Tese
Avaliação da atividade bacteriocinogênica e características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância
antimicrobiana em filmes biodegradáveis
Carla Pohl Sehn
Carla Pohl Sehn
Avaliação da atividade bacteriocinogênica e características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância
antimicrobiana em filmes biodegradáveis
Trabalho de Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciência
e Tecnologia de Alimentos da
Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva
Ficha Catalográfica elaborada por Maríndia Pôrto Nunes CRB10/1440
S456a Sehn, Carla Pohl
Avaliação da atividade bacteriocinogênica e características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância antimicrobiana em filmes biodegradáveis / Carla Pohl Sehn.
115 f.
Tese(Doutorado)-- Universidade Federal de Pelotas, PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS, 2015.
"Orientação: Wladimir Padilha da Silva".
1. bactérias ácido láticas. 2. sakacina P. 3. probiótico. 4. filmes bioativos. I. Título.
CDD 616.1437
Carla Pohl Sehn
Avaliação da atividade bacteriocinogênica e características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância
antimicrobiana em filmes biodegradáveis
Tese aprovada, como requisito parcial, para obtenção do grau de Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas.
Data da Defesa: 28 de agosto de 2015.
Banca examinadora:
Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva (Orientador) Doutor em Ciências dos Alimentos pela Universidade de São Paulo (USP)
Profª. Drª. Eduarda Hallal Duval Doutora em Biotecnologia pela Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
Drª. Márcia Magalhães Mata Doutora em Biotecnologia pela Universidade Federal de Pelotas (UFPEL)
Profª. Drª. Simone Pieniz Doutora em Microbiologia Agrícola e do Ambiente pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
Profª. Drª. Stela Maris Meister Meira Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Pelotas e a Universidade Federal do Pampa pela oportunidade de realização dessa etapa profissional.
Ao Professor Wladimir Padilha da Silva pela oportunidade, ensinamentos e, principalmente, por ter confiado na minha capacidade.
Aos colegas e amigos da Universidade Federal do Pampa, pelo apoio e incentivo.
Aos professores que, de alguma forma, contribuíram com este trabalho: Profª Elessandra Zavarese, Prof. Álvaro Guerra Dias, Prof Fábricio Conceição, Profª Patricia Diaz (Bilica), Prof Odir Dellagostin, Profª Eduarda Duval, Profª Stela Meira, Prof Eliezer Gandra, Profª Simone Pieniz e, em especial, à Profª Angela Fiorentini, pelos ensinamentos e carinho.
Aos colegas do Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, pelo convívio, confraternizações, chaves, senhas e risadas durante esse período. Em especial aos amigos do Laboratório de Grãos, Bárbara, Vânia, Jorge, Jean, obrigada por me acolherem.
À Shanise Halal, minha “dupla dinâmica”, pelos ensinamentos, pelas risadas e pela amizade construída.
À Josiara Mendes, do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Micologia Veterinária pela colaboração no trabalho e principalmente pela paciência.
Aos colegas e amigos dos tempos de Biotecnologia, Michele, André, Carol, Suely, Sérgio, Samuel, Anelize, Gustavo, Neida, Marcelle, Rodrigo,
Clóvis, especialmente à Karla, ao Marcelo, à Sibele e ao Carlos, foi muito bom revê-los e estar perto.
Aos estagiários do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, pela valiosa ajuda nas tarefas do dia-a-dia, pelo convívio e amizade, especialmente, aos meus pupilos, Maiara, Cristiano e Lyz, pelo carinho, confiança, lealdade e dedicação.
À Dona Sonia, meu eterno abraço de gratidão e saudade.
A todos os colegas e amigos do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, especialmente, Claudio, Guilherme, Darla, Márcia, Helena, Camila, Greici, Juliana, Mariana, Tassiana, Louise e Isabela, obrigada por tornarem esse ano muito especial e, com certeza inesquecível em minha vida.
À Graciele Funck, minha “dupla geminiana”, pela calma, ensinamentos, paciência, companheirismo e, principalmente pela amizade e por me tornar mais forte quando nem eu mesma acreditava.
Aos meus pais, Ilvo e Dulce, pelo carinho e incentivo em todas as etapas de minha formação, me apoiando para que eu não desistisse desse sonho.
A todos meus amigos, que de longe ou de perto, sempre me apoiaram. E a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
RESUMO
SEHN, Carla Pohl. Avaliação da atividade bacteriocinogênica e
características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância antimicrobiana em filmes biodegradáveis.
2015. 118 f. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2015.
