsilateral (lesionado).
Tabela 7. Imunoreatividade relativa à cobertura de terminais glutamatergicos no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal quatro (p=0, 4594) e oito (p=0, 5318) semanas apos a lesao. Dados apresentados como uma avaliação quantitativa da presença de terminais glutamatergicos através da densidade integrada de pixels, que reflete a intensidade da imunomarcação. A marcação encontrada no corno anterior contralateral foi comparada com o lado ipsilateral (lesionado).
Tabela 8. Imunoreatividade relativa à cobertura de terminais GABAérgicos no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal quatro (p=0,1438) e oito (p=0,8641) semanas apos a lesao. Dados apresentados como uma avaliação quantitativa da presença de terminais
lado ipsilateral (lesionado).
Tabela 9. Imunoreatividade relativa à proteína ácida fibrilar glial (GFAP) no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal quatro semanas após a lesaão. Dados apresentados como uma avaliação quantitativa da presença de reatividade dos astrócitos obtida através da densidade integrada de pixels, que reflete a intensidade da imunomarcação. Tabela 10. Imunoreatividade relativa à molécula adaptadora ligante de cálcio ionizado-1 (Iba1) no núcleo motor lateral da coluna anterior da medula espinal quatro semanas apos a lesao. Dados apresentados como uma avaliação quantitativa da presença de reatividade da microglia obtida através da densidade integrada de pixels, que reflete a intensidade da imunomarcação.
BNDF – Fator neurotrófico derivado do cérebro BSA – Albumina de soro bovino
CEMIB - Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica CEUA - Comissão de ética no uso de animais
CS - Célula de Schwann DMF – Dimetil-fumarato DRG – Gânglio da raiz dorsal EM – Esclerose múltipla
ERV – Esmagamento das raízes ventrais FAE – Ésteres de ácido fumárico
GABA - γ-ácido aminobutírico GAD – L-glutamato descarboxilase GAD65 – L-glutamato descarboxilase-65
GAPDH – Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GFAP - Proteína fibrilar ácida glial
IBA-1 – Molécula adaptadora ligante de cálcio ionizado-1 IL-13 – Interleucina-13
IL-4 - Interleucina 4 IL-6 - Interleucina-6
iNOS – Enzima óxido nítrico sintase
Keap1 – Kelch-like ECH-associated protein-1 LM – Lesão medular
M1 – Macrófagos de ativação via clássica M2 – Macrófagos de ativação via alternativa
NGF – Fator de crescimento nervoso NMDA – N-metil-D-aspartato
Nrf2 – Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 PBS - Tampão fosfato salino
PCR - Reação em cadeia da polimerase PSM – Pontos de saída motores
RNI – Intermediários de nitrogênio reativo ROS – Espécies reativas de oxigênio SFI - Índice funcional do isquiático SN - Sistema nervoso
SNC - Sistema nervoso central SNP - Sistema nervoso periférico
TGFβ – Fator de transformação do crescimento TNFα – Fator de necrose tumoral α
VGLUT1 - Transportador vesicular de glutamato-1 ZERDs – Zonas de entrada da raíz dorsal
1.1 ORGANIZAÇÃO GERAL DO SISTEMA NERVOSO ...20
1.2 DEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO NERVOSA...24
1.3 LESÃO RAÍZES NERVOSAS MOTORAS...29
1.4 INTERFACE SNC-SNP ...30 1.5 SINAPSE E PLASTICIDADE ...31 1.6 DIMETIL-FUMARATO...34 2. JUSTIFICATIVA ...36 3. OBJETIVOS ...37 3.1 OBJETIVOS GERAIS ...37 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...37 4. MATERIAIS E MÉTODOS...38
4.1 ESMAGAMENTO DAS RAÍZES MOTORAS...39
4.2 ADMINISTRAÇÃO DO DMF...39
4.3 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS...39
4.4 IMUNOFLUORESCÊNCIA...40
4.4.1 Reação de imunofluorescência...40
4.4.2 Análise quantitativa dos resultados...41
4.5 SOBREVIVÊNCIA NEURONAL...41
4.6 AVALIAÇÃO DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL MOTORA...42
4.7 AVALIAÇÃO DO ARCO-REFLEXO...43
4.8 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA PELA TÉCNICA QRT–PCR ...44
4.8.1 Obtenção dos espécimes...44
4.8.2 Extração RNA total...44
4.8.3 Quantificação RNA... 45
4.9 ANÁLISES ESTATÍSTICAS...47
5. RESULTADOS ...48
5.1 EFEITO NEUROPROTETOR – SOBREVIVÊNCIA NEURONAL...48
5.2 DESTACAMENTO SINÁPTICO...52
5.3 BALANÇO SINÁPTICO EXCITATÓRIO/INIBITÓRIO...56
5.3.1 Terminações nervosas glutamatérgicas – inputs excitatórios...57
5.3.2 Terminações nervosas GABAérgicas – inputs inibitórios...61
5.4 ASTROGLIOSE...65
5.5 MICROGLIOSE...68
5.6 INFLAMAÇÃO...72
5.6.1 Análise expressão gênica de citocinas pró e antiinflamatórias através da qRT-PCR...72
5.7 ANÁLISES COMPORTAMENTAIS...74
5.7.1 Avaliação motora da recuperação funcional - CatWal...74
5.7.2 Von-Frey...77
6. DISCUSSÃO ...80
6.1 DMF E SOBREVIVÊNCIA NEURONAL...80
6.2 ASTROGLIOSE REATIVA E PLASTICIDADE SINÁPTICA...82
6.3 MICROGLIOSE E INFLAMAÇÃO...83
7. CONCLUSÕES ...86
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...87
9. ANEXOS...93
9.1 CERTIFICADO CEUA...93
1-INTRODUÇÃO
1.1. ORGANIZAÇÃO GERAL DO SISTEMA NERVOSO
A recepção, o processamento e a transmissão de informações, a regulação do controle motor, a mediação de respostas autonômicas e emocionais, além dos processos de aprendizagem e memória são funções específicas do Sistema Nervoso – SN (KANDEL et al., 2013). Nesse sentido, o SN possui uma organização estrutural complexa pela qual as reações internas do indivíduo são correlacionadas e integradas. É descrito anatomicamente como uma porção central, denominada de Sistema nervoso central (SNC), protegida pelo esqueleto axial (cavidade craniana e canal vertebral), sendo composto pelo encéfalo e medula espinal, e uma porção periférica, nomeada de Sistema nervoso periférico (SNP), localizado fora do esqueleto axial e composto por nervos, gânglios e terminações nervosas (MACHADO; MACHADO, 2013).
