Atividade antibiofilme do hipoclorito de sódio contra biofilmes
simples formados por Salmonella Typhimurium
T.A. Penno
1,V. Schuh
1, G.A. Hillesheim
1, A.G. Forchesatto
1, S.M. Silveira
2, A.F. Millezi
3.
1- Discente do curso Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense – campus Concórdia – CEP: 89700-000 – Concórdia – SC – Brasil. Telefone: (49) 9122-9206 – e-mail: (pennotaci@gmail.com).
2- Docente do curso Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense – campus Concórdia – CEP: 89700-000 – Concórdia – SC – Brasil. Telefone: (49) 8840-7007 – e-mail: (sheila.silveira@ifc-concordia.edu.br ). 3- Orientadora, Docente do curso de Agronomia, Instituto Federal Catarinense – campus Concórdia – CEP: 89700-000 – Concórdia – SC – Brasil. Telefone: (49) 9803-9600 – e-mail: ( alessandra.millezi@ifc-concordia.edu.br ).
RESUMO – Biofilme é uma matriz celular, biologicamente ativa, que se forma em superfícies.
Salmonella Typhimurium é uma bactéria em forma de bacilos, Gram-negativos, anaeróbia facultativa e
móvel. O hipoclorito de sódio é atualmente o sanitizante mais utilizado, em função da sua rápida ação, fácil aplicação e completa dissociação em água. Foram realizadas as análises de MTT (Atividade Metabólica), CV (Quantificação de Biomassa) e UFC (Quantificação de Células Viáveis). Todas as análises foram realizadas em triplicata, com uma concentração de hipoclorito de sódio a 2%. Os resultados obtidos pelas análises, após serem avaliados por ANOVA pelo método de Bonferroni: Compare Select Pairs of Columns, foram satisfatórios, na concentração utilizada de hipoclorito de sódio, pois apresentaram resultados significativos (P<0,05), o que indica uma boa ação do hipoclorito de sódio como sanificante. Contudo, pode-se concluir que o hipoclorito de sódio, apresentou uma boa eficiência, agindo contra biofilmes formados por S. Typhimurium.
ABSTRACT - Biofilm is a cellular matrix, biologically active, that is formed on surfaces. Salmonella
Typhimurium bacteria is in the form of bacilli, Gram-negative, facultative anaerobic and mobile.
Sodium hypochlorite is currently the most widely used sanitizer, due to its fast action, easy to use and complete dissociation in water. the analysis MTT (Metabolic Activity), CV (Quantification of Biomass) and CFU (Quantification of Viable Cells). All analyzes were performed in triplicate, with a sodium hypochlorite concentration of 2%. The results obtained by the analysis, after being evaluated by ANOVA Bonferroni Compare Select Pairs of Columns were satisfactory, the concentration used sodium hypochlorite, as had results below the stipulated limit (P <0.05), which It indicates a good action of sodium hypochlorite as a sanitizer. However, it can be concluded that sodium hypochlorite had good efficiency, acting against biofilms formed by S. Typhimurium.
PALAVRAS – CHAVE: Biofilme, Salmonella Typhimurium, hipoclorito de sódio. KEYWORDS: Biofilm, Salmonella Typhimurium, sodium hypochlorite.
1- INTRODUÇÃO
As bactérias, em sua maioria, quando se encontram em seu habitat natural, vivem em grupos de diferentes graus de complexidade, o que se associa com a variedade de superfícies bióticas ou abióticas, onde podem assim formar um biofilme (Caixeta, 2006). Biofilme pode ser definido como complexas comunidades de microrganismos, aderidos a uma superfície, juntamente com uma matriz de substâncias poliméricas extracelular de origem microbiana (Xavier, 2002). Biofilme também pode ser definido como uma matriz celular, biologicamente ativa, e substâncias extracelulares em associação com uma superfície sólida (Kumar, 1998). Na sua formação ocorre primeiramente a adesão das células bacterianas, através de forças físicas e atrações eletrostáticas, à superfície (Arcuri, 2000).
