Atividade antimicrobiana do extrato aquoso de Copaifera langsdorffii Desf. sobre Staphylococcus aureus

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Antimicrobial activity of aqueous extract of Copaifera langsdorffii

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Mônica Durães Braga * Carla Cilene MatosSilva **

Resumo: Resumo: Resumo: Resumo:

Resumo: Staphylococcus aureus são bactérias envolvidas em infecções graves com elevada incidência em processos de infecção hospitalar e apresentam elevada capacidade de resistência a antibióticos. A fitoterapia apresenta-se como fonte de recursos para pesquisa de novos antimicrobianos, a exemplo do óleo da Copaifera langsdorffii Desf., que apresenta ação antiinflamatória, cicatrizante e antimicrobiana. O objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade de

S. aureus ao extrato aquoso de folhas de C. langsdorffii. Foram avaliadas três concentrações do extrato (0,2; 0,1 e 0,05g/mL) pelo método de difusão em disco. A concentração 0,2g/mL foi eficiente em 100% das amostras, e a concen-tração 0,1g/mL em 92,8%. Os resultados encontrados demonstram que o extrato aquoso de folhas de C. Langsdorffii

Desf. possui ação antimicrobiana eficaz contra S. aureus. Palavras-chave:

Palavras-chave: Palavras-chave: Palavras-chave:

Palavras-chave: Antimicrobianos, resistência, fitoterapia. A

A A A

Abstract:bstract:bstract:bstract:bstract: Staphylococcus aureus are bacteria in serious infections with high rate in hospital infection processes. They present a big ability to resist to antibiotics. Fitotherapy is a source of recourse to new antimicrobial investigation. The

Copaifera langsdorffii Desf. oil, for example, presents anti-inflammatory, healing and antimicrobial action. The purpose of this work was to analyze the S. aureus sensibility to the aqueous extract of C. langsdorffii leaf. Three extract concentrations (0,2 , 0,1 and 0,05g/mL) were valued through the diffusion in disc method. The concentration 0,2g/mL was efficient in 100% of the pattern, and the concentration 0,1g/mL in 92,8%. The results demonstrates that the aqueous extract of C. langsdorffii Desf. leaf has an efficacious antimicrobial action against the S. aureus.

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Keyeyeyey-worey-wor-wor-wor-words:ds:ds:ds:ds: Antibiotic, resistance, fitoterapy.

* Bacharel em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Montes Claros/UNIMONTES; Mestranda em Medicina Veterinária – Universidade Federal de Viçosa/UFV.

** Graduada em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Viçosa/UFV; Mestre em Microbiologia pela Universidade Federal de Minas Gerais/UFMG; Doutoranda em Microbiologia Agrícola - Universidade Federal de Viçosa/UFV.

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1 Introdução 1 Introdução

Os estafilococos são bactérias Gram positivas de grande importância médica, devido ao elevado po-tencial patogênico. Dentre elas, a espécie

Staphylococcus aureus é a mais patogênica, poden-do causar infecções pós-operatórias, dermatoses, intoxicação alimentar, choque tóxico, osteomielites, infecções urinárias e pleuropulmonares e endocardites (VELANO et al., 2001). Além disso, po-dem ser responsáveis por inúmeros processos de infecção hospitalar e infecções oportunistas, princi-palmente, aquelas relacionadas a casos de imunodeficiências (LACAZ, 2000). É freqüente o iso-lamento de S. aureus com amplo espectro de resis-tência a antimicrobianos de pacientes com infecção hospitalar, sendo geralmente causa de óbitos (THULER et al., 1999).

