FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
LARISSA RIBAS FONSECA
FORMAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS POR COMPLEXAÇÃO
ELETROSTÁTICA EM MICROCANAIS VISANDO VEICULAÇÃO
DE COMPOSTOS ATIVOS
COMPLEXING ELECTROSTATIC NANOPARTICLES IN
MICROCHANNELS AIMING AT VEHICULATION OF ACTIVE
COMPOUNDS
CAMPINAS
2020
FORMAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS POR COMPLEXAÇÃO
ELETROSTÁTICA EM MICROCANAIS VISANDO VEICULAÇÃO
DE COMPOSTOS ATIVOS
COMPLEXING ELECTROSTATIC NANOPARTICLES IN
MICROCANALS AIMING AT VEHICULATION OF ACTIVE
COMPOUNDS
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de
Mestra em Engenharia de Alimentos.
Dissertation presented to the Faculty of Food Engineering at the State University of Campinas as part of the require- ments for obtaining a Master´s Degree in Food Engineering
Orientadora: Profa. Dra. Rosiane Lopes da Cunha
CAMPINAS
2020
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA LARISSA RIBAS FONSECA E ORIENTADA PELA PROFª DRª ROSIANE LOPE DA CUNHAUniversidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano – CRB 8/5816
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Complexing nanoparticles electrostatic in microchannels aiming at vehiculation of active compounds
Palavras-chave em inglês: Microfluidics Electrostatic interactions Polysaccharides Encapsulation
Área de concentração: Engenharia de Alimentos Titulação: Mestra em Engenharia de Alimentos
Banca examinadora:
Rosiane Lopes da Cunha [Orientador] Lucimara Gaziola de la Torre Carolina Siqueira Franco Picone Data de defesa: 10-03-2020
Programa de Pós-Graduação: Engenharia de Alimentos Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-7642-1408
- Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/2202535501051393
Fonseca, Larissa Ribas, 1994-
F733f Formação de nanopartículas por complexação eletrostática em microcanais visando a veiculação de compostos ativos / Larissa Ribas Fonseca. – Campinas, SP : [s.n.], 2020.
Orientador: Rosiane Lopes da Cunha.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
1. Microfluidica. 2. Interação eletrostática. 3. Polissacarídeos. 4. Encapsulação. I. Cunha, Rosiane Lopes. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
BANCA EXAMINADORA
Profª. Dra. Rosiane Lopes da Cunha
(FEA/UNICAMP - Orientadora)
Profª. Dra. Lucimara Gaziola De La Torre
(FEQ/ UNICAMP – Membro Titular)
Profª. Dra. Carolina Siqueira Franco Picone
(FEA/ UNICAMP – Membro Titular)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
A vida é como uma montanha russa, tem seus altos e baixos, a escalada é difícil mas a vista é linda. (Autor desconhecido)
À Deus por sempre iluminar e guiar meus caminhos e por me dar forças para sempre seguir em frente, mesmo sendo um caminho difícil.
Aos meus pais Lucileia e Mauricio por tudo que tem feito e já fizeram por mim, por todo o apoio, paciência, força e por sempre estarem me guiando nesta vida sem medir esforços para me ajudar em busca do meu sonho.
À professora Dra. Rosiane Lopes da Cunha por acreditar em mim, por todo o apoio e conselhos, por ser um exemplo de professora e pela admirável orientação e parceria.
Aos membros da banca examinadora por todo o auxílio e correções que contribuíram para um melhor desenvolvimento do trabalho apresentado.
À Faculdade de Engenharia de Alimentos (a querida FEA), aos professores pelos ensinamentos e aos funcionários pela ajuda e apoio.
Aos meus avôs de ambas as partes da família por sempre acreditarem em mim e me apoiarem de modo inimaginável pela busca dos meus sonhos.
Aos meus queridos amigos de BH e Campinas, que sempre estavam presentes, não importando a distância, que sempre me apoiam em cada conquista, que torcem por mim em todos os momentos e que tem sido imensurável todo o carinho que tem por mim.
A todos os amigos e colegas de laboratório que me auxiliaram neste trabalho, tornando-o ptornando-ossível. Em especial à Tatiana, Aline e Paula ptornando-or ttornando-oda a ajuda e aptornando-oitornando-o.
À equipe dos laboratórios de microfabricação e LNNano do Cnpem pelos ensinamentos, pela ajuda e apoio.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001 e processo n° 88882.329560/2018-01.
A formação de nanopartículas para sistemas de encapsulamento pode ser realizada por vários processos e, entre eles, pode-se citar os processos espontâneos, que são simples e produzidos com baixo consumo de energia. Dentre esses processos encontra-se a complexação eletrostática que ocorre entre pelo menos dois polímeros com cargas opostas que interagem através de forças intermoleculares. A quitosana é um polissacarídeo carregado positivamente que apresenta propriedades mucoadesivas, porém apresenta baixa solubilidade em água. Nesse sentido, a hidrólise enzimática deste composto surge como uma alternativa para garantir maior homogeneidade e solubilidade na formação dos complexos. A gelana é um polissacarídeo aniônico solúvel em água e resistente a baixos valores de pH, o que facilita sua utilização como material encapsulante. Nesse contexto, este estudo teve como objetivo avaliar a formação de nanopartículas através da produção de complexos eletrostáticos utilizando a gelana (G) em combinação com a quitosana (C) ou a quitosana hidrolisada (HC), obtida a partir de hidrólise enzimática. Dois diferentes métodos foram utilizados para a produção das nanopartículas e comparados, “bulk” e microfluídica, sendo estas partículas incorporadas de cafeína em diferentes condições de processo. As nanopartículas foram caracterizadas quanto às seguintes análises: potencial zeta, distribuição de tamanho, índice de polidispersão (PDI), MEV-T (microscopia eletrônica de varredura no modo de transmissão), cristalinidade, turbidez, FTIR (espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier) e eficiência de encapsulação da cafeína. De modo geral, a hidrólise da quitosana permitiu a formação de estruturas menores e mais solúveis, o que facilitou a formação dos complexos. Além disso, partículas com maior concentração de gelana (razões G:C ou G:HC de 7:3 e 8:2) foram as que mostraram menor potencial zeta, tamanho de partícula e polidispersão. Dentre os processos utilizados, a microfluídica permitiu obter complexos com menor polidispersão (PDI ~0.1) e tamanho médio (~200 nm). No entanto, ambos os métodos de formação dos complexos permitiram o encapsulamento da cafeína, porém a microfluídica foi mais eficaz mostrando eficiência de encapsulação de aproximadamente 70%. Sendo assim, os resultados obtidos permitem afirmar que a microfluídica é uma técnica mais eficiente para a formação de nanocomplexos incorporados de cafeína quando comparada a processos tradicionais.
Palavras-chaves: Microfluídica, interações eletrostáticas, polissacarídeos e encapsulação.