Bactérias ácido láticas (BAL) é um grupo de micro-organismos heterogêneo que tem despertado grande interesse na indústria de alimentos devido à produção de substâncias antimicrobianas, como as bacteriocinas, e a utilização como probióticos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade bacteriocinogênica e as características probióticas do isolado Lactobacillus
curvatus LC254 e da utilização da sua substância antimicrobiana em filmes
biodegradáveis. Cento e trinta e sete isolados de BAL foram caracterizados e 105 apresentaram atividade antimicrobiana contra Listeria monocytogenes ATCC 7644. Um isolado apresentou atividade bacteriocinogênica e foi identificado, pelo sequenciamento de 16S rDNA, como Lactobacillus curvatus. Esse isolado, denominado LC254, é homofermentativo, móvel, resistente à vancomicina e tolera as condições simuladas do trato gastrointestinal. Tem capacidade de auto e coagregação, além de ser capaz de reduzir a adesão de
L. monocytogenes ATCC 7644 em células intestinais HCT-116. O isolado
LC254 carreia o gene codificador da bacteriocina Sakacina P, o qual foi confirmado por sequenciamento. A substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC254 tem natureza proteica e é estável em diferentes valores de pH, temperaturas e agentes químicos, além de apresentar ação contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Apresentou ação bacteriostática por até 3 h contra L. monocytogenes ATCC 7644 e não demonstrou toxicidade quando se utilizou Drosophila melanogaster como modelo. A substância antimicrobiana foi incorporada em filmes biodegradáveis produzidos com diferentes matrizes poliméricas e manteve atividade antimicrobiana por até 10 dias, demonstrando potencial para utilização no controle de L. monocytogenes em alimentos.
PALAVRAS-CHAVE: bactérias ácido láticas; sakacina P; probiótico; filmes
ABSTRACT
SEHN, Carla Pohl. Evaluation of the bacteriocinogenic activity and of the
probiotic characteristics of Lactobacillus curvatus isolate LC254 and the use of its antimicrobial substance in biodegradable films. 2015. 118 f.
Thesis (Ph.D.) - Graduate Program in Food Science and Technology. Federal University of Pelotas, Pelotas, 2015.
Lactic acid bacteria (LAB) are a group of heterogeneous microorganisms that are important to food industries due to the production of antimicrobial substances, such as bacteriocins, and their probiotic potential. This work aimed to evaluate isolate Lactobacillus curvatus LC254 characteristics and bactericinogenic activity in biodegradable films. One hundred and thirty seven LAB isolates were characterized. Of these, 105 presented antimicrobial activity against Listeria monocytogenes ATCC 7644. One isolate presented bacteriocinogenic activity and was identified as Lactobacillus curvatus by means of 16S rDNA sequencing. This isolate, referred to as LC254, is homofermentative, mobile, resistant to vancomycin, and tolerates simulated gastrointestinal tract conditions. It is capable of auto- and co-aggregation and of reducing L. monocytogenes ATCC 7644 adhesion to HCT-116 intestinal cells. LC254 isolated bears a gene coding for Sakacin P, which was confirmed by sequencing. The antimicrobial substance produced by LC254 is of proteic nature and is stable in a range of pH values and temperature and resistant to several chemical agents. It acts against both Gram-positive and –negative bacteria. The antimicrobial substance presented bacteriostatic activity for up to 3 h against L. monocytogenes ATCC 7644 and was not toxic to Drosophila
melanogaster. This antimicrobial substance was incorporated into biodegradable films produced with different polymeric matrixes and maintained antimicrobial activity for up to 10 days, demonstrating its potential to control L.