Diversas pesquisas vêm sendo realizadas com o ob-jetivo de verificar a evolução dos mecanismos de resistência desta espécie. É possível encontrar na literatura relatos de S. aureus resistentes à penicili-na, meticilipenicili-na, b-lactâmicos, ampicilipenicili-na, amoxicilipenicili-na, oxacilina, teicoplamina e vancomicina, principalmen-te, pela capacidade de produzir diversos tipos de enzimas que inativam o antibiótico ou que alteram a estrutura alvo da droga (FARIAS et al., 1997; MONTELLI et al., 1996; MOREIRA et al., 1998; NOVAK et al., 2000; SIERVERT & BOULTON, 2002).

Devido ao aumento da resistência de S. aureus a di-versos antimicrobianos, diferentes linhas de pesquisa tem conduzido estudos sobre drogas alternativas com o objetivo de controlar a disseminação das li-nhagens resistentes. Vários grupos desenvolvem pesquisa sobre o princípio ativo derivado de plantas e os resultados têm sido bastante promissores e estabelece uma nova fonte de substâncias para o desenvolvimento de medicamentos (EVANS, 1996; YUNES et al., 2001). Segundo a Organização Mundial de Saúde cerca de 20.000 espécies de diferentes plan-tas são utilizadas para fins terapêuticos em todo o mundo (MARTINS et al., 2000; PHILLIPSON, 1994). Um outro determinante na pesquisa de

medicamen-plantas medicinais são facilmente cultivadas e ad-quiridas tanto em mercados populares como em far-mácias especializadas, em sua forma bruta ou já ma-nipulados, respectivamente (CALIXTO, 2000). O uso do óleo de copaíba, Copaifera langsdorffii Desf., é popularmente difundido no tratamento de diver-sos procesdiver-sos inflamatórios, como, inflamações de garganta, de rins e de bexiga, além de ser útil no tratamento de dermatoses (MARTINS et al., 2000). Vários estudos com o óleo de copaíba têm compro-vado sua eficiência antiinflamatória e cicatrizante (BASILE et al., 1988; BRITO et al., 2002; EURIDES et al., 2000).

De Lima et al. (2006) comprovaram eficiência de ação do óleo de copaíba quando utilizado em experimen-to com isolados de Staphylococcus aureus, apresen-tando capacidade de inibição sobre duas amostras resistes a antibióticos. Alves et al. (2000) avaliaram a ação antimicrobiana do extrato de folhas de C. langsdorffii Desf., o extrato mostrou-se ativo con-tra S. aureus, Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa e inativo contra Escherichia coli. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana de três diferentes concentrações do extrato aquoso de folhas de C. langsdorffii Desf. contra 14 isolados de S. aureus.

2 Materiais e métodos 2 Materiais e métodos 2 Materiais e métodos 2 Materiais e métodos 2 Materiais e métodos

Os 14 isolados de S. aureus foram obtidos de pacientes atendidos no Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário Clemente Faria e no Laboratório Santa Clara de Montes Claros/MG. As amostras foram semeadas em placas com ágar Sal Manitol, incubadas a 37° C por 24 horas e, após o crescimento, foram conservadas em geladeira a 8º C, sendo realizadas repicagens mensais para sua manutenção.

O subcultivo, para realização dos ensaios de sensibilidade, foi realizado com transferência de 1

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unidade formadora de colônia (UFC), presente nas placas armazenadas em geladeira, com auxílio de alça de semeadura, para tubos contendo 10mL de caldo Infuso Cérebro Coração (BHI). Após incubação a 37° C por 24 horas, obtinha-se uma concentração de 107 cel/mL, verificada por contagem em Câmara de Newbauer.

As folhas de C. langsdorffii Desf. foram desidratadas em estufa a 50°C por 24 horas. O extrato foi obtido a partir de 10 gramas de material foliar triturado acrescentado de 50 mL de água destilada estéril. Após a fervura por 5 minutos, a solução foi filtrada em papel filtro e resfriada. A solução final foi novamen-te filtrada em filtro de 0,5mm (Millipore) adaptável à seringa. O volume final foi de 20 mL de extrato cuja concentração correspondia a 0,2 gramas de massa vegetal por mL de água (0,2g/mL). Uma parte desta solução foi diluída a fim de obter as concentrações de 0,1g/mL e 0,05g/mL. O extrato obtido foi arma-zenado em tubos estéreis protegidos contra a luz e o calor.