The synthesis of nanoparticles for encapsulating systems can be carried out by various processes and, among them, there are spontaneous processes which are simple and produced with low energy consumption. Among these processes is the electrostatic complexation that occurs between at least two oppositely charged polymers interacting by intermolecular forces. Chitosan is a positively charged polysaccharide that shows mucoadhesive properties, but has low water solubility. In this sense, the enzymatic hydrolysis of this compound emerges as an alternative to ensure greater homogeneity and solubility in the complex formation. Gellan is a water-soluble anionic polysaccharide resistant to low pH values, which facilitates its use as an encapsulating material. In this context, this study aimed to evaluate the formation of nanoparticles by the production of electrostatic complexes using gellan (G) in combination with chitosan (C) or hydrolyzed chitosan, obtained from enzymatic hydrolysis. Two different methods were used for the production of nanoparticles and compared, bulk and microfluidic, and different process conditions were used to incorporate caffein in these particles. The nanoparticles were characterized according to the following analyzes: zeta potential, size distribution, polydispersity index (PDI), STEM (scanning transmission electron microscopy), crystallinity, turbidity, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and encapsulation efficiency. In general, the hydrolysis of chitosan allowed the formation of smaller and more soluble structures, which facilitated the formation of complexes. In addition, the particles with a higher gellan concentration (ratios G: C or G:HC of 7: 3 and 8: 2) showed the lowest zeta potential, particle size and polydispersity. Among the processes used, microfluidics allowed to obtain complexes with less polydispersity (PDI ~ 0.1) and lower mean size (~ 200 nm). However, both methods of complex formation allowed caffeine encapsulation, but microfluidics showed higher encapsulation efficiency (~ 70%). Thus, our results showed that microfluidics is a more efficient technique for the formation of nanocomplexes incorporated with caffeine as compared to traditional processes.
Capítulo 2
Figura 1-Representação exemplificada do processo de desacetilação da quitina produzindo a quitosana. (Fonte: PICONE,2012)...28
Figura 2- Esquema referente às alterações químicas induzidas pelas alterações de pH na solução de quitosana. (A) Ligações de hidrogênio; (B) Protonação do grupamento amino e (C) Repulsão eletrostática (Fonte: FARRIS, et al., 2012)...29
Figura 3-Estrutura química da gelana. (Fonte: PRAJAPATI, et.al., 2013)...30
Figura 4-Representação esquemática de um microcanal de PDMS.(Fonte: FOCSAN, et
al., 2016)...34
Figura 5-Representação esquemática das três geometrias mais utilizadas em microcanais (junção em T, co-fluxo, focalização hidrodinâmica). (Fonte: Li, et al., 2018)...35
Capítulo 3
Figure 1. SEM of the polysaccharides: chitosan (A), hydrolyzed chitosan (B) and gellan gum (C). Scale bar = 500 µm………..………56
Figure 2. Zeta potential of chitosan (●), hydrolyzed chitosan ( ), and gellan gum (▲) dispersions at different pH values………..…….57 Figure 3. Flow curves of polysaccharides solutions (0.01% (w /w)) at pH 4.5. Chitosan (C- ■), hydrolyzed chitosan (HC-▲) and Gellan gum (G- ●)……….…..60 Figure 4. FTIR spectra of chitosan (C- dashed curve), hydrolyzed chitosan (HC- dotted curve) and gellan gum (G- continuous curve)……….62
Figure 5. X-ray diffractograms of chitosan (A), hydrolyzed chitosan (B) and gellan gum (C)………65
Figure 6. Representative curve of size distribution. A- Complexes formed by chitosan (C) and gellan (G) and B -Complexes formed by hydrolyzed chitosan (HC) and gellan at pH 4.5. Ratios G:C or G:HC- 10:0 (black curve), 9:1 (black dashed curve), 8:2 (segmented dark curve with dots), 7:3 (dashed grey curve), 6:4 (dotted grey), 5:5 (segmented grey curve with dots) and 0:10 (grey curve)………68
Figure 7. Turbidity and transmittance of the complexes chitosan (C):gellan (G) or hydrolyzed chitosan (HC): gellan(G). Bar graphs refers to transmittance: C: G (light grey) and HC:G (dark grey). Line graphs referes to turbidity: C: G (grey dashed curve - ●) and HC: G (black curve - ▲). Differents letters indicate turbidity significant differences between complexes formed with hydrolyzed chitosan or chitosan (p<0.05)……….70
Capítulo 4
Figure 1. Representation of A) C-simple (34 mm) and B) C-long (145 mm) microchannels………..83 Figure 2. C-simple (A) and C-long (B) designs used for the complexes formation. Processes performed in conditions of high flow (HF) rates. The side streams correspond to gellan solution, while the central stream is related to chitosan solution. Scale bar=
200µm....………..………90
Figure 3. C-simple (A) and C-long (B) designs used for the complexes formation at high flow rates. The side streams correspond to gellan gum and chitosan solutions, while the central stream is related to acidified water. Red arrows indicate the junction of the two biopolymer streams and the water stained with Rhodamine B. Scale bar= 200 µm.……90
Figure 4
.
Morphology of the electrostatic complexes evaluated in different G:C or G:HCratios (7:3 and 8:2) and formation process (bulk and microfluidics at high flow rates). G= gellan gum, C= chitosan and HC = hydrolyzed chitosan. Scale bar= 500 nm (left) and 300
nm (right), respectively...95 Figure 5. Morphology of the electrostatic complexes with caffeine in different G:C or G:HC polysaccharide ratios (7:3 and 8:2) and formation process (bulk and microfluidics at high flow rates). G= gellan gum, C= chitosan and HC = hydrolyzed chitosan. Scale bar= 500 nm (left) and 300 nm (right), respectively………..………..98
Figure 6. FTIR spectra of polysaccharides (gellan (G), chitosan (C) and hydrolyzed chitosan (HC) and electrostatic complexes formed by both methods (bulk and microfluidics C-long) at a 7:3 (G:C or G:HC) ratio. The black arrows show the appearance of a new band, suggesting a possible interaction between G and C or HC. Peaks around 3000 cm-1 are highlighted to compare their intensity in the polysaccharides and after the formation of the complexes.……….………..………..99
Figure 7. FTIR spectra of polysaccharides (gellan (G), chitosan (C) and hydrolyzed chitosan (HC), caffeine, and electrostatic complexes formed by both methods (bulk and microfluidics C-long) at the 7:3 (G:C or G:HC) ratio. The black arrows show the appearance of a new band, suggesting a possible interaction between G and C or HC. Highlighted peaks suggest the possibility of a slight interaction of caffeine with polysaccharides………..………100 Figure 8. Encapsulation efficiency (EE) of caffeine using different process conditions and polysaccharide ratios (G:C or HC). G=gellan gum, C= chitosan (gray bars) and HC= hydrolyzed chitosan (black bars). Microfluidic process was performed at high flow rates conditions (HF). Different letters indicate significant differences (p <0.05). Capital letters