monocytogenes in food.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Motilidade do isolado Lactobacillus curvatus LC254 em ágar motilidade. ... 59
Figura 2 - Número de células viáveis do isolado Lactobacillus curvatus LC254 em suco gástrico simulado (pepsina 3 mg.mL-1 + pH 2,5).. ... 62
Figura 3 - Autogregação e coagregação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e de Listeria monocytogenes Scott A... 66
Figura 4 - Porcentagem de adesão de Listeria monocytogenes ATCC 7644 e do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a células intestinais HCT-116 após uma hora de incubação a 37 ºC. ... 69
Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 1,5 % com produto das PCR para genes de bacteriocinas. ... 76
Figura 6 - Mudanças no número de células viáveis (Log UFC.mL-1), pH e
atividade antimicrobiana (UA.mL-1) durante a multiplicação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a 30 ºC durante 48 h. ... 77
Figura 7 - Mudanças no número de células viáveis (Log UFC.mL-1), pH e
atividade antimicrobiana (UA.mL-1) durante a multiplicação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a 37 ºC durante 48 h ... 78
Figura 8 - Multiplicação de Listeria monocytogenes ATCC 7644 a 37 ºC após adição da substância antimicrobiana do isolado Lactobacillus curvatus LC254. ... 81
Figura 9 - Mortalidade de Drosophila melanogaster ao longo de 7 dias de tratamento com diferentes concentrações da substância antimicrobiana presente no sobrenadante livre de células do isolado Lactobacillus curvatus LC254 ... 83
Figura 10 - Efeito de diferentes concentrações da substância antimicrobiana presente no sobrenadante livre de células do isolado Lactobacillus curvatus LC254 sobre a mortalidade de Drosophila melanogaster após 7 dias de tratamento. ... 83
Figura 11 - Atividade antimicrobiana dos filmes I e J a base de amido de batata, incorporados com sobrenadante livre de células do isolado Lactobacillus
curvatus LC254 contendo a substância antimicrobiana, contra Listeria monocytogenes ATCC 7644, no primeiro dia de avaliação.. ... 87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Micro-organismos utilizados, condições de cultivo e origem ... 32
Tabela 2 - Primers utilizados para identificação de bactérias ácido láticas ... 36
Tabela 3 - Primers, condições da PCR utilizados na identificação de genes codificadores de bacteriocinas ... 47
Tabela 4 - Formulações de soluções filmogênicas elaboradas com diferentes concentrações de sobrenadante livre de célula de isolado de bactéria ácido lática e diferentes matrizes poliméricas ... 51
Tabela 5 - Identificação pelo sistema Vitek®2 de bactérias ácido láticas
homofermentativas e com atividade antimicrobiana, isoladas de queijo mussarela ... 57
Tabela 6 - Identificação por sequenciamento de uma região do gene 16s rDNA de bactérias ácido láticas homofermentativas e com atividade antimicrobiana, isoladas de queijo mussarela ... 57
Tabela 7 - Perfil de suscetibilidade do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a antimicrobianos de uso clínico e respectivos tamanhos dos halos de inibição 60
Tabela 8 - Número de células viáveis do isolado Lactobacillus curvatus LC254 em suco intestinal simulado (pancreatina 1mg.mL-1 + pH 8,0) na
presença/ausência de alimento e sais biliares ... 64
Tabela 9 - Espectro de ação da substância antimicrobiana produzida pelo isolado Lactobacillus curvatus LC254 ... 71
Tabela 10 - Efeito da ação de enzimas, pH, temperatura e agentes químicos sobre a estabilidade da substância antimicrobiana produzida pelo isolado
Lactobacillus curvatus LC254... 75
Tabela 11 - Atividade antimicrobiana de filmes contendo a substância antimicrobiana produzida pelo isolado Lactobacillus curvatus LC254 ao longo de 10 dias, contra Listeria monocytogenes ATCC 7644 ... 85
SUMÁRIO 1 Introdução ... 14 2 Objetivos ... 17 2.1 Geral... 17 2.2 Específicos ... 17 3 Revisão ... 19
3.1 Bactérias ácido láticas (BAL) ... 19
3.2 BAL produtoras de substâncias antimicrobianas ... 21
3.2.1 Bacteriocinas ... 23
3.3 BAL como probióticos ... 28
4 Material e métodos ... 31
4.1 Amostras, cepas e condições de cultivo ... 31
4.2 Identificação de isolados de BAL produtores de substâncias antimicrobianas ... 32
4.2.1 Perfil fermentativo ... 34
4.2.2 Identificação fenotípica ... 34
4.2.3 Identificação molecular ... 35
4.2.3.1 Extração de DNA ... 35
4.3 Caracterização de isolados produtores de substância antimicrobiana ... 37
4.3.1 Avaliação fenotípica de motilidade ... 37
4.3.2 Avaliação da suscetibilidade a antimicrobianos ... 37
4.3.3 Avaliação do potencial probiótico ... 38
4.3.3.1 Tolerância ao trato gastrointestinal de forma simulada ... 38
4.3.3.2 Capacidade de autoagregação, coagregação e hidrofobicidade ... 39
4.3.3.3 Avaliação da atividade da enzima β-galactosidase ... 40
4.3.3.4 Capacidade de adesão de L. monocytogenes ATCC 7644 e do isolado de BAL a células intestinais HCT-116 ... 41
4.4 Caracterização da substância antimicrobiana ... 43
4.4.1 Obtenção do sobrenadante livre de células (SLC) e determinação da atividade antimicrobiana ... 43
4.4.2 Determinação do espectro de atividade antimicrobiana ... 44