A medula espinal está localizada no interior do canal vertebral, com forma cilíndrica e levemente achatada no sentido ânteroposterior. Não possui calibre uniforme devido a presença de duas dilatações denominadas intumescência cervical e intumescência lombar, que correspondem às áreas onde ocorre a conexão da medula com as raízes nervosas que compõem os plexos braquial e lombossacral, os quais são responsáveis pela inervação dos membros superiores e inferiores, respectivamente (MACHADO; MACHADO, 2013).
A medula espinal é morfologicamente distinta em uma camada interna, denominada substância cinzenta, onde se situam os corpos dos neurônios, dentritos e axônios amielínicos, e uma camada externa, denominada substância branca, a qual é formada por fibras nervosas de maioria mielínica agrupadas em funículos. Ambas camadas se estendem por todo seu comprimento (STANDRING, 2010).
A substância cinzenta, quando analisada sob a perspectiva da sua organização longitudinal colunar, consiste de uma série de neurônios medulares agrupados descontinuamente, organizados de maneira segmentar e associados aos seus nervos espinais correspondentes. Em qualquer nível de secção transversal, esses grupamentos tem dez camadas celulares, e são conhecidos como Lâminas de Rexed. A lâmina IX consiste de um complexo arranjo de neurônios motores α e γ, além de muitos interneurônios, localizadas no corno ventral, os quais caracterizam o aparecimento das intumescências cervical, as quais são as responsáveis pela inervação dos membros superiores, e lombar, responsável pela inervação dos membros inferiores (MOLANDER et al., 1989; REXED, 1952). O tamanho do corpo celular dos motoneurônios (MN) estão entre os maiores do SNC, como resultado de seus esforços devido
à sua maquinaria de alta demanda (CULLHEIM et al., 2002). Pode ser definido como um neurônio com o corpo celular no sistema nervoso central, que projeta seu axônio nos músculos esqueléticos (MCHANWELL; BISCOE, 1981). São descritos em três subtipos, baseado nas fibras musculares inervadas. As fibras motoras α (fibras musculares) geram força, portando geram movimento, conferindo aos MN-α uma função esqueleto-motora. MN-γ inervam fibras musculares intrafusais que modulam os eixos musculares, órgão sensorial do alongamento muscular, conferindo assim aos MN-γ um função fusimotora (BRYAN; TREVINO; WILLIS, 1972; KANNING; KAPLAN; HENDERSON, 2010). O terceiro subtipo inerva as fibras musculares extrafusais e intrafusais, sendo denominado MN-β. Todos localizam-se ao longo de toda a medula espinal, organizados em colunas que são divididas em grupos motores baseados no músculo que o MN inerva. Os MN-α têm o maior corpo celular (quase o dobro) entre os três subtipos, e possui uma árvore dendrítica mais ramificada e mais irregular, o que facilita a sua identificação no microscópio (ALVAREZ; FYFFE, 2007; D. R. WESTBURY, 1982; ENJIN, 2011).
Numa secção transversal, a medula consiste dos cornos anterior e posterior, direito e esquerdo, ligados entre si e que se projetam posterolateralmente e anterolateralmente em direção à superfície, respectivamente. Filamentos radiculares emergem dos sulcos lateral anterior e posterior da medula, os quais se unem para formar respectivamente, as raízes ventrais e dorsais, que unidas darão origem à cada nervo espinal. O corno posterior é constituído pela terminação das fibras nervosas aferentes primárias, que entram na medula espinal por meio das raízes posteriores (dorsais) dos nervos espinais, formada por axônios provenientes de neurônios sensitivos, cujos corpos celulares localizam-se nos gânglios sensitivos da raiz dorsal (DRG do inglês dorsal root ganglion) (Figura 1). O corno anterior contém corpos celulares de motoneurônios cujas fibras nervosas (axônios) emergem da medula espinal nas raízes nervosas anteriores (ventrais) e são responsáveis pela via do comando motor. A junção dos axônios eferentes da raiz ventral motora com a raiz dorsal sensitiva dará origem ao tronco do nervo espinal, o qual, portanto, é funcionalmente misto. (MACHADO; MACHADO, 2013)
Figura 1. Esquema da organização anatômica dos componentes motor e sensitivo, em nível da medula espinal. A imagem representa um corte transversal da medula espinal, mostrando a formação do nervo espinal, a partir da união das raízes nervosas. O ―X‖ representa o sítio exato de uma lesão radicular exclusiva do componente motor (raiz ventral). Fonte: Koeppen and Stanton: Berne and Levy Physiology, 6th Edition. Modificado.