simple and C-long) keeping the polysaccharide ratio constant………...102
Figure 1. Particle size distribution of the electrostatic complexes formed by (A), (B), (C) and (D) microfluidics process. (A) C-Simple LF, (B) C-Simple HF, (C) C-Long LF and (D) C-Long HF microfluidic designs and (E) bulk process. The ratios used were 8G:2C (- - -), 7G:3C (- - -), 8G:2HC ( ___ ) and 7G:3HC ( __). G= gellan gum, C= chitosan and HC= hydrolyzed chitosan. Flow conditions: LF = Low flow and HF= High flow………109 Figure 2. Particle size distribution of the electrostatic complexes with caffeine formed by (A), (B), (C) and (D) microfluidics. (A) C-Simple LF, (B) C-Simple HF, (C) C-Long LF and (D) C-Long HF microfluidic designs and (E) bulk process. Polysaccharide ratios were 8G:2C (- - -), 7G:3C (- - -), 8G:2HC ( ___ ), 7G:3HC ( __). G= gellan gum, C= chitosan and HC= hydrolyzed chitosan. Flow conditions: LF = Low flow and HF= High flow………110
LISTA DE TABELAS
Capítulo 3
Tabela 1.Composition of the complexes formed by either chitosan (C) or hydrolyzed chitosan (HC) and gellan gum (G)...52
Table 2. Zeta Potential, mean size and polydispersity (PDI) of polysaccharide dispersions at different pH values……….…..59 Table 3. Intrinsic viscosity and molecular weight of polysaccharides dispersions…….61 Table 4. Zeta potential and mean diameter of nanocomplexes formed in different polysaccharide proportions (gellan and chitosan or hydrolyzed chitosan) measured after 24h of preparation………....67
Capítulo 4
Table 1. Composition of the complexes formed by either chitosan (C) or hydrolyzed chitosan (HC) and gellan gum (G)………...83
Table 2. Flow rate of the phases used for the complexes formation related to each polysaccharide ratio. C: chitosan, HC: hydrolyzed chitosan; G: gellan gum and W: deionized water. The flow rates are represented as LF (low flow) and HF (high flow)..85
Table 3. Processes parameters evaluated for the two microfluidics designs (C-simple and C-long) operating in two different flow rates in the formation of electrostatic complexes………91
Table 4. Zeta potential, polydispersity index (PDI) and peak mode of the electrostatic complexes formed using different ratios of polysaccharides (gellan gum (G) and chitosan (C) or hydrolyzed chitosan (HC)) measured after 24h of preparation. LF = Low flow and HF= High flow……….96
Table 5. Zeta potential, polydispersity index (PDI) and peak mode of the electrostatic complexes formed using different ratios of polysaccharides (gellan gum (G) and chitosan (C) or hydrolyzed chitosan (HC)) with caffeine measured after 24h of preparation. LF = Low flow and HF= High flow. ………97
INTRODUÇÃO GERAL E OBJETIVOS ... 16
1. INTRODUÇÃO ... 17
2. OBJETIVOS ... 19
3. ORGANIZAÇÃO DA DISSERTAÇÃO EM CAPÍTULOS ... 19
4. REFERÊNCIAS ... 21 - CAPÍTULO 2 – ... 23 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 23 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 24 1.1. NANOTECNOLOGIA ... 24 1.4. QUITOSANA ... 27 1.5. GELANA ... 30 1.6. CAFEÍNA ... 31 1.7. MICROFLUÍDICA ... 32 2. REFERÊNCIAS ... 36 - CAPÍTULO 3 – ... 47 ABSTRACT ... 48 1.Introdution ... 49
2.Material and Methods ... 51
2.1.Material ... 51
2.2.Methods ... 51
2.2.1. Purification of chitosan ... 51
2.2.2. Chitosan hydrolysis ... 51
2.2.3. Preparation of polysaccharides solutions (stock solutions) ... 52
2.2.4. Preparation of complexes ... 52
2.2.5. Polymers and complexes characterization ... 52
2.2.5.1. Particle size distribution and zeta potential ... 52
2.2.5.2. Intrinsic viscosity and molecular weight ... 53
2.2.5.3. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) ... 54
2.2.5.4. Crystallinity index ... 54
2.2.5.5.Transmission Scanning Electron Microscopy (STEM) ... 54
2.2.5.6. Turbidimetric titration ... 55
2.2.6. Statistical analyses ... 55
3.1.1. Morphology ... 55
3.1.2 Particle size distribution, polydispersity and zeta potential ... 56
3.1.3. Rheological properties, intrinsic viscosity and molecular weight of the polysaccharides ... 59
3.1.4. FTIR ... 61
3.1.5. X-ray diffractogram (XRD) ... 63
3.2. Characterization of the complexes ... 66
3.2.1 Zeta potential, size distribution and polydispersity (PDI) ... 66
3.2.2. Turbidity and morphology of complexes ... 69
4. Conclusion ... 70 Acknowledgements ... 71 REFERENCES: ... 71 - CAPÍTULO 4 – ... 77 Abstract ... 78 1. Introduction ... 78
2. Material and methods ... 81
2.1. Material ... 81 2.1.1. Complexes ... 81 2.1.2. Microfluidic devices ... 81 2.2. Methods ... 81 2.2.1. Purification of chitosan ... 81 2.2.2. Chitosan hydrolysis ... 82 2.2.3. Preparation of complexes ... 82
2.2.4. Microfluidic devices fabrication ... 83
2.2.5. Complexes formation within microchannels ... 84
2.2.6. Encapsulation of caffeine as a hydrophilic bioactive model compound ... 85
2.2.7. Evaluation of the process parameters ... 86
2.3. Complexes characterization ... 87
2.3.1. Zeta potential and particle size distribution ... 87
2.3.2. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) ... 87
2.3.3. Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) ... 88
2.3.7. Caffeine Quantification ... 88
2.4. Statistical analyses ... 89
3.1.1 Flow and mixing patterns ... 89
3.2. Characterization of the electrostatic complexes ... 91
3.2.1 Particle size distribution and zeta potential ... 91
3.2.1.1. Caffeine-free complexes ... 91
3.2.1.2. Caffeine-encapsulating complexes ... 92
3.2.2. Morphology ... 93
3.2.3. Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) ... 98
3.2.4. Encapsulation efficiency of caffeine ... 100
4. CONCLUSION ... 102 Acknowledgements ... 103 REFERENCES ... 103 SUPPLEMENTARY MATERIAL (MS) ... 109 - CAPÍTULO 5 – ... 111 DISCUSSÃO GERAL ... 111 1. DISCUSSÃO GERAL ... 112 2. REFERÊNCIAS ... 114 - CAPÍTULO 6 – ... 117 CONCLUSÃO GERAL ... 117 1. CONCLUSÃO GERAL ... 118 - CAPÍTULO 7 – ... 120 REFERÊNCIAS ... 120 1. REFERÊNCIAS ... 121
- CAPÍTULO 1 –
1. INTRODUÇÃO
Nanotecnologia pode ser definida como caracterização, manipulação e/ou fabricação de estruturas, dispositivos ou materiais que possuam pelo menos uma dimensão na escala de 1-100 nm (DUNCAN, 2011). Essa tecnologia inovadora possui atualmente aplicações em diversas áreas como farmacêutica e alimentícia. No contexto da nanotecnologia, a nanoencapsulação vem se destacando como uma técnica emergente. Nesse sentido, diversos tipos de carreadores nanométricos (nanopartículas poliméricas, lipossomas, coacervados, complexos eletrostáticos e nanoemulsões) vem sendo estudados nos últimos anos para utilização na área alimentícia (AJAZUDDIN, 2010; SPIGNO et al., 2013; MORA-HUERTAS et al., 2013).