4.4.3 Avaliação da natureza da substância antimicrobiana ... 44
4.4.4 Avaliação da estabilidade da substância antimicrobiana na presença de agentes químicos e em diferentes valores de pH e temperatura ... 45
4.4.5 Avaliação de genes codificadores de bacteriocinas ... 46
4.4.6 Cinética de produção da substância antimicrobiana ... 48
4.4.7 Efeito da substância antimicrobiana sobre a multiplicação de L. monocytogenes ... 48
4.4.8 Avaliação da toxicidade da substância antimicrobiana em Modelo de Drosophila melanogaster ... 49
4.5 Avaliação da atividade antimicrobiana de filmes biodegradáveis incorporados de SLC de isolado de BAL ... 50
4.5.1 Material ... 50
4.5.2 Extração de amido ... 50
4.5.3 Elaboração de filmes biodegradáveis ... 51
5 Resultados e discussão... 55
5.1 Isolados de BAL produtores de substâncias antimicrobianas ... 55
5.2 Perfil fermentativo ... 56
5.3 Identificação dos isolados de BAL ... 57
5.4 Caracterização do isolado bacteriocinogênico ... 59
5.4.1 Motilidade ... 59
5.4.2 Suscetibilidade do isolado LC254 a antimicrobianos ... 60
5.4.3 Avaliação do potencial probiótico ... 61
5.4.3.1 Tolerância ao trato gastrointestinal de forma simulada ... 61
5.4.3.2 Autoagregação, coagregação e hidrofobicidade ... 65
5.4.3.3 Atividade da enzima β-galactosidase ... 67
5.4.3.4 Adesão de L. monocytogenes e do isolado LC254 a células intestinais HCT-116 ... 68
5.5 Caracterização da substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC254 ... 70
5.5.1 Atividade antimicrobiana e espectro de ação do SLC de LC254 ... 70
5.5.2 Natureza da substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC254 .. 73
5.5.3 Estabilidade da substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC254 aos agentes químicos e em diferentes valores de pH e temperatura ... 74
5.5.4 Presença de genes codificadores de bacteriocinas ... 75
5.5.5 Cinética de produção da substância antimicrobiana do isolado L. curvatus LC254 ... 77
5.5.6 Efeito da substância antimicrobiana sobre a multiplicação de L. monocytogenes ATCC 7644 ... 80
5.5.7 Toxicidade da substância antimicrobiana produzida por L. curvatus LC254 em modelo de Drosophila melanogaster ... 82
5.6 Atividade antimicrobiana de filmes biodegradáveis incorporados com a substância antimicrobiana produzida pelo isolado L. curvatus LC254 ... 84
6 Considerações finais ... 88 Referências ... 89 Apêndices... 110
1 Introdução
Nas últimas décadas, diversas mudanças socioeconômicas e culturais levaram a transformações no modo de vida da população. Pode-se observar, especificamente no Brasil, uma rápida transição demográfica, epidemiológica e nutricional, apresentando como consequência, maior expectativa de vida, mudanças importantes no padrão de saúde e no consumo alimentar da população brasileira, entre outras (BRASIL, 2014).
As alterações ocorridas no padrão de consumo alimentar são acompanhadas pelo crescente interesse por um estilo de vida mais saudável, incluindo a alimentação, quanto aos benefícios e a qualidade que os alimentos podem oferecer.
Bactérias ácido láticas (BAL) têm sido utilizadas há séculos na preservação de alimentos para o consumo humano e muitas espécies são reconhecidas como probióticos (SULLIVAN; ROSS; HILL, 2002).
Probióticos são definidos como micro-organismos vivos que, ao serem administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). Os benefícios à saúde que têm sido associados aos probióticos são a estabilização da microbiota intestinal após a utilização de antibióticos, maior resistência gastrointestinal à colonização por patógenos devido a ação de seus metabólitos (ácido acético, lático, bacteriocinas, etc), estimulação do sistema imune, prevenção de diarreias e doenças inflamatórias do intestino (VASILJEVIC; SHAH, 2008), entre outros ainda não comprovados.
Vários aspectos, incluindo características gerais, funcionais e tecnológicas, precisam ser considerados durante a seleção de estirpes probióticas, como a capacidade de sobreviver, se multiplicar e aderir ao epitélio intestinal, tolerar condições adversas, como a presença de sais biliares, suco
gástrico, pancreático e entérico, colonizar o intestino e apresentar capacidade antagônica a micro-organismos patogênicos (HUANG; ADAMS, 2004; SCHILLINGER et al., 2005).
Apesar da indústria alimentícia, cada vez mais, produzir e ofertar alimentos que conferem benefícios à saúde, como alimentos constituídos de probióticos, com elevados padrões sensoriais, longa vida útil e com valores nutricionais adequados, há uma tendência geral de aumento do consumo daqueles alimentos que tenham sido submetidos a tratamentos tecnológicos menos drásticos, preparados com poucos, ou mesmo sem aditivos químicos e com baixo teor de ácidos, açúcares, sais e gorduras (CASABURI et al., 2016). Importantes implicações microbiológicas derivam dessa tendência, uma vez que a maioria das alterações realizadas comprometem as condições de preservação dos produtos, levando a diminuição da vida útil e de segurança alimentar. É importante que esta perda potencial de preservação e segurança seja de alguma forma, compensada e restabelecida (NASCIMENTO; MORENO; KUAYE, 2008).
