Guignardia citricarpa Kiely: análise genética cariotípica e interação com o hospedeiro
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(2) Dados Internacionais de catalogação na Publicação ICIPl DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - Campus "Luiz de Queiroz"/USP. Blanco, Chirlei Glienke de Cuignardia citricarpa Kiely: análise genética, cariotipica e interação com o hospedeiro/ Chirlei Glienke de Blanco. - - Piracicaba, 1999. 200 p.: il. Tese (doutorado} - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 1999. Bibliografia. 1 . Análise genética 2. Ascomiceto 3. Eletroforese de campo pulsado 4_ Fungo endofitico 5. Mancha-preta-dos-citros 6. Marcador molecular 7. Mutação 8. Transformação genética 1. Titulo CDD. '5�'L23.
(3) ii. Ao meu pai Elirio (in memoriam) pelo exemplo, amor e incentivo. Dedico. A minha mãe Iracema, a grande responsável pela minha formação. Aos meus irmãos Clóvis e Cintia, pelo incentivo e apoio durante todo a minha vida. Ao meu marido Humberto, companheiro e amigo de todas as horas, pela paciência, apoio, incentivo e amor, especialmente nos momentos difíceis.. Ofereço..
(4) iii. AGRADECIMENTOS Agraàeço a Deus por tudo que Ele proporcionou-me durante minha vida e especialmente durante esta etapa. Agradeço pelos momentos bons e em especial pelos ruins, quando as dificuldades que surgiram em meu caminho pareceram-me intransponíveis, e Ele por meio delas, revelou-me Seu amor e Sua Graça. Agradeço a todas as pessoas que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho, em especial: Ao Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo pela sua orientação, confiança, estímulo e exemplo ao longo do curso. Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudo. A FUNP AR pelo auxílio financeiro concedido. Ao Departamento de Genética da Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"- ESALQ, pela oportunidade concedida para a realização do curso. A Profa. Aline Pizzirani-Kleiner, pela acolhida no Laboratório de Genética de Microrganismos do Departamento de Genética da ESALQ, pelo apoio e orientação nos momentos difíceis. A todos os colegas do Laboratório de Genética de Microrganismos do Departamento de Genética, ESALQ, pelo carinho, incentivo e pela paciência. Ao Dr. Walter Maccheroni Júnior, por todo auxílio, orientação e estímulo durante todo o curso. Aos professores do Departamento de Genética da ESALQ por todo conhecimento, apoio e colaboração ao longo de todo o curso. A todos os colegas e amigos do Departamento de Genética e de outros Departamentos da ESALQ pelo carinho, amizade e incentivo, especialmente Luciana Ribeiro, Josué, Cláudio, Gilberto, Ismael, Luiz Cláudio, Carlos Aguilar, Paulo Barroso, Luiz Humberto, Solange, Sallete, Vera Lúcia, Célia Malvas, Nelson Wulff. Às bibliotecárias Silvana Gregório, Silvana Oliveira e Elizabeth pela disponibilidade e amizade..
(5) iv. Aos funcionários e amigos do Departamento de Genética da ESALQ, em especial, Zezo, Carmem, Adriana, Léia, Fernando, Carlinhos, Oberdan, Cezar pelo apoio e paciência em toàos os momentos. Ao Departamento de Genética da Universidade Federal do Paraná (UFPR), pelo apoio na realização dos trabalhos. Às colegas do Laboratório de Genética de Microrganismos do Departamento de Genética da UFPR, pela amizade, paciência e incentivo em todos os momentos. Aos professores do Departamento de Genética da UFPR, em especial Lygia, Margarete, Juarez e Cunha pelo apoio concedido nos momentos dificeis. A todos os Laboratórios do Departamento de Genética da UFPR que contribuíram para a realização deste trabalho em especial os Laboratórios de Genética Humana e o Laboratório de Polimorfismos e Ligação. Aos funcionários do Departamento de Genética da UFPR, em especial Izolde, Marli e Jorge pela amizade e auxílio em todos os momentos. Ao Departamento de Bioquímica da UFPR pela colaboração durante o desenvolvimento deste trabalho. À Profa. Nilce M. Martinez Rossi do Laboratório de Genética de Microrganismos do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP)/USP, pela valorosa contribuição na realização deste trabalho. À todos os amigos do Laboratório de Genética de Microrganismos do Departamento de Genética da FMRP/USP pelo auxílio, amizade e acolhida nos momentos que aí passei. Ao Centro de Citricultura Sylvio Moreira do Instituto Agronômico de �ampinas pelo apoio concedido. Aos amigos Vania, Guilherme e Lucas pela amizade, incentivo e toda colaboração em todos os momentos..