Dentre as técnicas de nanoencapsulação, os complexos eletrostáticos vêm sendo bastante utilizados. Esses sistemas são formados por pelo menos dois polissacarídeos carregados opostamente através de interações intermoleculares eletrostáticas (DUMITRIU; CHORNET, 1998), podendo ser utilizados para garantir uma maior estabilidade e proteção de algum composto incorporado em sua matriz (LI; MCCLEMENTS, 2014). Estes complexos podem ser formados utilizando diversos polissacarídeos sintéticos ou naturais, sendo que os últimos tem sido a alternativa mais aplicada em sistemas alimentícios, visando principalmente a atual demanda por ingredientes naturais e sustentáveis. Exemplos de polissacarídeos aplicáveis na indústria alimentícia são a quitosana, a carragena, o alginato e a gelana. A quitosana é um polissacarídeo não tóxico, de carga positiva, de baixo custo e que possui várias propriedades físico-químicas e tecnológicas interessantes, porém é pouco solúvel em água. Para melhorar a sua solubilidade e homogeneidade no sistema de complexação, a quitosana pode ser usada na forma hidrolisada. A hidrólise da quitosana permite diminuir seu peso molecular e aumentar sua solubilidade, facilitando a formação de complexos de modo mais seletivo (COSTA SILVA; DOS SANTOS; FERREIRA, 2006). Esse polissacarídeo possui diversas propriedades que podem ser destacadas visando sua aplicação como sistema encapsulante como, por exemplo, biocompatibilidade, biodegradabilidade e, principalmente, mucoadesividade (ANITHA et al., 2014; BUGNICOURT; ALCOUFFE; LADAVIÈRE, 2014; SHUKLA et al., 2013; SIPOLI et al., 2015). A mucoadesividade aumenta a capacidade de penetração da quitosana nas células epiteliais, facilitando a liberação controlada de ativos (AMIDI et al., 2010; DASH et al., 2011).
A goma gelana, por outro lado, é um polissacarídeo de caráter aniônico, que possui elevada estabilidade térmica e é resistente a baixos valores de pH (RODRÍGUEZ-HERNÁNDEZ et al., 2003). Essas caractarísticas permitem a potencial utilização da gelana como agente encapsulante, pois podem garantir a proteção do ativo sob condições drásticas de pH (PICONE; CUNHA, 2013; SANTOS; CUNHA; 2018). Mesmo com a sua relevância tecnológica, há poucos estudos na formação de complexos eletrostáticos de quitosana-gelana. A formação de complexos eletrostáticos pela associação dos biopolímeros quitosana e gelana com a adição de surfactantes foi estudada por PICONE (2013), demonstrando seu potencial para a veiculação de ativos em alimentos.
De modo a avaliar a produção dos complexos formados através de gelana combinada com quitosana ou quitosana hidrolisada, duas metodologias foram utilizadas para a formação dos complexos. Além da metodologia convencional “bulk” (gotejamento de uma solução de polissacarídeo sob a outra), a produção dos complexos também foi realizada através da técnica microfluídica. A microfluídica é um processo que ocorre sob condições de regime laminar, devido às dimensões dos canais por onde escoam os fluidos. Dessa maneira, o processo de formação de complexos pode ser realizado por meio da difusão, garantindo maior controle na formação das partículas (JAHN et al., 2010; SAMIE; SALARI; SHAFII, 2013; ZHANG et al., 2016). No entanto, o uso dos microcanais implica em alguns desafios como a escolha da geometria do canal, a definição do tempo de residência ideal e a avaliação da melhor vazão para a obtenção de complexos homogêneos, estáveis e resistentes às variações de pH (LI et al., 2018). Além disso, para avaliar a eficiência de encapsulação dos complexos obtidos utilizou-se a cafeína como composto bioativo modelo. A cafeína é um alcaloide hidrofílico do grupo das xantinas, sendo um composto natural, encontrado em diversas plantas como café, guaraná e chá verde. Devido às suas características, como atividade antioxidante e estimulação do sistema nervoso central e muscular, a cafeína tem despertado interesse tanto na indústria alimentícia quanto farmacêutica (BOURBON, 2016).
Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo realizar a formação de complexos eletrostáticos através da associação espontânea entre quitosana ou quitosana hidrolisada e a goma gelana de modo a avaliar sua viabilidade como sistema de encapsulação, tornando possível sua aplicação na indústria de alimentos. Além disso, este trabalho visou a comparação dos processos de formação dos complexos, esperando-se obter resultados mais favoráveis com a utilização da microfluídica (melhor distribuição de tamanho e baixo índice de polidispersão).
2. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo principal avaliar os mecanismos de formação e as características dos complexos eletrostáticos produzidos a partir da associação de quitosana/quitosana hidrolisada e gelana através dos métodos de formação direta (“bulk”) e microfluídico.
Os objetivos específicos foram:
- Avaliar as condições apropriadas para a hidrólise da quitosana usando a enzima pepsina e realizar a caracterização da quitosana hidrolisada quanto ao tamanho, potencial zeta, índice de polidispersão, grau de desacetilação, cristalinidade e estrutura;
- Realizar a formação dos complexos eletrostáticos através do uso de polissacarídeos gelana e quitosana ou quitosana hidrolisada a partir de dois diferentes processos, método “bulk” e microfluídico, bem como sua caracterização;
- Avaliar a eficiência de encapsulação da cafeína nos complexos eletrostáticos formados por ambos os métodos utilizados em sua produção.
3. ORGANIZAÇÃO DA DISSERTAÇÃO EM CAPÍTULOS
Este trabalho foi organizado em capítulos, como descrito a seguir:
Capítulo 1: Introdução geral e objetivos
Capítulo 2: Revisão bibliográfica
Neste capítulo foram abordados os temas relacionados ao desenvolvimento do projeto tais como nanotecnologia e a complexação eletrostática, características gerais dos polissacarídeos gelana e quitosana, a hidrólise da quitosana e os diferentes métodos existentes para sua obtenção. Além disso, foi descrita a estrutura do composto modelo bioativo (cafeína) e os diferentes métodos de formação da complexação eletrostática (“bulk” e microfluídica), sendo apresentado o que foi encontrado na literatura referente aos diferentes tópicos estudados.
Capítulo 3: Modulating properties of polysaccharides nanocomplexes from
enzymatic hydrolysis of chitosan
Neste capítulo foi realizado o estudo referente a caracterização dos diferentes polissacarídeos (gelana, quitosana e quitosana hidrolisada) quando submetidos a diferentes condições de pH. Em seguida, a caracterização desses polissacarídeos (potencial zeta, distribuição de tamanho, índice de polidispersão, microscopia, índice de cristalinidade entre outros) foi realizada no pH selecionado para a formação dos complexos. Os complexos foram então formados e caracterizados, permitindo avaliar as melhores razões e condições de processo para a formação dessas partículas.