Conforme as relações dos nervos periféricos com as CS variam, seus axônios podem ser mielínicos e amielínicos. Quando mielínico, seu diâmetro geralmente é maior do 1µm e as CS estão dispostas em sequência, formando camadas concêntricas ao redor do axônio denominadas bainha de mielina. As CS vizinhas estão separadas entre si por espaços desprovidos de mielina e parcialmente cobertos por digitações laterais do seu citoplasma. Estes intervalos são chamados nodos de Ranvier. Nos axônios amielínicos, uma CS envolve total ou parcialmente de 5 à 25 axônios através de projeções citoplasmáticas, não ocorrendo a formação da bainha de mielina. Assim, os axônios amielínicos estão alocados individualmente no interior de sulcos ou canais formados pelas expansões do citoplasma das CS (PETERS et al., 1976).
Após saírem do tronco encefálico, medula espinal ou dos gânglios sensitivos, as fibras nervosas motoras e sensitivas reúnem-se em feixes associados ao tecido conjuntivo constituindo o tronco do nervo espinal, que é misto (MACHADO; MACHADO, 2013). Trinta e quatro pares de nervos espinais (8 cervicais, 13 torácicos, 6 lombares, 4 sacrais e 3 coccígeos) emergem da medula espinal. Os nervos espinais cervicais são nomeados de acordo com a vértebra acima da qual emergem. Por outro lado, os nervos espinais torácicos, lombares, sacrais e coccígeos são nomeados de acordo com a vértebra abaixo da qual emergem. As raízes do segundo ao sexto nervo espinal lombar formam o plexo lombar. O nervo isquiático de camundongos emerge predominantemente dos nervos espinais L3 e L4, enquanto que em ratos a origem é de L4 e L5 (WATSON et al., 2012). Em humanos, o nervo isquiático é o maior nervo do corpo e faz parte do plexo lombossacral, o qual é formado pelas
raízes ventrais dos nervos espinais (L4, L5, S1, S2, S3 e S4). Três ramos formam o nervo isquiático: o nervo tibial, responsável por inervar todos os músculos da face posterior da coxa e perna, controlando os movimentos de flexão plantar e inversão; o nervo fibular, responsável pela inervação dos músculos da região anterior da perna, responsáveis pelos movimentos de dorsiflexão e eversão; e o nervo sural inerva a região posteior da perna (DANGELO FATTINI, 2011; MACHADO; MACHADO, 2013).
O tecido de sustentação dos nervos é formado por uma camada fibrosa mais externa de tecido conjuntivo denso, o epineuro, rico em vasos. No seu interior as fibras nervosas se organizam em fascículos. O epineuro e seus vasos penetram entre os fascísculos. Assim, cada fascículo é delimitado pelo perineuro – formado por um tecido conjuntivo denso ordenado, células epiteliais lamelares ou achatadas, as quais formam inúmeras camadas entre esse tecido conjuntivo e as fibras nervosas, e fibras colágenas. Junções oclusivas unem as células de bainha perineural consistindo assim em uma barreira à passagem de muitas macromoléculas e importante mecanismo de defesa contra agentes agressivos. Dentro de cada fascículo, delicadas fibrilas colágenas formam o endoneuro, o qual limita-se internamente pela membrana basal da CS e envolve cada fibra nervosa. As bainhas conjuntivas garantem grande
resistência e certa elasticidade aos nervos (Figura 2) (MACHADO; MACHADO, 2013).
Figura 2. Esquema ilustrativo da estrutura do nervo espinal. Modificado de (KULIASHA et al., 2019).
1.2. DEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO NERVOSA
A maioria das lesões tanto no SNC quanto no SNP envolvem danos axonais por conta dos neurônios possuírem axônios extensos ou estarem integrados em redes nervosas. A axotomia envolve a transecção axonal e acarreta várias consequências. Inicialmente a axotomia divide o axônio em um segmento proximal, o qual permanece unido ao corpo celular, e um segmento distal, o qual devido à lesão, perde a conexão com o soma. A axotomia resulta na degeneração do segmento distal, pelo fato da capacidade de síntese de proteínas ser restrita ao corpo celular. Sendo o sistema nervoso suscetível à diversas formas de lesão devido a traumas mecânicos ou doenças degenerativas, Seddon em 1943 definiu uma classificação mais precisa e didática na qual reconhece três tipos de lesão nervosa periférica que acarretam na perda de função: neurotomia, axotomia e neuropraxia. A neurotomia é o tipo mais severo de lesão, havendo a secção do nervo, na qual todas as partes do nervo são destruídas. A axotomia
caracteriza-se pela completa interrupção dos axônios, mas preservando as estruturas de suporte do nervo, como CS, endoneuro e perineuro, desencadeando diferentes processos no coto proximal e no segmento distal ao local da lesão. A neuropraxia é caracterizada pelo dano local da bainha de mielina, geralmente de grau secundário à compressão, no qual a continuidade axonal é preservada e o segmento distal não sofre degeneração. Posteriormente, Sunderland aprimorou a classificação de Seddon (1943) para cinco graus de lesão do nervo periférico, sendo eles: Neuropraxia grau I, ocorrendo a desmielinização segmentar. Axotomia grau II, ocorrendo danos no axônio mas o endoneuro permanece intacto. Axotomia grau III, quando axônio e endoneuro são danificados e o perineuro permanece intacto. Axotomia grau IV, quando axônio, endoneuro e perineuro sofrem danos e o epineuro permanece intacto. Por fim, neurotomia grau V, quando ocorre a transecção total do nervo (LEE; WOLFE, 2000; SUNDERLAND, 1951).
Considera-se dois níveis de injúria à medula espinal: lesões primárias e secundárias. A lesão primária é consequência do trauma físico e mecânico que leva à destruição focal no tecido nervoso. As lesões secundárias incluem distúrbio funcional, isquemia, dano vascular, excitotoxicidade glutamatérgica, estresse oxidativo e inflamação, que são as responsáveis pela maior parte da morte celular (neuronal e glial) pós-lesão. A causa de um terceiro nível de lesão pode ser a formação de uma cicatriz glial (LEAL-FILHO, 2011).