(6) V. SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS........................................................................................................... xi LISTA DE TABELAS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••• xiv LISTA DE ANEXOS•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• xvi. .... LISTA DE APENDICES ••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• xvii RESUMO.......................................................................................................................... xviii SUMMARY •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••xx 1. INTRODUÇAO •••••••••••••.••••.•••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••• 01 -. 2.- REVISAO DE LITERATURA•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 04 2.1. Fungos Endofiticos........................................................................................................ 04 2.1.1. Considerações Gerais................................................................................................. 04 2.1.2. Relação com o Hospedeiro ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 06 2.1.2.1. Desempenho da Planta•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 10 2.1.2.2. Resistência a Herbivoria ••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11 2.1.2.3. Antagonismo a Microrganismos Patogênicos......................................................... 12 2.1.3. Especificidade com o Hospedeiro .............................................................................. 13 2.1.4. Endófitos e Patógenos Latentes ................................................................................. 15 2.1.5. Isolamento .................................................................................................................. 18 2.2. O Gênero Guignardia Viala & Ravaz (Anam.: Phyllosticta Pers. ex Desm.)............... 19 2.2.1. A Espécie Guignardia citricarpa Kiely (anamorfo: Phyllosticta citricarpa (McAlp.) Van der AA •••••••••••.•••••••••••••••••••••••.••••.•.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••• 21 2.3. Genes e Fatores Envolvidos com a Interação Fungo-Planta........................................ 23 2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) .......................................................... 28 2.5. Clonagem e Seqüenciamento ••••••••.••••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••• 32 2.5.1. Vetores de Clonagem •..••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••..•••••••••••••••.••.•••••.•••••••••••••••• 32 2.5.2. Seqüenciamento •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 33 2.6. Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)...................................................................... 34 2.7. Obtenção de Mutantes .................................................................................................. 37 2.7.1. Mutantes Auxotróficos............................................................................................... 38 2.7.2. Mutantes Morfológicos ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••• 38 2.7.3. Outros Tipos de Mutantes •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••.•••••••.• 41.
(7) vi. 2.8. Sistemas de Transformação Genética .......................................................................... 41 2.8.1. Métodos de Transformação Genética........................................................................ 43 2.8..2. Marcadores Seletivos Dominantes............................................................................. 47 2.8.3. O Plasmídio pCSN43 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 50 2.9. Microscopia Otica e Eletrônica de Varredura ............................................................. 51 3. METODOLOGIA ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 53 3.1. Meios de Cultura •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 53 3.1.1. Meio Mínimo (MM) (Pontecorvo et ai., 1953) ........................................................... 53 3.1.2. Meio Completo (MC) de Pontecorvo, modificado por Azevedo & Costa (1973)....... 53 3.1.3. Meio MCT •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 54 3.1.4. Meio MEASP (Modificado de Paterson & Bridge, 1994) ......................................... 54 3.1.5. Meio YEPD ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••º••ºººººººººººººººººººº.ººººªº 54 3.1.6. Meio LB (Sambrook et ai., 1989)••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 55 ,. ,. 3.1.7. Meio Agar-Agua••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 55 3.1.8. Meio Glicose •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 55 3.1.9. Meio Sacarose ......................................................................................................... 56 3.2. Soluções e Tampões ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 56 3.2.1. Acetato de Lítio.......................................................................................................... 56 3.2.2. Acetato de Sódio 3M pH 5,2 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 56 ,. 3.2.3. Acidos Nucleicos......................................................................................................... 56 3.2.4 Aminoácidos•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 57 3.2.5. Brometo de Etídio (Sambrook et ai, 1989) ................................................................ 57 3.2.6. Clorofane.................................................................................................................... 57 3.2.7. Clorofil ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 57 3.2.8. EDTA 50 mM pH 8,0 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 57 3.2.9. EDTA 500 mM pH 8,0 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 58 3.2.10. Fenol saturado (Sambrook et ai., 1989), modificado............................................... 58 3.2.11. Gel de agarose (0,8%) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 58 3.2.12. Gel de agarose (1,5%) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 58 3.2.13. Gel de agarose para PFGE (0,8o/o) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 58 3.2.14. Gel de agarose para PFGE (1,0%) ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 59 3.2.15. Gel de agarose ''LGT'' (1,4%)................................................................................. 59 3.2.16. Gel de Poliacrilamina Desnaturante 6o/o ................................................................. 59.