Capítulo 4: Microfluidic process conditions for efficient caffeine
encapsulation in electrostatic complexes
Este capítulo traz um estudo voltado à obtenção das melhores condições de processo para a produção dos complexos eletrostáticos. Para isso, os complexos foram formados pelo método “bulk” e através da técnica microfluídica (sendo analisadas duas geometrias diferentes). Além disso, foi realizada a avaliação das partículas obtidas como matrizes encapsulantes utilizando a cafeína como composto modelo. Desse modo, a caracterização destes complexos na ausência e presença do material encapsulado foi realizada através das análises de distribuição de tamanho, índice de polidispersão, potencial zeta e microscopia. Para os sistemas contendo cafeína, a eficiência de encapsulação também foi verificada. Dessa maneira, foi possível realizar uma comparação entre os métodos utilizados para a formação dos complexos eletrostáticos.
Capítulo 5: Discussão geral
Capítulo 6: Conclusão geral
4. REFERÊNCIAS
AJAZUDDIN, S. S. Applications of novel drug delivery system for herbal formulations. Fitoterapia,v.81,p. 680–689, 2010.
AMIDI, M.; MASTROBATTISTA, E.; JISKOOT, W.; HENNINK, W. E. Chitosan-based delivery systems for protein therapeutics and antigens. Advanced drug delivery reviews, v. 62, n. 1, p. 59-82, 2010.
ANITHA, A.; SOWMYA, S.; KUMAR, P. T. S.; DEEPTHI, S.; CHENNAZHI, K. P.; EHRLICH, K. P.; TSURKAN, M.; RANGASAMY, J. Chitin and chitosan in selected biomedical applications. Progress in Polymer Science, p. 1–24, 2014.
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- CAPÍTULO 2 –
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. NANOTECNOLOGIA
A nanotecnologia pode ser definida como a caracterização, manipulação e/ou fabricação de estruturas, dispositivos ou materiais que tenham pelo menos uma dimensão na escala de 1-100 nm (DUNCAN, 2011). Tem sido pesquisada com o foco em desenvolvimento e inovação (SÁ, 2003), sendo que o Programa Nacional de Nanotecnologia possui nove áreas principais de atuação. A área mais aplicada é o desenvolvimento e formação de biomateriais na área da saúde e alimentação (SÁ, 2003). Como exemplo de utilização de nanoestruturas destaca-se a produção de nanopartículas poliméricas. Na área alimentar tem aumentado o desenvolvimento de estudos na escala nanométrica (entre 50 a 1000 nm), com a formação de complexos eletrostáticos, nanoemulsões e nanopartículas lipídicas para o carreamento e proteção de compostos ativos a fim de melhorar sua estabilidade e aumentar o número de aplicações (SANGUANSRI e AUGUSTIN, 2006; GUTIÉRREZ et al., 2008; FARHANG, 2007; HELGASON et al., 2009).
Há diversos métodos que podem ser utilizados para a formação das nanopartículas poliméricas, como a nanoprecipitação, emulsificação, coacervação e complexação eletrostática (MORA-HUERTAS et al., 2013). Podem ser utilizados polímeros naturais ou sintéticos (SCHAFFAZICK et al., 2003), sendo alginato de sódio, gelatina, quitosana, gelana e albumina (KUMAR et al., 2004) alguns exemplos de biopolímeros não tóxicos e de baixo custo. Para a formação dos complexos eletrostáticos na escala nanométrica é importante verificar as características dos polissacarídeos como massa molar, solubilidade e densidade de carga na concentração utilizada. Além disso, alguns fatores extrínsecos como o pH e a temperatura podem influenciar nas propriedades de formação dos nanocomplexos (Kaur, 2018).
As nanopartículas podem ser utilizadas para a incorporação de compostos ativos, que mostram baixa biodisponibilidade e solubilidade. Os compostos bioativos extraídos de plantas possuem um potencial promissor na prevenção e tratamento de doenças, porém, em geral, mostram baixa absorção no organismo. Assim, sua encapsulação em nanopartículas pode facilitar a estabilidade e solubilidade do bioativo, protegendo-o da degradação prematura no organismo, aumentando seu tempo de circulação e garantindo
uma melhor eficiência de absorção pelas células (AJAZUDDIN, 2010; BONIFÁCIO et al., 2014; WANG et al., 2014; GHORANI & TUCKER, 2015).
1.2.COMPLEXOS ELETROSTÁTICOS
Os complexos macromoleculares podem ser formados a partir de interações intermoleculares entre diferentes polímeros. Os complexos podem ser classificados de acordo com os tipos de interações, como: (i) eletrostáticas, (ii) por transferência/equilíbrio de carga, (iii) ligações de hidrogênio e (iv) estereocomplexos (DUMITRIU; CHORNET, 1998).
Complexos eletrostáticos são formados a partir de pelo menos dois polímeros de cargas opostas, sendo um catiônico e outro aniônico. Estes sistemas podem ser utilizados como membranas, revestimentos para sensores e sistemas de encapsulamento (LEE; PARK; HA, 1997). A aplicação de complexos como sistema de encapsulamento pode ser realizada através da incorporação do composto bioativo em uma das soluções antes da formação do complexo ou pela geração de uma matriz polimérica contendo o composto a ser encapsulado, que é recoberta pelo outro polímero para controlar a taxa de liberação do material (SIMSEK-EGE; BOND; STRINGER, 2003). A formação destes complexos tem sido um grande desafio, visto que poucos métodos permitem sua produção na escala micrométrica. Já para a escala nanométrica é necessário o uso de sistemas diluídos ou ainda a utilização de tecnologias como a microfluídica. Essa possui como vantagens gerar partículas com uniformidade de tamanho e incorporação de compostos de modo mais controlado (KIM et al., 2015).
As características dos complexos são determinadas através do grau de interação entre os polímeros, sendo a força destas interações dependente da densidade de carga de cada componente. A razão entre os polímeros tem sido um dos principais fatores que influenciam as propriedades dos complexos, que podem ser gerados pelo controle da reação de formação (TAKAHASHI et al., 1990). Desta maneira, é de grande importância avaliar a quantidade de cada polímero a ser misturado, pois se existir o excesso de carga, positiva ou negativa, não é formado o complexo devido à repulsão eletrostática. Quando há quantidades iguais de cargas (carga final neutra), os complexos tornam-se insolúveis formando precipitados (PICONE, 2012; VIDAL et al., 2005). Já para a formação dos complexos solúveis é necessário que haja o excesso de um dos polissacarídeos na dispersão (GOH, SARKAR, 2008; LE; RIOUX, TURGEON,2017). Os complexos são
relativamente pequenos e pouco influenciam na dispersão de luz, ou seja, a dispersão de complexos é ligeiramente turva (JONES; MCCLEMENTS, 2010; LE; RIOUX; TURGEOUN, 2017).
Além da avaliação da concentração ideal de polímeros há outros fatores importantes a serem analisados para garantir a complexação, como o pH da solução que é determinante no grau de ionização dos polímeros com cargas opostas (LEE; PARK; HA, 1997; SHIN et al., 2002). A força iônica, a temperatura e a ordem de mistura também são fatores importantes, para garantir melhor formação dos complexos de interesse (LEE; PARK; HA, 1997; SHIN et al., 2002; LI et al., 2018). Dentro deste contexto, os hidrocolóides têm sido utilizados em diversas aplicações, por serem biodegradáveis e de fácil obtenção. Os mais utilizados para os estudos de formação dos complexos são: quitosana, gelatina, alginato, carboximetilcelulose, λ-carragena e dextrina (CHEN et al., 2015; RODRIGUES; SIMSEK-EGE; BOND; STRINGER, 2003; TAKAHASHI et al., 1990; ZUVANOV; ROJAS, 2010).