As consequências decorrentes da lesão podem também ser agrupadas em fase aguda, subaguda e crônica.
Na porção proximal à lesão, os corpos celulares dos motoneurônios adultos podem degenerar, pois em decorrência da perda de sinapses no período agudo pós-lesão, diminuem ou até perdem sua funcionalidade (DELGADO-GARCIA et al., 1988; KUNO; LLINAS, 1970; PURVES, 1975; TAKATA; NAGAHAMA, 1983).
Após o período agudo, o corpo celular do neurônio sofre alterações como edema, deslocamento do núcleo para periferia da célula, retração dos dendritos, os corpúsculos de Nissl desaparecem, ocorre a desorganização do retículo endoplasmático rugoso, do complexo de golgi e ribossomos. Tais eventos, em conjunto, são denominados cromatólise. Quanto maior a proximidade da lesão ao SNC, mais extensiva será a degeneração de motoneurônios adultos. Assim, a quantidade de células que degeneram depende do tipo de injúria à que foram expostas. (BOSSE; KÜRY, 2001; DAHLIN, 2004; LIEBERMAN, 1971; ROMANES, 1946; X. NAVARRO; VIVÓ; VALERO-CABRÉ, 2007).
A interação entre os motoneurônios e o microambiente medular é de extrema importância para a sobrevivência, regulação do estado funcional e conectividade sináptica dos mesmos
(OLIVEIRA et al., 2002). Após uma lesão, a plasticidade do SN propicia a remodelação estrutural e funcional de seus circuitos. Ocorre perda significativa dos inputs em neurônios axotomizados, diminuindo ou até anulando a transmissão sináptica. Caso não ocorra a reinervação com o órgão alvo, esse efeito pode se tornar permanente (BRÄNNSTRÖM; KELLERTH, 1998; DELGADO-GARCIA et al., 1988; PURVES, 1975; TAKATA; NAGAHAMA, 1983).
A lesão nervosa periférica provoca uma cascata de respostas de células não-neuronais no nervo, especialmente em seu coto distal, iniciando um processo chamado de Degeneração Walleriana, no qual ocorre a degeneração dos fragmentos distais dos axônios lesados. Com a axotomia, ocorre a morte de CS, causando a fragmentação da bainha de mielina, o que ativa células imunes e gliais. Essas células liberam citocinas pró-inflamatórias e secretam moléculas quimioatrativas, as quais recrutam macrófagos para fagocitar os resquícios de mielina (WATKINS; MAIER, 2002).
Nas três ou quatro semanas que irão suceder a lesão, quase todos os brotos nervosos presentes no coto distal estarão desprovidos de núcleo e bainha de mielina. No entanto, a partir da quarta semana, as CS se proliferam dando origem à células fusiformes, as quais se alocam em torno das fibras e fornecem suporte trófico. Esse suporte irá ativar os macrófagos residentes, que irão recrutar macrófagos provenientes da circulação sanguínea – isso é possível devido à quebra da barreira hematoencefálica – os quais irão fornecer suporte trófico para o desenvolvimento, amadurecimento e regeneração dos axônios. Além disso, a lâmina basal produzida por essas células circunda a CS e seus axônios associados fornecendo componentes que contribuem para o crescimento axonal. Os macrófagos que estão presentes no microambiente da lesão fagocitam os restos de mielina e produzem fatores que facilitam a migração das CS (GAUDET; POPOVICH; RAMER, 2011; SUNDERLAND, 1990). A resposta inflamatória inicialmente consiste em neutrófilos e posteriormente em macrófagos/monócitos. Os neutrófilos se infiltram nas primeiras horas pós lesão, em 24 horas atingem seu ápice populacional e desaparecem em três dias. Posteriormente, monócitos – que em 72 horas se diferenciam em macrófagos – realizarão a fagocitose dos resíduos de mielina restos celulares enquanto a ação dos neutrófilos é breve, a dos macrófagos se sustenta por longos períodos. Ao migrarem para o local da injúria, os monócitos, macrófagos e neutrófilos produzem citocinas e interleucinas que levam as células imunes à responderem à lesão (SCHWAB; BARTHOLDI, 1996).