(8) vii. 3.2.17. Hidrato de Chloral (Bruzzese & Hasan, 1983) ........................................................ 59 3.2.18. IPTG ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 59 3e2�19== Manitol 0,6 M pH 5,8 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 60 3.2.20. Manitol 1,2 M pH 5,8 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 60 3.2.21. MgSO4 1,2 M pH 5,8 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 60 3.2.22. NaCI 5M •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 60 3.2.23. NDS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 61 3.2.24. RNase ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 61 3.2.25. Salina 0.85% (p/v) ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 61 3.2.26. Solução A para Transformação Fúngica (SATF) ................................................... 61 3.2.27. Solução B para Transformação Fúngica (SBTF) .................................................... 61 3.2.28. Solução A para Transformação Bacteriana (SATB)............................................... 62 3.2.29. Solução B para Transformação Bacteriana (SBTB) ............................................... 62 3.2.30. Solução A para Plasmídio ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 62 3.2.31. Solução B para Plasmídio ••••••••••••••••••••••••••••..••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••• 62 3.2.32. Solução C para Plasmídio •••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 63 3.2.33. Solução Clareadora (Bruzzese & Hasan, 1983)....................................................... 63 3.2.34. Solução Desnaturante •••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 63 3.2.35. Solução Neutralizante .............................................................................................. 63 3.2.36. Sorbitol 0,6 M........................................................................................................... 63 3.2.37. SSC 20x •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 64 3.2.38. Tampão da amostra (6x) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••• 64 3.2.39. Tampão de corrida TAE 10X •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 64 3.2.40. Tampão de corrida TEB l0x pH8.0 •••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••• 64 3.2.41. Tampão de extração de DNA (Raeder & Broda, 1985) .......................................... 65 3.2.42. Tampão Fosfato (TF) 0,2 M pH 5,8 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 65 3.2.43. Tampão Tris-EDTA (TE) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 65 3.2.44. Tampão S •••••••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 65 3.2.45. Tampão W•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 66 3.2.46. Tween-80 0.1 % (v/v) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••• 66 3.2.47. Vitaminas ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 66 3.2.48. X-GAL...................................................................................................................... 66 3.3. Plasmídios ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••• 67.
(9) viii. 3.4. Amostras Foliares ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 67 3.5. Material Biológico......................................................................................................... 67. 3e5ele Escherickia coli DH5a.F' (Sambrook et al., 1989) ..................................................... 67 3.5.2. Escherichia coli DH510D ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 67 3.5.3. Saccharomyces cerevisae •.••••.••...•.•.•.•••..•••..•••...•....•..•.••..••.•...••.•••••.•...•.•••.•••......•..••.... 61 3.5.4. Guignardia spp ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 67 3.6. Isolamento de Fungos Endofíticos................................................................................ 70 3.7. Manutenção do Estoque •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••• 70 3.8. Obtenção de Solução de Esporos••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••• 70 3.9. Análise da Variabilidade Genética por RAPO ............................................................ 71 3.9.1. Extração de DNA ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 71 3.9.1.1. Método Convencional (Raeder & Broda, 1985) ..................................................... 71 3.9.1.2. Método Liofilizado ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••º••ºººº····························· 71 3.9.2. Amplificação do DNA (PCR) ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••• 72 3.9.3. Análise de Polimorfismo ............................................................................................ 72 3.10. Discriminação de Isolados Patogênicos ...................................................................... 73 3.10.1.Obtenção da banda ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 73 3.10.2. Clonagem do Fragmento p373••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 73 3.10.2.1. Ligação •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 73 3.10.2.2. Obtenção de Células bacterianas competentes para eletroporação ..................... 74 3.10.2.3. Transformação bacteriana por eletroporação...................................................... 74 3.10.2.4. Purificação do plasmídio por Lise alcalina........................................................... 75 4.10.3. Seqüenciamento •.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••.••••••••• 75 3.10.4. ''Southern Blotting'' e Hibridação ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 76 3.10.4.1. ''Southern Blotting'' •••••••••••••••.••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••• 76 3.10.4.2. Marcação da sonda ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 77 3.10.4.3. Hibridação••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 77 3.10.5. PCR ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 78 3.11. Cariótipo Eletroforético••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••.•••••••• 78 3.11.1. Obtenção de Protoplastos (Silveira & Azevedo, 1987, com modificações) ............. 79 3.11.2. Preparação de células de Saccharomyces cerevisae ................................................. 79 3.11.3. Preparação dos ''Plugs'' •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••• 79 3.11.4. Eletroforese em Campo Pulsado.............................................................................. 80.