O cloro, na forma de hipoclorito de sódio, consiste no sanitizante mais utilizado para garantir a qualidade microbiológica da água e dos alimentos (Both, 2009). Os compostos, que tem o cloro como princípio ativo, são germicidas de amplo espectro de ação, pois reagem com as proteínas da membrana das células microbianas, promovendo assim uma interferência no transporte de nutrientes e fazendo com que se percam componentes celulares (Antoniolli, 2005). O hipoclorito de sódio é atualmente o sanitizante mais utilizado, em função da sua rápida ação, fácil aplicação e completa dissociação em água (Antoniolli, 2005), além de ser de baixo custo, comparado com outros sanitizantes, de fácil acesso e amplamente disponível no comércio (Both, 2009).
Salmonella Typhimurium é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae e se
apresenta na forma de bacilos Gram-negativos não produtores de esporos, é anaeróbia facultativa, é móvel devido aos seus flagelos peritríqueos, produz ácido a partir da glicose além de ser capaz de utilizar citrato como única fonte de carbono. O pH ótimo para o seu crescimento é em torno de sete, sendo a temperatura ótima na faixa entre 35ºC a 37ºC, porém podendo haver crescimento na faixa entre 5ºC e 47ºC. Essa bactéria não é capaz de suportar concentrações de NaCl acima de 9% (Franco, 1996).
Este trabalho foi realizado considerando os problemas que são encontrados nas indústrias, com a formação de biofilmes, nas superfícies dos equipamentos e superfícies sem contato com o alimento. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo, avaliar a eficiência do hipoclorito de sódio contra a formação biofilmes simples de Salmonella Typhimurium, em superfícies.
2- MATERIAIS E MÉTODOS
Inoculou-se uma alça de bactéria em TSB, e incubou-se a 36°C por 24 horas, após o crescimento da bactéria, fez-se inóculo padronizado. A partir desse inóculo, colocou-se 100 µL em três poços, da placa de 96 poços, nesses mesmos três poços colocaram-se 100 µL de hipoclorito de sódio a 2%, tendo assim o tratamento. Para obter o controle positivo, sem sanitizante, fez-se a inoculação de três poços somente com o inóculo padronizado. Após incubou-se novamente, em Shaker, com 80 rpm a 36°C por 24 horas. O mesmo procedimento foi realizado para as três análises: MTT (Atividade Metabólica), CV (Quantificação de Biomassa) e UFC (Quantificação de Células Viáveis).
2.1- Atividade Metabólica (MTT)
Após a incubação no Shaker, lavou-se a placa com água destilada estéril, secou-se a placa perto da chama, e adicionou-se a solução de MTT em todos os poços que haviam sido inoculados, e mais três poços extras, para serem obtidos os resultados sem interferência da solução de MTT na leitura. As placas foram incubadas por 2 horas e 30 minutos em over night a 37°C. Ao término desse período fez-se a leitura da placa em Elisa, a 630 nm.
2.2- Quantificação de Biomassa (CV)
Após a incubação no Shaker, lavou-se a placa com água destilada estéril, a placa foi seca próximo à chama, adicionou-se metanol em todos os poços que haviam sido inoculados, deixou-se agir por 15 minutos, adicionou-se cristal violeta deixando agir por 5 minutos, passado esse tempo, lavou-se a placa em água corrente, bom baixa vazão, secou-se a placa novamente e foi adicionado ácido acético 33% nos poços, seguindo assim para a leitura da placa em espectrofotômetro Elisa, a 630 nm.
2.3- Quantificação de Células Viáveis (CFU)
Após a incubação no Shaker, a placa foi lavada com água destilada estéril, secou-se a placa próximo à chama, adicionou-se água destilada estéril, seguindo assim para o banho-maria de ultrassonografia, permanecendo por seis minutos. Após transferiu-se 100 µl da água destilada contida no poço para um microtubo contendo 900 µL de água peptonada esterilizada. Foram realizadas as diluições até 10-6. Inoculou-se em triplicata, pelo método de microgota. As placas foram incubadas a 36°C por 24 horas, fez-se esse procedimento para todos os poços da placa. Após o tempo de incubação realizou-se a contagem das colônias.