As reações inflamatórias são processos patológicos inevitáveis que ocorrem em todas as formas de lesões e danos ao SNC. Os macrófagos são células imunes que desempenham um
papel crucial na manutenção da homeostase e defesa, e estão presentes na maioria dos órgãos, incluindo o cérebro, o qual possui a microglia como representante das células fagocíticas residentes. A microglia é a responsável por mediar as respostas imunes e inflamatórias no SNC, e irão se polarizar funcionalmente de acordo com a natureza do micrombiente (HU et al., 2015). Elas expressam reações funcionais específicas em resposta aos sinais do microambiente, sendo que existem dois estados funcionais de polarização: ela pode ser fenotipicamente polarizada para desenvolver um perfil pró-inflamatório M1, via ativação clássica, ou anti-inflamatório e pró-cicatrizante M2, através da ativação alternativa (JHA; LEE; SUK, 2015). Macrófagos classicamente ativados (ou M1) tem como estímulos de ativação IFNgama e LPS. Macrófagos alternativamente ativados (ou M2), são subdivididos em M2a (após exposição à 4 ou 13), M2b (complexos imunes combinados com IL-1beta ou LPS) e M2c (IL-10, TGFbeta ou glicocorticóides) (MARTINEZ et al., 2008). Além da infecção, macrófagos M2 desempenham papel na resolução da inflamação através da alta capacidade de depuração endocítica e síntese de fatores tróficos e redução na secreção de citocinas pró-inflamatórias (CHERRY; OLSCHOWKA; O’BANION, 2014). A ativação dos macrófagos M1 provoca a secreção de glutamato, citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6 e TNF-α, além de ativação da enzima que provoca a síntese de radicais livres – a óxido nítrico sintase (iNOS) - causando a apoptose de neurônios e oligodendrócitos (DAVID; KRONER, 2011). Num estudo com lesão medular induzida experimentalmente caracterizou a polarização de macrófagos na medula espinal e constatou que a maioria dos macrófagos são células M1, com uma pequena polarização de células M2. Nesse estudo, as análises do PCR em tempo real mostraram que os marcadores M1 e M2 são rapidamente super expressos após uma lesão na medula espinal. Nas primeiras duas semanas após a lesão medula, os macrófagos/microglia contribuem diretamente ou indiretamente com o dano secundário do tecido, perda neuronal e desmielinização. Existem evidências que indicam que os macrófagos M1 podem induzir a morte neuronal e ter um papel negativo na regeneração axonal (DAVID; KRONER, 2011). Os macrófagos M2 quando ativados expressam altos níveis de IL-10 e TGFβ, arginase1 e diminuem a expressão de citocinas pró-inflamatórias. O baixo número de macrófagos M2 após uma lesão medular provavelmente contribui para a extensão do período da resposta pró-inflamatória, a qual tem efeitos prejudiciais na viabilidade tecidual e regeneração axonal (SICA et al., 2008). Contudo, a inflamação gerada pelos macrófagos M2 traz benefícios após uma lesão pois, além de reduzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias, os macrófagos M2 realizam a fagocitose de fragmentos de mielina ou glóbulos vermelhos, que são responsáveis por inibir a regeneração axonal na medula espinal que sofreu a injúria (BOVEN et al., 2006).
Após lesões traumáticas no SNC, incluindo lesões medulares, astrócitos ao redor da lesão se tornam reativos, passando por um processo de extensão e sofrendo hipertrofia. Ao migrarem para o epicentro da lesão, irão auxiliar no processo de reparo tecidual. No entanto, eventualmente formam uma cicatriz glial que produz moléculas inibidoras de crescimento e comprometem a regeneração axonal. Essa mudança fenotípica pela qual os astrócitos passam após serem ativados, por muito tempo foi considerada unidirecional e irreversível, sendo portanto considerada uma das causas da capacidade regenerativa limitada do SNC (OKADA et al., 2018). A formação da cicatriz glial após lesões no SNC é regulada através de mecanismos inter e intracelulares. Em condições normais, os astrócitos são o subtipo predominante de células gliais no SNC. Em resposta à vários tipos de lesões, como inflamação, infecção, isquemia e trauma, ele são ativados e desempenham um papel crucial na fisiopatologia de cada lesão através da sua mudança fenotípica para um estado de astrogliose reativa. Os astrócitos reativos são necessários nos processos agudos de cicatrização de feridas e remodelação de tecidos, no entando, eles eventualmente formam uma cicatriz glial densa (SHINOZAKI et al., 2017). Astrócitos reativos secretam fatores neurotróficos que irão auxiliar nos mecanismos de proteção e reparo, irão atuar também na remoção de neurotoxinas e eliminação de neurotransmissores excitatórios (como o glutamato, quando em excesso pode tornar a célula excessivamente despolarizada, levando-a à morte por excitotoxicidade) (LEAL-FILHO, 2011). Assim, a reatividade astroglial parece ser fundamental para atenuar a extensão de lesões à medula espinal nos seus estágios iniciais, embora nos períodos mais crônicos atue com uma função lesiva e anti-regenerativa. (HANISCH, 2002).
A regeneração axonal advinda do coto proximal, que se encontra em contato com os corpos de neurônios axotomizados, ocorre simultâneamente à evolução da degeneração Walleriana. Visando o reajuste do microambiente do nervo e a reinervação do órgão alvo, essa regeneração consta de um processo altamente complexo, resultado de uma sucessão de eventos expressa cronologicamente e sincronizada (IDE, 1996).
Embora, durante a fase crônica da lesão medular ocorra a recuperação funcional limitada, a recuperação funcional temporária é frequentemente observada logo após o trauma, na fase aguda da lesão, quando a mesma é incompleta (KOBAYAKAWA et al., 2014).
Como resolução da inflamação da fase aguda, adentra-se na fase crônica. Nesta fase os macrófagos saem do local da lesão e se inicia a formação de uma cicatriz glial. A formação dessa cicatriz é finalizada com a migração e proliferação de astrócitos, que aumentam a produção da proteína ácida fibrilar (GFAP), tornando-se hipertróficas e conectando muitos de seus prolongamentos celulares com processos de células vizinhas através das chamadas
junções GAP. Os astrócitos reativos proximais apresentam expressão aumentada de gliofilamentos (GFAP), desidrogenases (iNOS), fatores neurotróficos e citocinas (TGFβ, TNFα, IL-1, IL-6) e moléculas de superfície celular (ELMQUIST et al., 1997). A cicatriz delimita a área necrótica isolando o local da lesão, prevenindo assim a disseminação da degeneração para áreas intactas (PROFYRIS et al., 2004).
1.3 LESÃO DE RAÍZES NERVOSAS MOTORAS
As disfunções sensoriais e motoras causadas pela compressão das raízes nervosas espinais podem ter origem de herniações de disco e tumores, como neurofibromas ou meningeomas, tendo como consequência vários sintomas, tais como dor lombar, dor ciática, distúrbios sensoriais e fraqueza muscular nos membros inferiores. (KOBAYASHI; YOSHIZAWA; YAMADA, 2004). Acidentes de alto impacto que acarretam na tração dos membros superiores ou extrema laterização do pescoço podem resultar em lesão do plexo braquial (ROTHMAN; WINKELSTEIN, 2007; SPEJO et al., 2013). Nessas situações, as raízes espinais podem ser avulsionadas, esmagadas ou tracionadas, tendo como resultado lesões complexas.