(10) ix. 3.11.4.1. Protocolo 1............................................................................................................. 80 3.11.4.2. Protocolo 2••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 80 3.11.4.3. Protocolo 3............................................................................................................. 81 3.12. Caracterização Morfo-fisiológica .............................................................................. 81 3.12.1. Curva de Crescimento ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 82 3.12.2. Estudo do Tipo e Tamanho das Estruturas de Reprodução.................................. 82 3.12.3. Curva de Germinação in vitro ••.••••••••••.•••••....•..•••.•••••..•••••..•...•.•••.•.••.•••••...••••.•••.••••• 82 3.12.4. Germinação in vivo.................................................................................................. 83 3.12.5. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ........................................................ 84 3.13. Extração e Purificação de Exopolissacarídios............................................................ 84 3.14. Obtenção de Mutantes................................................................................................ 85 3.15. Transformação Genética ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••ºº.ºº••ººººººº 86 3.15.1. Seleção do Marcador••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••""·· 86 3.15.2. Obtenção do Plasmídio •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 86 3.15.2.1. Obtenção de Células Bacterianas Competentes para Transformação por CaCh 86 3.15.2.2. Transformação de E.coli•••.•••.•.•.••••..••..•••......••.•.•..••.....••...•.•.•..•••.••.•••••••..••••••••••.•. 87 3.15.2.3. Purificação do plasmídio pCSN43 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 87 3.15.3. Transformação de protoplastos ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 88 3.15.4. Transformação de Células Intactas com Auxilio de Acetato de Lítio .................... 88 3.15.5. Estabilidade Mitótica dos Transformantes ............................................................-. 89 3.15.6. Análise dos Transformantes via PCR...................................................................... 89 4. RESULTADOS E DISCUSSAO ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 90 4.1. Isolamentos de fungos endofíticos ................................................................................ 90 4.2. Extração de DNA •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 90 4.3. RA.PD •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 91 4.4. Diagnóstico Molecular de Isolados Patogênicos.......................................................... 102 4.4.1. Clonagem e Sequenciamento .................................................................................... 102 4.4.2. ''Southern Blot''•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 104 4.4.3. PCR ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 104 4.5. Cariótipo Eletroforético••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 107 4.6. Caracterização Morfológica •••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 111 4.6.1. Curva de Crescimento •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 111 4.6.2. Tipo de Esporulação in vitro e Tamanho dos Esporos ............................................. 125.
(11) X. 4.6.3. Curva de Germinação in vitro .••.•..•.•••.•.•..•••......•••.........•.••••.....••.••••...............•.•••..... 131 4.6.4. Germinação in vivo •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••134 4.6.5. Microscopia Eletrônica de Varredura...................................................................... 134 4.7. Extração e Purificação de Exopolissacarídios............................................................. 138 4.8. Obtenção e Caracterização de Mutantes..................................................................... 140 4.8.1. Curva de Sobrevivência •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 140 4.8.2. Obtenção de Mutantes •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 142 4.9. Transformação Genética ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 145 4.9.1. Transformação de protoplastos ................................................................................ 146 4.9.2. Transformação de Células Intactas ......................................................................... 146 4.9.3. Estabilidade Mitótica dos Transformantes .............................................................. 146 4.9.4. Análise dos Transformantes via PCR....................................................................... 146 5. CONCLUSOES •••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••• 149 ANEXOS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 151 A. r. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 165 APENDICES •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 197.
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