A bioconservação é uma técnica utilizada para estender a vida útil dos alimentos e aumentar a sua segurança por meio da aplicação de uma microbiota protetora ou de seus metabólitos (ROSS; MORGAN; HILL, 2002).
A capacidade de produção de uma vasta gama de compostos bioativos com atividade antimicrobiana, especialmente bacteriocinas, é outra característica importante atribuída às BAL. As bacteriocinas são peptídeos ou proteínas sintetizadas nas células bacterianas e liberadas no meio extracelular, com ação bactericida ou bacteriostática sobre diversos micro-organismos (JACK et al., 1995). Por essas características, BAL são utilizadas como bioconservantes em alimentos (GARCIA et al., 2004; KYUNGWHA; AZLIN, 2007).
Nas indústrias de alimentos, a bioconservação pode ser utilizada juntamente com as boas práticas de fabricação e higienização para evitar o crescimento de micro-organismos patogênicos e deteriorantes (GILLOR; ETZION; RILEY, 2008; MATAGARAS; DORSINOS; METAXOPOULOS, 2003; THERON; LUES, 2007). Entre as alternativas propostas, a utilização de substâncias antimicrobianas diretamente no alimento ou em filmes ativos, ou
mesmo a aplicação de isolados bacteriocinogênicos, tornam-se opções interessantes frente à essas questões.
A utilização de filmes incorporados com substâncias antimicrobianas apresenta algumas vantagens sobre os métodos convencionais de adição direta de conservantes em alimentos como, a utilização de uma menor quantidade dessas substâncias e a liberação de maneira controlada, por atuarem, principalmente, na superfície do produto (KRISTO et al., 2008).
Nesse sentido, o isolamento e a caracterização de novas linhagens provenientes de nichos não investigados, podem ser vantajosos para obtenção de linhagens com particularidades funcionais interessantes (ORTU et al., 2007). Além disso, BAL são constituintes naturais da microbiota de diversos alimentos, como leite e o queijo (HOLZAPFEL et al., 2001) e, vários trabalhos têm demonstrado os potenciais bactericinogênicos e/ou probióticos dessa microbiota (HERMANNS et al., 2014; JERONYMO-CENEVIVA, et al 2014; MEIRA, 2011; PERIN; NERO, 2014).
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Prospectar bactérias ácido láticas (BAL) produtoras de substâncias antimicrobianas e/ou com características probióticas isoladas a partir de queijo mussarela fatiado comercializado em supermercados e minimercados na cidade de Pelotas/RS, visando sua utilização tecnológica.
2.2 Específicos
Caracterizar BAL produtoras de substâncias antimicrobianas e/ou com características probióticas isoladas a partir de amostras de queijo mussarela fatiado, utilizando métodos fenotípicos e genotípicos;
Avaliar as características probióticas de isolados com atividade bacteriocinogênica;
Caracterizar a substância antimicrobiana produzida por isolados bacteriocinogênicos quanto ao espectro de ação, natureza proteica, estabilidade, cinética de produção, modo de ação e toxicidade, além de identificar genes codificadores de bacteriocinas;
Aplicar a substância antimicrobiana produzida por isolados bactericinogênicos em filmes biodegradáveis a base de diferentes matrizes poliméricas.
3 Revisão
3.1 Bactérias ácido láticas (BAL)
Bactérias ácido láticas (BAL) é a designação dada à um grupo de micro-organismos que não representa uma categoria taxonômica, mas que possuem características morfológicas, fisiológicas e metabólicas comuns (PFEILER; KLAENHAMMER, 2007). Apresentam-se como Gram-positivas, na forma de cocos, bacilos ou coco-bacilos (FUGELSANG; EDWARDS, 2007), não formam esporos, são anaeróbias facultativas ou microaerófilas, ácido tolerantes e reproduzem-se por fissão binária (WALSTRA; WOUTERS; GEURTS, 2006). Quanto à temperatura, podem ser mesófilas ou termófilas, com temperaturas ótimas de multiplicação variando entre 30 ºC e 37 ºC e, 45 ºC e 50 ºC, respectivamente (CARR; CHILL; MAIDA, 2002; DE MARTINIS; ALVES; FRANCO, 2002).