A proteção dos neurônios da medula espinal após a lesão das raízes nervosas é de extrema importância para evitar perdas funcionais permanentes e estados de dor prolongado. Os neurônios presentes no SNC respondem à lesão nervosa periférica de maneiras complexas, incluindo apoptose. Seguida à lesão, ocorrem mudanças imediatas, intermediárias e tardias na expressão gênica, tradução e processamento pós-traducional que podem ocasionar déficits motores, caso atinjam neurônios do corno anterior, ou o desenvolvimento de sintomas relacionados à nocicepção, caso a lesão ocorra em neurônios do corno posterior. Caso a lesão periférica seja mais branda ou ocorra a uma certa distância do soma neuronal, existe a possibilidade desses processos serem reversíveis, ou seja, os neurônios podem recuperar a função normal após o nervo lesado ter sofrido a degeneração e o processo de regeneração estar completo. No entanto, caso a lesão seja mais grave, os neurônios presentes na medula espinal podem sofrer apoptose, e embora esse não seja um processo reversível, o número de neurônios condenados pode ser reduzido através da intervenção precoce com estratégias terapêuticas neuroprotetoras e imunomoduladoras (SEKIGUCHI et al., 2003).
Não é incomum que as raízes esmagadas sejam consideradas não lesionadas, pois o tecido conjuntivo epi e perineural são preservados. No entanto, em ambos os casos, avulsão ou
esmagamento das raízes, ocorre a transecção de axônios, os quais sofrerão degeneração Walleriana (MAZZER et al., 2008; SABARATNAM et al., 2011; SPEJO et al., 2013).
O esmagamento de raízes medulares ventrais (ERV) provoca mudanças significativas no comportamento motor, uma vez que os circuitos espinais e motoneurônios são diretamente afetados (CARLSTEDT, 2009; CULLHEIM et al., 2002). Tanto a excitotoxicidade quanto a morte celular apoptótica parecem estar envolvidas nos mecanismos que levam à perda de motoneurônios lesionados em roedores neonatos. Uma hipótese muito aceita para explicar os motivos pelos quais os motoneurônios morrem após uma lesão nervosa propõe que a axotomia interrompe o suprimento de fatores de crescimento e tróficos derivados do alvo que são necessários para a sobrevivência desses motoneurônios imaturos (VEJSADA et al., 1998). Esses neurônios irão sofrer mudanças estruturais e morfológicas que variam de acordo com a população neuronal e idade do indivíduo, no entanto, ocorrem também mudanças nucleares, incluindo deslocamento nuclear, complexo desenvolvimento da membrana nuclear e condensação do nucléolo (SNIDER; ELLIOTT; YAN, 1992).
O esmagamento é um tipo de lesão menos severa em relação à avulsão, pois embora os ambos tipos de lesão provoquem a transsecção de axônios que sofrerão degeneração Walleriana, o esmagamento preserva a membrana basal das células de Schwann que circundam as fibras nervosas intactas, provendo assim uma via de orientação para os axônios em regeneração (MAZZER et al., 2008; SABARATNAM et al., 2011; SPEJO et al., 2013). Lesões da raiz ventral afetam especificamente o componente motor do nervo espinal. Quando ocorre o esmagamento dos axônios dos motoneurônios alfa e gama próximo ao corpo celular, na interface do SNC/SNP, inicia-se a degeneração da maioria dos motoneurônios afetados, como consequência da perda de conexão com as fibras musculares, interrompendo o fluxo anterógrado de fatores neurotróficos produzidos no órgão-alvo. A soma deste fato com o trauma mecânico acarreta na perda de sinapses, excitoxicidade do glutamato e gliose, obtendo uma taxa de 51% de morte neuronal. Em contrapartida, essa porcentagem vai para 80-90% no caso de avulsão nas quatro primeiras semanas após a lesão (KOLIATSOS et al., 1994; SPEJO et al., 2013).
1.4 – INTERFACE SNC- SNP
O sistema nervoso dos vertebrados é um órgão notavelmente complexo que consiste em uma rede intrincada de populações distintas de neurônios e células gliais de suporte, as quais formam circuitos neurais que permitem a sobrevivência do organismo. Este sistema elaborado
permite a comunicação entre os SNC e SNP via nervos periféricos, que são compostos de axônios motores e/ou sensoriais e suas glias associadas que se cruzam entre as duas porções do SN através de regiões especializadas conhecidas como zona de transição (ZT) (FONTENAS; KUCENAS, 2017). As fibras nervosas cruzam a ZT, sendo os oligodendrócitos e as células de Schwann responsáveis pela transição da mielinização no SNC e SNP, respectivamente (WANG et al., 2013). A ZT é uma região claramente definida onde as células gliais no SNC são separadas daquelas do SNP. Os axônios se projetam a partir da substância branca em feixes, saindo do osso que envolve a medula espinal, viajam pela ZT do SNC/SNP e finalmente adentram no SNP (HUANG; HUANG, 2006). Astrócitos se organizam no limite da superfície do SNC, constituindo uma estrutura transpassada por fibras mielinizadas e por pequenos feixes de axônios não mielinizados. Na transição de formação dos nervos periféricos, a glia limitante é geralmente mais volumosa do que aquela que presente no SNC. Ressalte-se que, na ZT, os tecidos nervosos central e periférico se interpõem e se sobrepõem. Assim, o início de cada raiz nervosa contém os dois tipos de tecido, tanto central quanto periférico. Os únicos elementos que atravessam completamente a ZT são os axônios. Aqueles que são mielinizados têm um nó de transição na interface SNC/SNP. As bainhas de mielina que fazem essa delimitação são formadas por células de Schwann e por uma unidade mielinizante oligodendrocítica centralmente (FRAHER, 2000). Os neurônios motores migram para alcançar seu destino final e estendem seus axônios para a periferia através de brechas na margem da medula espinal conhecidas como pontos de saída motores (PSM) das ZTs, enquanto seus corpos celulares permanecem no SNC. Os axônios sensoriais aferentes derivados nos neurônios sensoriais no SNP entram na medula espinal através de locais conhecidos como zonas de entrada da raiz dorsal (ZERD), que também são caracterizados por lacunas na lâmina basal da medula espinal (FRAHER, 1997). Estas ZTs refletem uma barreira altamente seletiva entre as duas metades do SN, segregando não apenas neurônios e axônios, mas também glia central e periférica. Em mamíferos também é encontrada uma barreira astrocítica nas ZTs (FONTENAS; KUCENAS, 2017).