Nos testes de sensibilidade, foram avaliadas as três diferentes concentrações (0,2; 0,1 e 0,05 g/mL) do extrato aquoso de C. langsdorffii Desf. Os testes foram realizados pelo método de difusão em discos de papel filtro de 6mm de diâmetro. Os discos eram preparados e esterilizados anteriormente ao ensaio. No momento dos testes, as amostras de S. aureus

obtidas a partir dos subcultivos em caldo BHI foram semeadas em placas de Petri de 120mm de diâmetro, contendo ágar Mueller Hinton, com auxílio de zaragatoas esterilizadas.

Em seguida, os discos de papel filtro foram deixados no extrato aquoso de C. langsdorffii Desf. durante três minutos e a seguir foram fixados em placas previamente inoculadas.

Concomitantemente, foram realizados ensaios de controle onde os discos foram embebidos por três minutos em água destilada estéril e colocados sobre placas contendo inóculo de S. aureus.

As placas foram, então, incubadas a 37° C por 24 horas. Após este período, os halos de inibição formados em volta dos discos foram medidos e a média aritmética dos valores encontrados foi determinada. Todos os testes foram realizados em duplicata a fim de aumentar sua confiabilidade.

3 Resultados e Discussão 3 Resultados e Discussão3 Resultados e Discussão 3 Resultados e Discussão3 Resultados e Discussão

Nas placas controle, cujos discos continham água, não foi observada a formação de halo de inibição, isso indica que nem o solvente utilizado nem o ma-terial de composição do disco influenciaram os re-sultados obtidos no teste de sensibilidade.

Embora em alguns estudos realizados com plantas medicinais, o extrato aquoso não tenha mostrado ação antimicrobiana (DUMENIL et al., 1980; PINTO et al., 2001), os resultados revelaram a possibilidade de uso de água no preparo de extrato ativo. Os resultados dos ensaios de sensibilidade encon-tram-se nos gráficos 1, 2 e 3. Os isolados A02, A04, A05, A09 e A11 foram inibidos pelo extrato aquoso nas diferentes concentrações utilizadas neste estu-do. O isolado A12 foi o que apresentou menos sen-sibilidade à ação do extrato, mostrando-se sensível apenas à concentração 0,2g/mL. Nas concentrações maiores (0,2g/mL e 0,1g/mL), os isolados apresenta-ram maior sensibilidade, enquanto na menor con-centração utilizada (0,05g/mL), demonstraram-se mais resistentes.

Neste estudo, foi possível verificar as variações de resposta dos isolados pesquisados às concentrações de extrato utilizadas. À concentração de 0,05g/L, 64,3% das amostras mostraram-se resistentes. Nas demais concentrações analisadas os isolados apre-sentaram resposta mais homogênea frente aos ex-tratos. A concentração de 0,2g/mL foi capaz de ini-bir todas as amostras e a de 0,1g/mL inibiu 92,8%, com formação média de halos de inibição encontra-da de 9,9 e 8,1, respectivamente (gráfico 4). O perfil de sensibilidade entre amostras de uma

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principalmente, devido às variações genéticas intrín-secas e à origem dos isolados pesquisados, além da pressão seletiva exercida pelo meio onde estão sen-do cultivasen-dos. Tais fatores são, consideravelmente relatados na literatura em estudos que buscam o entendimento dos mecanismos de resistência de

S. aureus aos antibióticos.

LI et al. (1995), mostraram que a resistência intrín-seca de muitas bactérias depende de uma expressão constitutiva ou induzida de sistemas de efluxos ati-vos. Já a resistência de estafilococos a penicilina, foi verificada pela manifestaçãodo gene blaZ, que codifica b lactamase. Esta enzima, predominante-mente extracelular, é sintetizada quando estafilococos são expostos a antibióticos lactâmicos. As b-lactamases hidrolizam o anel beta lactâmico e inativam o antibiótico (LOWY, 2003).