Geralmente, são micro-organismos imóveis, catalase negativa e desprovidos de citocromos, no entanto, algumas espécies foram identificadas com perfis distintos destes, como por exemplo, Pediococcus e Lactobacillus, capazes de produzir pseudo-catalase (ENGESSER; HAMMES, 1994). Outras espécies, na presença de sangue ou hematina, são capazes de formar catalase ou citocromo (MEISEL; WOLF; HAMMES, 1994; WHITTENBURY, 1964) e, pelo menos 14 espécies de Lactobacillus já foram descritas como móveis, das quais, 13 pertencentes à espécie L. salivarius (SALVETTI; TORRIANI; FELIS, 2012) e um L. curvatus (NRIC 0822) (COUSIN et al., 2015). O principal meio de obtenção de energia ocorre pela fermentação de carboidratos (especialmente glicose) e, baseado no perfil fermentativo, podem
ser classificadas em homo ou heterofermentativas. BAL homofermentativas produzem ácido lático como único ou o principal produto da fermentação da glicose, enquanto BAL heterofermentativas, são capazes de produzir, além do ácido lático, etanol, ácido acético e dióxido de carbono (CARR; CHILL; MAIDA, 2002). Em determinadas situações e dependendo da capacidade enzimática, algumas espécies de BAL utilizam vias alternativas para a metabolização do piruvato, levando a produção de outros compostos como o acetato, gás carbônico, peróxido, diacetil e acetoína (HUTKINS, 2006).
De acordo com Stiles e Holzapfel (1997), BAL compreendem os seguintes gêneros: Aerococcus, Alliococcus, Bifidobacterium, Carnobacterium,
Dolosigranulum, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella. Os gêneros Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus (produtos lácteos, carne, legumes, cereais), Lactococcus (produtos lácteos), Leuconostoc (vegetais, produtos lácteos), Oenococcus (vinho), Pediococcus (legumes, carne), Streptococcus (produtos
lácteos) e Weissella são os mais utilizados pela indústria alimentícia (BURGAIN et al., 2014; VANDAMME et al., 1996).
Tradicionalmente, BAL têm sido classificadas com base nas suas características fenotípicas, como por exemplo, morfologia, modo de fermentação de glicose, crescimento em diferentes temperaturas, etc. No entanto, Holzapfel et al. (2001) observaram que as características fenotípicas não correspondem com as relações filogenéticas sugeridas a partir da comparação de sequências de 16S rDNA, propondo uma nova classificação com base nessas sequências, que incluem os gêneros: Lactobacillus,
Lactococcus, Lactosphaera, Carnobacterium, Enterococcus, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella, Microbacterium, Bifidobacterium e Propionibacterium.
A primeira cultura pura de uma bactéria produtora de ácido lático foi obtida de uma amostra de leite por Joseph Lister, em 1873, sendo classificada como Bacterium lactis (SALMINEN; WRIGHT, 1998). No entanto, também são encontradas naturalmente no solo, na água, em fezes, em silagem e em plantas. Fazem parte da microbiota das mucosas do intestino, boca e do trato
genito-urinário, assim como da pele dos seres humanos e animais, e podem ter uma influência benéfica sobre estes ecossistemas (NETO et al., 2005)
Embora apresentem alguns aspectos negativos, como a deterioração de alimentos, referido para algumas espécies de Pediococcus (HAN et al., 2007) ou potencial patogênico, relacionado especialmente ao gênero Enterococcus e
Streptococcus (COLLINS; THORNTON; SULLIVAN, 1998; GUCHTE et al.,
2002), muitas espécies de BAL apresentam grande relevância na indústria de alimentos e em saúde pública.
As BAL podem ser classificadas em culturas iniciadoras ou starter (Starter Lactic Acid Bacteria) e, em não starter (Non Starter Lactic Acid
Bacteria). Culturas iniciadoras usadas em alimentos fermentados são
compostas por bactérias produtoras de ácidos e de aromas que influenciam na obtenção de um produto com variações dessas características sensoriais (SAMARZIJA et al., 2001). As culturas não starter geralmente são provenientes de alimentos e do ambiente de produção e utilizam, como fonte de energia alternativa, os aminoácidos liberados da autólise das culturas iniciadoras. Dessa forma, são capazes de modificar o sabor e o aroma original do produto. A associação das bactérias iniciadoras e não iniciadoras pode, em sinergia, contribuir positivamente para a qualidade do produto final (WILLIAMS; WITHERS; BANKS, 2000).
BAL desempenham um papel essencial na tecnologia da maioria dos alimentos fermentados, com uma ampla variedade de cepas sendo rotineiramente utilizadas na produção de derivados lácteos, cárneos, de vegetais e produtos de panificação. Atuam na preservação e modificação de características sensoriais, como sabor e textura (BONOMO et al., 2011; REIS et al., 2012) e através da produção de substâncias antimicrobianas, sendo utilizadas na bioconservação de produtos alimentícios (GARCIA et al., 2004; KYUNGWHA; AZLIN, 2007).