1.5 – SINAPSES E PLASTICIDADE
Os neurônios encontram-se organizados em circuitos e comunicam entre si através de sinapses químicas. A sinalização neuronal envolve os seguintes passos: a propagação de um potencial de ação ao longo do processo axonal de um neurônio para um terminal pré-sináptico (que traz o sinal), a despolarização do terminal e liberação de neurotransmissores num espaço
muito delgado entre os dois terminais, chamado de fenda sináptica, a ligação dos neurotransmissores liberados aos receptores na membrana pós-sináptica de outro neurônio (onde é gerado um novo sinal), e a subsequente despolarização (caso o neurotransmissor seja excitatório) desse segundo neurônio, propagando ainda mais o sinal. Os neurotransmissores geralmente são sintetizados no corpo neuronal e armazenados em vesículas no terminal pré-sináptico até serem liberados na fenda através da exocitose durante a transmissão do impulso nervoso (ALLEN; BARRES, 2009; BEAR et al., 2007).
O glutamato é atualmente tido como o principal neurotransmissor excitatório no SNC. Durante a neurotransmissão glutamatérgica normal, o glutamato é liberado dos terminais pré-sinápticos em resposta à despolarização e atravessa a fenda sináptica para ativar os receptores pós-sinápticos, que são divididos em dois principais tipos: os que se encontram ligados à proteína G - chamados metabotrópicos - e os que formam canais iônicos, chamados ionotrópicos. Estes últimos podem ser receptores não-NMDA (AMPA e Kainato – canais permeáveis à Na+ e K+) e NMDA (canais permeáveis à Ca2+, NA+ e K+). É comum que durante lesões nervosas ocorra uma estimulação excessiva de receptores NMDA, devido ao excesso de glutamato, promovendo a entrada exacerbada de íons Ca2+ na célula, resultando na chamada excitotoxicidade glutamatérgica, que causa danos ao tecido nervoso. O glutamato deve ser empacotado em vesículas sinápticas para posteriormente ser liberado na fenda sináptica. As moléculas conhecidas por serem as responsáveis por esse processo são chamadas de vesículas transportadoras de glutamato 1 (VGLUT1) (HEATH; SHAW, 2002; SHAW, 1994).
No sistema nervoso central dos mamíferos, GABA e glicina são os principais neurotransmissores inibitórios. Na medula espinal, receptores GABA podem mediar a inibição pós-sináptica através da abertura de canais seletivamente permeáveis aos íons Cl- e K+, permitindo que esses ions transitem através da membrana. Quando a ligação de GABA aos seus receptores mantém o potencial pós-sináptico mais negativo do que o limite, diminuindo a chance de o neurônio pós-sináptico completar um potencial de ação, ocorre uma hiperpolarização (SUR; MCKERNANL; TRILLER, 1995).
Para controlar a excitabilidade neuronal, é fundamental que receptores GABA funcionais para sinapses estabeleçam e mantenham a transmissão inibitória, ou seja, a estabilidade de receptores GABA nas sinapses inibitórias são vitais para o controle da estabilidade neuronal no SNC. Sendo assim, o agrupamento de receptores nas membranas pós-sinápticas influencia muito na transmissão sináptica, e a capacidade de alterar a taxa e aumento da expressão do receptor nas sinapses é provavelmente um fator pós-sináptico importante subjacente à
plasticidade sináptica (THOMAS et al., 2005). Foi observado no estudo de Gupta et al que cada classe de formas de interneurônios se sincroniza com uma dinâmica temporal altamente específica em um determinado neurônio alvo (princípio de mapeamento de sinapses), sugerindo que as sinapses GABAérgicas restringem o impacto funcional de diferentes interneurônios de acordo com o tempo preciso dos potenciais de ação. Descobriram também que a natureza fenotípica dos neurônios pré e pós-sinápticos está envolvida na geração do tipo de sinapse formada, levando à supor que as interações entre dois neurônios poderiam ampliar a diversidade sináptica (GUPTA; WANG; MARKRAM, 2000).
O GABA (γ-ácido aminobutírico) é sintetizado através de uma reação enzimática catalisada pela L-glutamato descarboxilase (GAD) em neurônios pré-sinápticos. Existem duas isoformas de GAD, que são codificadas por dois genes: GAD65 e GAD67. O GAD65 está concentrado nos terminais nervosos em associação com as vesículas sinápticas, e alterações na função neuronal podem regular a síntese de GABA, alterando GAD. Foi demonstrado que o GAD é regulado pela fosforilação reversível e que suas duas principais isoformas – GAD65 e GAD67 - também. Em adição à isto, um influxo de Ca2+ pode dar início à um mecanismo que leva à ligação das vesículas sinápticas de GAD65 e subsequente ativação através da fosforilação por uma proteína quinase associada à membrana, levando à um aumento na síntese de GABA do transmissor (DAVIS; WU, 2001; JESSEN et al., 1979; SCHAFER; JONES, 1982).