Outros estudos avaliaram os principais fatores que influenciam no desenvolvimento das interações eletrostáticas no sistema, mostrando que existem fatores externos e internos que influenciam na sua formação como: pH, força iônica, concentração total do polímero, densidade de carga e presença de grupos iônicos (GRINBERG; TOLSTOGUZOV, 1997; TOLSTOGUZOV, 2006). Deste modo, a manipulação destes fatores é necessária para garantir a eficiência da formação dos complexos biopoliméricos.
Existem diversas aplicações do uso de biopolímeros para a complexação e a sua viabilidade em processamentos para auxiliar na melhora dos alimentos e saúde. Como exemplo, foi avaliada a influência da quitosana no revestimento de nanohidrogéis formados a base de glicomacropeptídeo e lactoferrina. Os nanohidrogéis, mantiveram a forma esférica e mostraram uma liberação homogênea do ativo incorporado após o revestimento de quitosana (BOURBON; PINHEIRO; CERQUEIRA, 2016). A formação de complexos eletrostáticos pela associação dos biopolímeros quitosana e gelana com adição de surfactantes foi analisada (PICONE; CUNHA, 2013) e observou-se que a associação de surfactantes nas nanopartículas auxiliou na estrutura e homogeneidade dos complexos, que foram considerados promissores para a produção e veiculação de ativos em alimentos.
1.3. POLISSACARÍDEOS
Os polissacarídeos são polímeros ou copolímeros sintetizados a partir de máterias-primas de origem renovável (milho, cana-de-açúcar, celulose e quitina), sendo que sua utilização se baseia no grande interesse relacionado aos fatores sócio-econômicos e ambientais (BRITO et al., 2011) pois são considerados biodegradáveis. Os polissacarídeos mais abundantes em escala comercial são a celulose e o amido, porém há grande interesse no uso de carboidratos mais complexos como a quitosana e xantana. Estes são formados por unidades simples de glicose ligada aos anéis e grupos acetil, portanto possuem grande quantidade de grupos hidroxila que auxiliam no aumento da solubilidade (MARA; FRANCHETTI; MARCONATO, 2006). Os polissacarídeos de grau alimentar, são abundantes na natureza, não tóxicos e apresentam propriedades gelificantes que possibilitam o seu uso como espessantes e/ou estabilizantes em diversas aplicações.
Mesmo com tantas vantagens, os polissacarídeos possuem algumas limitações que dificultam seu processamento e utilização como produto final. Assim, diversos grupos de pesquisa têm estudado formas de alterar as estruturas dos biopolímeros de modo a facilitar sua viabilidade em processamentos e aplicações, garantindo uma maior resistência térmica, permeabilidade, processabilidade, além de melhores propriedades mecânicas e reológicas (BRITO et al., 2011; MARA; FRANCHETTI; MARCONATO, 2006).
Dentro da classe dos biopolímeros tem-se os polissacarídeos, que possuem uma diversidade estrutural, que possibilita uma variedade de propriedades físico-químicas e funcionais. Esta diversidade pode gerar diferentes tipos de associações entre os polissacarídeos que, quando utilizados em maiores concentrações, podem formar géis (BRITO, et. al., 2011).
1.4. QUITOSANA
A quitina é o segundo polissacarídeo em abundância na natureza depois da celulose, sendo o principal componente presente no exoesqueleto de crustáceos e insetos. A quitosana é produzida a partir da desacetilação da quitina em meio alcalino (Figura 1), que modifica suas propriedades físico-químicas como solubilidade, potencial isoelétrico e viscosidade em meio aquoso (COSTA SILVA; DOS SANTOS; FERREIRA, 2006). O grau de desacetilação característico das quitosanas comerciais varia entre 70 e 95% e a
massa molar entre 10 e 1000 kDa (GEORGE; ABRAHAM, 2006). O uso da quitosana têm aumentado em diversas áreas, como nas indústrias alimentícia e farmacêutica, no desenvolvimento de cosméticos, géis e complexos eletrostáticos (LARANJEIRA; DE FÁVERE, 2009).
Figura 1- Representação do processo de desacetilação da quitina para produzir a quitosana.
(Fonte: PICONE,2012).
A quitosana possui alta hidrofilicidade devido ao grande número de grupos hidroxila presentes na cadeia polimérica. Por outro lado, os grupos amino carregados positivamente são relevantes para a formação de interações eletrostáticas (COSTA SILVA; DOS SANTOS; FERREIRA, 2006; GÓMEZ, L; RAMÍREZ, 2006). A quitosana têm interessantes características tais como sensibilidade ao pH e baixa toxicidade (LARANJEIRA; DE FÁVERE, 2009). A solubilidade da quitosana é dependente do pH, pois em valores de pH menores que 5,5 há uma forte repulsão eletrostática de caráter inter e intramolecular gerada pelos grupos amino carregados positivamente. Nesta condição, as moléculas de quitosana apresentam sua forma estendida aumentando sua solubilidade (PENG et al., 2010; PICONE, 2012).
Já em valores de pH maiores que 6,0 a carga da quitosana é neutralizada (THONGNGAM; MCCLEMENTS, 2004), diminuindo a repulsão eletrostática e favorecendo ligações de hidrogênio. A Figura 2 mostra esquematicamente as alterações na estrutura da molécula em função do pH. O grupamento amina tem um valor de pKa próximo de 6,5, em meio ácido este é protonado, influenciando na solubilidade da quitosana em soluções ácidas (ANITHA et al., 2014; MAO; SUN; KISSEL, 2010; SHUKLA et al., 2013; YI et al., 2005). No pH neutro ou alcalino, a quitosana tende a mostrar menor influência das repulsões eletrostáticas, o que facilita a formação de associações interpoliméricas, filmes ou géis (YI et al., 2005).
Figura 2- Esquema referente às alterações químicas induzidas pelas mudanças de pH na solução de quitosana. (A) Ligações de hidrogênio; (B) Protonação do grupamento amino e (C) Repulsão eletrostática.
(Fonte: FARRIS, et al., 2012).
A hidrólise da quitosana pode ser realizada para garantir melhor solubilidade em água, menor viscosidade e maior homogeneidade ao sistema de complexação. Este processo facilita a formação de complexos eletrostáticos de forma mais seletiva e controlada (COSTA SILVA; DOS SANTOS; FERREIRA, 2006). No entanto, a quitosana deve ser caracterizada quanto ao grau de acetilação, massa molar e pureza, pois estes fatores podem influenciar na acessibilidade enzimática e nas características de hidrólise deste polissacarídeo (LARANJEIRA; DE FÁVERE, 2009).