3.2 BAL produtoras de substâncias antimicrobianas
As BAL são importantes na conservação de alimentos devido à sua capacidade de interferir na multiplicação de bactérias deteriorantes e
patogênicas por meio de vários mecanismos, como competição por nutrientes e oxigênio, competição por sítios de ligação e através da produção de substâncias antimicrobianas (HUGAS, 1989). As principais substâncias produzidas por BAL com capacidade antimicrobiana são o ácido lático, peróxido de hidrogênio, dióxido de oxigênio (CO2), diacetil e as bacteriocinas,
que são amplamente estudadas, devido a sua importância como bioconservantes em alimentos (ORTOLANI, 2009).
Vários trabalhos relataram o isolamento e a caracterização de BAL bacteriocinogênicas a partir do leite e produtos lácteos, como o queijo, demonstrando que esses produtos são potenciais fontes para descoberta de novas substâncias com atividade inibitória contra micro-organismos indesejáveis (HERMANNS et al., 2014; ORTOLANI et al., 2010; PERIN; NERO, 2014).
A identificação da atividade antimicrobiana de BAL usualmente é realizada utilizando o método spot-on-the-lawn (LEWUS; MONTVILLE, 1991; TAGG et al., 1976) ou o método de difusão em ágar (TAGG et al, 1971). No primeiro, é realizada a inoculação da cultura de BAL em um ponto sobre o meio de cultura base e, após, adiciona-se uma sobrecamada de meio contendo o micro-organismo indicador. A formação de halo de inibição ao redor da cultura da BAL indica a atividade antagonista do isolado e este método nos fornece um resultado qualitativo da produção de substância antimicrobiana (PERIN, 2010). O método de difusão em ágar (TAGG et al., 1971) utiliza o sobrenadante do cultivo de BAL como indicador da atividade antimicrobiana. Este é obtido a partir de centrifugação, neutralização, tratamento térmico e esterilização, para posterior aplicação em cavidades feitas no meio de cultura, contendo o micro-organismo indicador. Uma variação deste método é a realização de diluição crítica (MAYR-HARTING; HEDGES; BERKELEY, 1972), em que são realizadas diluições do sobrenadante, as quais são inoculadas sobre o meio base, obtendo-se um resultado quantitativo da produção de substância antimicrobiana, expresso em Unidades Arbitrárias por mililitro (UA.mL-1). O método de difusão em ágar exclui a ação do ácido como substância antimicrobiana e consequentemente, determina em menor frequência isolados de BAL com potencial antimicrobiano quando comparado ao método
spot-on-the-lawn (ALEGRIA et al., 2010; MARTÍNEZ; SUÁREZ; RODRÍGUEZ, 1995; MORAES et al., 2010).
3.2.1 Bacteriocinas
As bacteriocinas são produzidas por, praticamente, todas as espécies bacterianas. Apesar do grande número de bacteriocinas produzidas por micro-organismos Gram-positivos e Gram-negativos, as únicas bacteriocinas utilizadas comercialmente são aquelas produzidas por BAL (ARTHUR; CAVERA; CHIKINDAS, 2014).
Normalmente, as bacteriocinas são sintetizadas na forma de pré-peptídeos ou pré-bacteriocinas biologicamente inativos. Esses pré-pré-peptídeos contêm uma sequência de 18 a 27 aminoácidos, apresentando duas glicinas na região N-terminal. As funções dessa sequência de aminoácidos são: evitar que a bacteriocina seja biologicamente ativa dentro da célula produtora e servir como sinal de reconhecimento para o sistema de transporte que envolve as proteínas do transporte ABC e uma proteína acessória (NES et al., 1996). Segundo Moll et al. (1996), as duas glicinas presentes na sequência de aminoácidos são as responsáveis pelo reconhecimento da pré-bacteriocina no sistema de transporte. Após o reconhecimento do pré-peptídeo, a sequência de aminoácidos é removida, e a bacteriocina, excretada da célula (ARTHUR; CAVERA; CHIKINDAS, 2014; ENNAHAR et al., 2000).
A produção das bacteriocinas ainda não está bem compreendida, mas um dos possíveis fatores está relacionado com a competição entre micro-organismos pelas mesmas fontes de nutrientes, permitindo à célula produtora dominar e se estabelecer em um dado nicho ecológico. Acredita-se que o mecanismo de produção de bacteriocinas seja regulado por quorum sensing, o qual é uma forma de comunicação célula-célula, onde as células presentes no ambiente produzem moléculas sinalizadoras (auto-indutoras) em função da densidade populacional. Quando a concentração celular do micro-organismo produtor excede um limiar, ocorre a expressão de alguns genes desse micro-organismo, a qual induz a produção e liberação de compostos, como as
bacteriocinas, no meio extracelular (EIJSINK et al., 2002; TUROVSKIY et al., 2007).