A plasticidade neuronal é usada para descrever uma grande variedade de alterações na estrutura e função neuronais, e também é utilizada para descrever alterações bioquímicas e até morfológicas. Há estudos que evidenciam que as neurotrofinas (NTs) estão envolvidas nesses aspectos específicos da plasticidade neuronal (THOENEN, 1995).
A modulação da plasticidade neuronal através da modificação das NTs - genes de fatores de crescimento do nervo – é uma faceta relativamente nova. Essa suspeita se instaurou a partir da observação de que a síntese de NTs, em particular o fator neurotrófico derivado do cérebro (BNDF) e o fator de crescimento nervoso (NGF), é regulada muito rapidamente através da atividade neuronal. No entanto, outras moléculas como neuropeptídeos e citocinas também cumprem o papel modulatório (THOENEN, 2000).
Após uma lesão, a remodelação estrutural e funcional dos circuitos do SN é possível graças à plasticidade. Quando a lesão envolve a interrupção do contato entre o motoneurônio e as fibras musculares, os botões pré-sinápticos presentes na superfície da célula axotomizada sofrem retração. Além disso, após o período agudo pós-lesão, ocorre perda significativa dos inputs, diminuindo ou até anulando temporariamente a transmissão sináptica (DELGADO-GARCIA et al., 1988; PURVES, 1975). Na medula espinal, o número de contatos sinápticos
no corpo dos motoneurônios do tipo alfa e a região proximal de seus dendritos apresenta uma redução. Sabe-se que existe uma perda preferencial de inputs excitatórios dos motoneurônios, deixando os mesmos sob maior influência dos inputs inibitórios durante o processo de reparação, acarretando uma mudança no metabolismo desses MN para um estado em que o principal objetivo seja sobreviver e produzir novos axônios (CARLSTEDT, 2009). Assim, a célula lesada passa a apresentar um domínio de inputs inibitórios, refletindo uma reorganização sináptica em resposta à lesão, acarretando numa mudança metabólica de um estado de transmissão sináptica para um estado de recuperação dos axônios acometidos pela mesma (LINDA et al., 2000).
1.6 – DIMETIL-FUMARATO
Fármacos compostos por fumaratos são potentes agentes terapêuticos que influenciam múltiplas vias celulares. Fumaratos ésteres, particularmente o DMF, são terapêuticos aprovados para o tratamento das duas maiores doenças autoimunes – Esclerose múltipla e psoríase (GILLARD et al., 2015). O Dimetil-fumarato modifica quimicamente a proteína Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein-1), proporcionando a estabilização e a translocação nuclear do Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) com elevada diminuição da ativação de uma cascata de várias vias citoprotetoras e antioxidantes (KOBAYASHI et al., 2015).
O DMF estimula a via de ativação de respostas antioxidantes através da ativação do Nrf2, o qual pode influenciar a produção de citocinas pró-inflamatórias (GILLARD et al., 2015). O seu efeito imunomodulatório atua por conta da redução de citocinas (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-17 e TNF- ) em células imunes B e T, ativação ou supressão de células dendríticas (MHCII e MHCI), além de reduzir a migração das células imunes para o tecido. (ALBRECHT et al., 2012; MAGHAZACHI; SAND; AL-JADERI, 2016; VANDERMEEREN et al., 2001). Com o seu potencial antiinflamatório, anti-oxidante e pró-metabólico numa variedade de tipos celulares, o DMF pode inibir a resposta imune e exercer um efeito benéfico na atividade inflamatória (REICK et al., 2014; SCANNEVIN et al., 2012; SCHILLING et al., 2006). Seus efeitos neuroprotetores prolongam a sobrevivência e viabilidade da mielina dos axônios e neurônios e reduzem a inflamação da medula espinal em muitos modelos animais (SCHILLING et al., 2006).
Em virtude da eficácia clínica e segurança do DMF no tratamento da esclerose múltipla, existe uma grande expectativa no desenvolvimento de compostos fumarato de próxima
geração e no aumento do uso de fumaratos para novos tratamentos clínicos onde seu mecanismo multifuncional pode proporcionar novos benefícios (FOX et al., 2012; GILLARD et al., 2015).
A interação do DMF com o microambiente medular e seus efeitos sobre a sobrevivência neuronal e plasticidade sináptica em motoneurônios lesados devem ser estudados, incluindo análises funcionais, pois ainda existe uma grande incerteza entre a melhora funcional e a determinação dos reais mecanismos e efeitos a longo prazo envolvidos na administração do DMF para o sistema nervoso.
Certamente, nossos resultados servirão de base para o melhor conhecimento do DMF na regeneração nervosa e poderão contribuir para o futuro emprego clínico desta abordagem terapêutica, preenchendo uma importante lacuna nos procedimentos reparativos, após este tipo de lesão.
Sabendo que o esmagamento de raízes ventrais é um dos modelos de lesão mais utilizados pois causa a axotomia das fibras, mas preserva a membrana das células de Schwann, novas estratégias e terapias precisam ser desenvolvidas para o reparo dessas raízes. É nesse âmbito que será testada a utilização e eficácia do tratamento com DMF, como alternativa na regeneração dessas raízes, servindo como elemento neuroprotetor e imunomodulador, através de análises de sobrevivência neuronal, preservação sináptica, astrogliose, microgliose e inflamação.