A resistência à meticilina pode ser manifestada pela produção de - lactamase ou pela expressão do gene

mecA, que é responsável pela síntese da proteínas PBP2a ou PBP2’. As PBP2a subtituem as PBPs, e, de-vido à baixa afinidade pelos b lactâmicos, os estafilococos conseguem sobreviver a altas concen-trações desses antibióticos (CHAMBERS, 1997). Os mecanismos de resistência aos aminoglicosídeos são a diminuição da entrada da droga e/ou acúmulo na bactéria, a expressão de enzimas bacterianas que modificam e inativam o antibiótico, e, recentemen-te descoberto, o mecanismo de bomba de efluxo (BAMBEKE et al, 2003).

O primeiro mecanismo de resistência descrito para os macrolídeos estava associado à uma modificação pós-transcricional do rRNA 23S por uma adenina – N6_{- metiltransferase. A modificação altera o sítio do} rRNA 23S que é o alvo dos antibióticos macrolídeos, lincosamidas e estreptogramina B (MLS_B) (FLUIT et al., 2001).

Os dados encontrados na literatura sugerem que estudos sobre os padrões de susceptibilidade,

condições ambientais às quais estão sendo submetidos, poderão contribuir para orientar o uso racional de antimicrobianos.

Os resultados apresentados são promissores na pes-quisa de recurso alternativo para o tratamento de S. aureus, especialmente aqueles referentes às concen-trações de 0,2g/mL e 0,1g/mL que inibiram mais de 50% das amostras estudadas, e podem ser utilizados como dados preliminares para estudos futuros so-bre a composição química, a concentração inibitó-ria mínima e a toxicidade do extrato aquoso de C. langsdorffii Desf.

Gráfico 1 – Gráfico 1 – Gráfico 1 – Gráfico 1 –

Gráfico 1 – Perfil de sensibilidade de 14 amostras de Staphylococcus aureus frente ao extrato aquoso de Copaifera langsdorffii Desf. na concentração de 0,2g/mL

Gráfico 2 Gráfico 2 Gráfico 2 Gráfico 2

Gráfico 2 – Perfil de sensibilidade de 14 amostras de Staphylococcus aureus frente ao extrato aquoso de Copaifera langsdorffii Desf. na concentração de 0,1g/mL

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Gráfico 3 – Gráfico 3 – Gráfico 3 – Gráfico 3 –

Gráfico 3 – Perfil de sensibilidade de 14 amostras de Staphylococcus aureus frente ao extrato aquoso de Copaifera langsdorffii Desf. na concentração de 0,05g/ mL

Gráfico 4 Gráfico 4 Gráfico 4 Gráfico 4

Gráfico 4 – Atividade antimicrobiana do extrato aquoso de Copaifera langsdorffii Desf. sobre amostras de Staphylococcus aureus 4 Conclusões 4 Conclusões 4 Conclusões 4 Conclusões 4 Conclusões

Os resultados demonstram que o extrato aquoso de folhas de C. Langsdorffii Desf. possui ação antimicrobiana eficaz contra S. aureus e que a mai-or atividade está relacionada às concentrações de 0,2g/mL e 0,1g/mL que inibiram 50% das amostras de

S. aureus. 5 Agradescimentos 5 Agradescimentos 5 Agradescimentos 5 Agradescimentos 5 Agradescimentos

Ao Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Uni-versitário Clemente Faria e ao Laboratório Santa Clara de Montes Claros/MG, pela doação dos

isola-dos de Staphylococcus aureus.

6 Referências bibliográficas 6 Referências bibliográficas6 Referências bibliográficas 6 Referências bibliográficas6 Referências bibliográficas

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