A quitosana possui também outras propriedades que podem ser destacadas como biocompatibilidade, biodegradabilidade, mucoadesividade, alto poder antioxidante e antimicrobriano (ANITHA et al., 2014; BUGNICOURT; ALCOUFFE; LADAVIÈRE, 2014; DASH et al., 2011; RAFTERY; O’BRIEN; CRYAN, 2013; SHUKLA et al., 2013; SIPOLI et al., 2015). A mucoadesividade aumenta a capacidade de penetração da quitosana entre as células epiteliais, facilitando a liberação controlada de bioativos (AMIDI et al., 2010; DASH et al., 2011). Além disso, a propriedade de biocompatibilidade da quitosana auxilia na sua rápida digestão pelo sistema fisiológico, devido à presença de lisozimas e quitinases presentes no sangue ou intestino humano (MAO; SUN; KISSEL, 2010). Vale ressaltar que estas propriedades podem alterar de acordo com o grau de desacetilação e massa molecular do polímero (FERREIRA, et.al., 2014; HIGUERAS, et.al.,2015; VERLEE. MINCKE; STEVENS, 2017).
No ano de 2012, a quitosana foi aprovada como GRAS (General Recognized as
Safe) e pelo FDA (Food and Drug Administration) para a sua utilização como aditivo
em alimentos (FDA, 2012). Recentemente também foi liberada pela ANVISA de acordo com a Instrução Normativa Nº 28 (ANVISA, 26 de Julho de 2018) para ser utilizada na
conservação, clarificação, encapsulação e produção de diferentes embalagens (ROCHA; COIMBRA; NUNES, 2017). No entanto, sua aplicação em matrizes alimentícias (ROCHA; COIMBRA; NUNES, 2017) é um pouco restrita devido à sua baixa solubilidade em sistemas aquosos (HE, et.al., 2017). Assim, o uso da quitosana e interações moleculares com outros componentes, depende da sua origem. A complexação eletrostática com a quitosana foi avaliada com polissacarídeos aniônicos como a goma arábica (ESPINOSA-ANDREWS et.al., 2007, 2010, 2013; TAN, et.al., 2016), alginatos (BECHERÁN-MARÓN; PENICHE; ARRGUELES-MONAL, 2004; TAPIA, et. al., 2004; KULIG; ZIMOCH-KORZYCKA; JARMOLUK, 2017), goma xantana (ARGIN-SOYSAL; KOFINAS;. LO, 2009) e as carragenas (VOLOD´KO et.al., 2012, 2014, 2016).
1.5. GELANA
A goma gelana é um polissacarídeo extracelular de caráter aniônico, obtido pela bactéria Sphingomonas elodea. O posterior tratamento em meio alcalino resulta na sua forma desacilada, que é geralmente a mais comercializada e tem como característica seu alto poder gelificante (MILAS; RINAUDO, 1996). A estrutura da goma gelana possui uma unidade de repetição do composto β- glucose (d Glc), l-rhamnose (l -RHA) e d-ácido glucurônico (d-GlcA) e as unidades possuem em sua lateral o grupo carboxílico, sendo este um dos responsáveis pela interação entre goma gelana e quitosana. A estrutura química da gelana é apresentada na Figura 3.
Figura 3-Estrutura química da gelana.
(Fonte: PRAJAPATI et.al., 2013).
A goma gelana é um polissacarídeo que pode ser utilizado em diversos produtos devido à suas propriedades gelificante, estabilizante, estruturante e como agente
encapsulante (PICONE 2012; YAMAMOTO, 2002). A gelana é facilmente ionizada em água quente ou fria, o que facilita sua dispersão e hidratação (PRAJAPATI et al., 2013). O pH também é um fator importante na sua estruturação, sendo que em condições de baixa força iônica e pH neutro a interação entre as hélices de gelana é inibida pela repulsão eletrostática entre os grupos carboxílicos de carga negativa. A adição de sal ou redução do pH reduz a repulsão, facilitando a formação das zonas de junção e, posteriormente, o desenvolvimento do gel (YAMAMOTO; CUNHA, 2007). A resistência da gelana em valores baixos de pH confere um alto potencial de aplicação como agente encapsulante, pois um dos desafios nesta área é obter um material de parede que garanta a proteção sob condições drásticas de pH (PICONE; CUNHA, 2013).
A partir das propriedades apresentadas, a gelana foi selecionada para ser um dos biopolímeros na formação dos complexos devido à sua resistência estrutural ao pH estomacal.
1.6. CAFEÍNA
A cafeína está presente, naturalmente, em mais de 60 espécies de plantas que estão distribuídas pelas diferentes regiões geográficas do mundo. A cafeína (3,7-di-hidro-1,3,7-trimetil-1H-purina-2,6-diona) um alcaloide solúvel em água do grupo das xantinas (Figura 4), é comumente encontrada em plantas como café, guaraná e chá verde (BRENELLLI, 2003). Tem despertado interesse tanto na indústria alimentícia quanto farmacêutica devido a suas características farmacológicas, efeito estimulante do sistema nervoso central e muscular (BOURBON, 2016).
Figura 4-Fórmula química estrutural da cafeína.
Possui massa molecular de 194,2 g/mol, densidade relativa de 1,23 na temperatura de 18°C, é encontrada no mercado na coloração branca, é inodora e de sabor amargo. Apresenta o pKa de 8,3 sendo caracterizada como uma base fraca (BARBAS et al., 2000; TAGLIARI et al., 2012). Além disso, a cafeína é um composto hidrofílico modelo em estudos de encapsulação e liberação de ativos (BOURBON, 2016) e, portanto, foi selecionada como ativo neste trabalho. A cafeína já foi encapsulada por diferentes técnicas em micropartículas, lipossomas e microemulsões na área farmacológica (BOLZINGER, et.al., 2008; CHORILLI et.al., 2007; DI, et. al., 2011; PIRES DE CAMPOS, et.al., 2008), sendo principalmente aprisionada fisicamente (JANES, et. al., 2001; PARVEEN, et. al.,2010) devido à sua solubilidade em sistemas aquosos levemente acidificados.
Nos últimos 20 anos tem-se aumentado os estudos da cafeína para aplicação em diversas áreas como cosmética, farmacêutica e alimentícia devido à sua farmacologia que visa a estimulação do sistema nervoso central. Por ser considerada uma molécula pequena, esta tem sido utilizada como composto modelo bioativo para avaliação de matrizes de encapsulação na escala nanômétrica e como possíveis aplicação em bebidas como por exemplo, refrigerantes e energéticos (BOURBON, ET. AL, 2016; BAGHERI ET.AL, 2014a).
A cafeína pode ser absorvida pelo sistema gastrointestinal de modo rápido pela ingestão do café, tem-se estudos diversas técnicas de encapsulação e controle de liberação da mesma. Alguns materiais já foram estudados como material de parede para a sua encapsulação como gelatina, pectina, carragena e alginato sendo combinados para a formação de hidrogéis com proteínas ou outros materiais orgânicos
(BELSCAK-CVITANOVIC, et.al, 2015; BAGHERI ET.AL, 2014a; BAGHERI, ET. AL, 2014b).
Assim, há poucos estudos da combinação entre polissacarídeos para a sua encapsulação.
1.7. MICROFLUÍDICA
A microfluídica pode ser caracterizada como a ciência que estuda o comportamento de escoamento dos fluidos em escala microscópica através do uso de microcanais. Pesquisas vêm crescendo nos últimos anos sobre a microfluídica devido a esta técnica oferecer uma maior garantia na manipulação de pequenos volumes de fluidos, homogeneidade na formação de partículas, além de poder ser aplicada em diversas áreas
como farmacêutica, alimentícia e cosméticos (SAMIE; SALARI; SHAFII, 2013; VLADISAVLJEVIĆ; KOBAYASHI; NAKAJIMA, 2012).