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir, dos valores gerados pela leitura em Elisa, nas análises de MTT e CV, e a partir, dos números de colônias contadas na análise de CFU, foram realizados os cálculos de média e desvio padrão, após aplicou-se o teste de ANOVA pelo método de Bonferroni: Compare Select Pairs of Columns, tendo 99% como nível de significância, gerando assim os seguintes gráficos.
A Figura 1 apresenta os resultados da análise de UFC, a qual determina a quantidade de células viáveis do biofilme. Como se pode perceber no controle, que é onde não teve aplicação do tratamento com hipoclorito de sódio, apresentou valor próximo de 8,0 CFU.log10.cm2. Entretanto quando foi aplicado o tratamento com hipoclorito de sódio, o valor foi próximo a 1,5 CFU.log10.cm2. Comparando os resultados com e sem tratamento, pode-se perceber que houve uma redução decimal significativa, tanto que os resultados apresentaram significância (P<0,05), entre eles.
Figura 2 - Resultado da análise de MTT, utilizando hipoclorito de sódio a 2%, como antibiofilme.
A Figura 2 apresenta os resultados da análise de MTT, a qual determina a atividade metabólica do microrganismo no biofilme. O controle apresentou atividade metabólica elevada com translucidez, próxima a 0,16 em OD de 630 nm, enquanto nos poços, nos quais se aplicou o sanitizante, apresentou translucidez, em torno, de 0,02, na mesma faixa de leitura. Comparando os resultados com e sem tratamento, pode-se perceber que houve uma redução significativa da atividade metabólica, os resultados apresentaram significância (P<0,05), entre eles.
A Figura 3 apresenta os resultados da análise de CV, a qual determina a quantificação da biomassa no biofilme. Nesta análise, também houve redução significativa (P<0,05), entre o controle e o tratamento realizado com o sanitizante. O controle apresentou uma translucidez, próxima a 0,16, em OD 630 nm, enquanto nos poços em que houve a aplicação do hipoclorito de sódio apresentou uma translucidez próxima a 0,06, em OD de 630nm.
4- CONCLUSÃO
As três análises realizadas, para avaliar a eficiência do hipoclorito de sódio, na eliminação de biofilmes simples formados por S. Typhimurium apresentaram bons resultados, mostrando assim que o hipoclorito de sódio é capaz de eliminar o biofilme, deixando em níveis aceitáveis, concluindo-se que houve uma boa sanitização da superfície.
5- AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento do projeto, e também ao Instituto Federal Catarinense- Campus Concórdia por ceder às instalações do laboratório de microbiologia de alimentos, para a realização das análises.
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Antoniolli, L. R. Benedetti, B. C.; Filho, M. S. M. S.; Borges, M. F. (2005). Efeito do hipoclorito de
sódio sobre a microbiota de abacaxi “Pérola” minimamente processado. Revista Brasileira de
Fruticultura, Jaboticabal, SP, v.27, n.1, p.157160, abr.2005. Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-29452005000100041
Arcuri, E. F. (2000). Biofilmes bacterianos na indústria de alimentos. Leite e derivados, 40-45. V 9, nº53.
Both, J. M. C.; Longary, S. M.; Avancini, C. A. M. (2009). O desinfetante hipoclorito de sódio como
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Caixeta, D. S. (2006). Formação de biofilme por diferentes linhagens de Pseudomonas sp.na
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mestrado). Universidade Federal de Lavras, Lavras – MG.
Franco, Bernadette, D.G de Melo; Landgraf, Mariza. Microbiologia de alimentos. São Paulo: Atheneu, 1996.
Kumar, C. G.; Anand, S. K. (1998). Significance of microbial biofilms in food indrustry: a review. Internacition Journal of Food Microbiology, 9-23.
Xavier, J. B.; Picioreanu, C.; Almeida, J. S.; Vanloosdrecht, M. C. M. (2002). Monitorização e