Esta técnica tem sido destaque devido à perspectiva de inovações em processos, redução do tamanho da planta de produção, minimização dos custos e redução na produção de resíduos. Outras vantagens são a possibilidade de ampliação de escala de diferentes processos com o uso em paralelo dos dispositivos, além da garantia de maior homogeneidade durante todo o processo ao utilizar valores de número de Reynolds no regime laminar (JAHN et al., 2008; LI et al., 2018; VAN GERVEN; STANKIEWICZ, 2009). Além do menor custo de produção, este sistema facilita o monitoramento do processo que ocorre em menor tempo e manipula reduzidos volumes de amostras, permitindo um melhor controle na distribuição de tamanho e índice de polidispersão das nanopartículas (ZHAO, et al., 2011).
Os dispositivos microfluídicos podem ser portáteis, e possuem canais com dimensões inferiores a 1mm (GARG et al., 2016; VLADISAVLJEVIĆ; KOBAYASHI; NAKAJIMA, 2012; SKURTYS; AGUILERA, 2008). Para a produção destes dispositivos tem sido utilizados materiais inertes como vidro, acrílico, silício, aço e polímeros como o polidimetilsiloxano (PDMS), polimetacrilato de amida (PMMA), polietilenos de baixa e alta densidade, entre outros (BECKER; LOCASCIO, 2002). O vidro e os polímeros são mais utilizados por serem materiais de baixo custo, fácil manipulação e estruturação para a formação dos dispositivos, orifícios e canais (KANAI; TSUCHIYA, 2016; LIPPERT; DICKINSON, 2003; MCDONALD et al., 2000). O polímero polidimetilsiloxano (PDMS) pode ser definido como um elastômero e tem sido o mais utilizado na fabricação de dispositivos microfluídicos pelo uso da litografia macia, como mostrado na Figura 5. É um polímero de caráter hidrofóbico e de fácil manipulação. Sendo assim, o mais viável para a formação dos microcanais, pois pode ser utilizado como material de parede para o contato com materiais orgânicos ou emulsões água em óleo (ALMUTAIRI; REN; SIMON, 2012; SHAH et al., 2008). O PDMS também foi escolhido como material para a fabricação dos microcanais de modo a minimizar sua interação com os polissacarídeos, pois estes possuem majoritariamente cadeias hidrofílicas que vem sendo amplamentes analisados para a encapsulação de fármacos e compostos bioativos (Hasan, et al, 2003). Sendo assim, estes componentes foram escolhidos visando a melhor formação dos complexos eletrostáticos.
Figura 5-Representação esquemática de um microcanal de PDMS.
(Fonte: FOCSAN, et al., 2016).
Há diferentes condições de processo que favorecem a formação de gotas, emulsões e complexos nos dispositivos microfluídicos, sendo a geometria utilizada na formação dos canais uma das mais relevantes. As geometrias mais comuns são a focalização hidrodinâmica, co-fluxo e junção em T (LI et al., 2018; MCDONALD et al., 2000) como mostrado na Figura 6. A geometria de junção em T é muito utilizada na geração de emulsões devido à simplicidade da sua fabricação. Na geometria co-fluxo (junção coaxial), uma das fases é inserida em uma segunda corrente e o fluxo de fluidos de ambas as fases escoam através dos canais em modo paralelo. As gotículas formadas, neste caso, possuem o coeficiente de variação geralmente inferior a 3% (LI et al., 2018; UMBANHOWAR; PRASAD; WEITZ, 2000). A escolha da geometria varia de acordo com o estudo de interesse e as características dos compostos utilizados.
O sistema de focalização de fluxo é formado por uma entrada central e duas entradas nas laterais configurados em formato de cruz e os complexos são produzidos a partir do encontro das soluções dispersas ao longo do microcanal. Quanto maior a pressão realizada pelo fluxo central, mais fácil será a produção de partículas menores (LI et al., 2018). A partir de um layout simétrico da focalização hidrodinâmica, esta permite que as forças entre as correntes sejam distribuídas de forma mais homogênea, o que facilita a formação de complexos e gotas de modo mais estável e controlado (ZHAO, 2013).
Figura 6-Representação esquemática das três geometrias mais utilizadas em microcanais (junção em T, co-fluxo e focalização hidrodinâmica).
(Fonte: Li, et al., 2018).
A geração de nanopartículas por formação, produção ou auto-organização através de técnicas microfluídicas é possível devido à flexibilidade de operação dos dispositivos, à possibilidade do uso de diferentes geometrias e materiais (LO et al., 2010; DEBUS et al., 2012). A tecnologia microfluídica mostra diversas vantagens para a produção de nanopartículas quando comparada às técnicas convencionais como custo de produção e razão entre a área superficial e volume (LEE et al., 1998). Além disso, proporciona outras vantagens como, o controle do tamanho e estrutura, além do baixo índice de polidispersão (KHAN et al., 2013; ZHAO et al., 2011).
Para o uso da microfluídica é necessária a seleção do material para a formação dos microcanais, a geometria a ser utilizada, além da escolha dos componentes e a aplicação de interesse. Um dos pontos principais é garantir uma mistura eficiente no dispositivo a fim de garantir a formação e a reprodutibilidade do processo (ZHAO et al., 2011). Nos sistemas em macroescala, em geral, a mistura ocorre em regime turbulento, enquanto nos microcanais é realizada em condições de volume reduzido e com o número de Reynolds muito baixo. Assim, as misturas ocorrem em regime laminar de forma lenta, promovendo a transferência por difusão molecular (BJORNMALM;YAN; CARUSO, 2014; WHITESIDES, 2006). Na geometria de focalização hidrodinâmica, a otimização do processo pode ser realizada aumentando a eficiência da mistura para garantir uma melhor homogeneidade do sistema. Como a corrente central é pressionada gerando o estreitamento da mesma no microcanal através das correntes laterais, promove-se um menor comprimento da difusão e uma mistura mais rápida e efetiva, o que facilita a formação de partículas e complexos mais uniformes (LU, et al., 2014; BJORNMALM;YAN; CARUSO, 2014).
Na área da biotecnologia, o uso destes dispositivos facilita a manipulação de diversos materiais, como nos processos de purificação, quantificação e recuperação de genes e a síntese de nanopartículas (BETTINGER & BORENSTEIN, 2010). A partir do uso da geometria de focalização hidrodinâmica, DASHTIMOGHADAM et al. (2013) e MAJEDI et al. (2013) produziram nanopartículas por meio da autoassociação com uso de quitosana hidrolisada, a fim de controlar o sistema de liberação dos fármacos e observaram que esta geometria mostrou um maior controle na formação das partículas. Outros exemplos de estudos são de lipossomas (BABINO, AZZONI; DE LA TORRE, 2013), nanopartículas poliméricas (DASHTIMOGHADAM et al.,2013; MAJEDI, et al.,2012) e complexos eletrostáticos (PESSOA, et al., 2017).
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