As bacteriocinas podem ter ação bactericida ou bacteriostática. A distinção entre os modos de ação é fortemente dependente da dose de bacteriocinas e do grau de purificação, estado fisiológico das células indicadoras (por exemplo, fase de crescimento) e das condições experimentais (por exemplo, temperatura, pH, a presença de agentes que alteram a integridade da parede celular e outros compostos antimicrobianos) (CINTAS et al., 2001; JUODEIKIENE et al., 2012).
As bacteriocinas, geralmente, exercem a sua atividade antimicrobiana na parede celular ou na membrana celular do organismo-alvo, seja por inibição da biossíntese da parede celular ou pela formação de poros. A formação de poros na membrana plasmática é acompanhada de um fluxo passivo de pequenas moléculas, como íons potássio, magnésio e fósforo, com dissipação da força próton motriz envolvida diretamente com a síntese de ATP, ácidos nucleicos, fosforilação de proteínas, levando à morte celular bacteriana (DE CARVALHO et al., 2010; RODRÍGUEZ et al., 1998).
Outro mecanismo de ação das bacteriocinas envolve a sua capacidade de induzir a lise da célula bacteriana. O processo está ligado à interação de bacteriocinas com os ácidos teicóico, teicurônico e lipoteicóico, componentes da parede celular, que resultam na liberação e ativação de enzimas autolíticas ligadas à célula, levando a autólise celular (GONZÁLES et al., 2010).
O sistema de classificação proposto inicialmente para bacteriocinas produzidas por BAL, definiu quatro classes (KLAENHAMMER, 1993) e, desde então, várias modificações têm ocorrido a fim de adequar as bacteriocinas em diferentes classes (COTTER; HILL; ROSS, 2005; FRANZ et al., 2007; VAN BELKUM; STILES, 2000), porém, ainda há muita incerteza de como distinguir e caracterizar com precisão as bacteriocinas.
A classificação mais aceita atualmente, divide as bacteriocinas produzidas por BAL em 3 classes:
- Classe I ou lantibióticos: formada por peptídeos de baixo peso molecular (< 5 kDa), termoestáveis, hidrofóbicas, catiônicas e diferenciam-se das demais bacteriocinas pela presença de lantionina e metilantionina. O
principal exemplo de bacteriocina pertencente a esta classe é a nisina. Esta bacteriocina é produzida por linhagens de Lactococcus lactis subsp. lactis e apresenta espectro de ação contra micro-organismos Gram positivos, como L.
monocytogenes, S. aureus, B. cereus, além de outros patógenos e espécies de
BAL. A nisina também pode exercer ação contra micro-organismos Gram negativos, quando combinada a outros tratamentos que alterem a permeabilidade da membrana plasmática, como EDTA ou SDS, por exemplo (HAMMOU et al., 2010).
- Classe II: formada por peptídeos com até 10 kDa, termoestáveis, hidrofóbicas, catiônicas e apresentam, de forma geral, uma estrutura helicoidal anfifílica, que possibilita sua inserção na membrana citoplasmática da célula alvo, promovendo a despolarização da membrana e a morte celular. São propostas 3 subdivisões para esta classe (DRIDER et al., 2006):
- Classe IIa: composta por bacteriocinas que apresentam especificidade contra L. monocytogenes. Seus representantes possuem 37 a 48 resíduos de aminoácidos, com porção N-terminal com configuração de folha pregueada e uma porção C-terminal contendo duas hélices (FIMLAND, et al., 2005). As bacteriocinas desta classe se inserem na membrana celular do micro-organismo alvo pela porção C-terminal, promovendo a formação de poros e consequente dissipação da força próton motriz. Na tentativa de manter ou restaurar a força próton motriz, ocorre uma aceleração no consumo do ATP e, consequentemente, a morte celular (KAISER; MONTVILLE, 1996). Pediocina AcH, enterocina A, sakacina A e P, leucocina A, mesentericina Y105, entre outras, são exemplos de bacteriocinas desta subclasse.
- Classe IIb: esta classe é composta por bacteriocinas heterodiméricas que requerem a atividade combinada de dois peptídeos. Seu mecanismo de ação também envolve a dissipação do potencial de membrana e diminuição da concentração intracelular de ATP (COTTER; HILL; ROSS, 2005). São exemplos de bacteriocinas desta subclasse, a plantaricina EF, JK e S, enterocina 1071, lactococina G e MN, entre outras.
- Classe IIc: as bacteriocinas pertencentes a esta classe apresentam uma união covalente das terminações C e N, resultando em uma estrutura
cíclica (COTTER; HILL; ROSS, 2005). São representantes desta classe: a enterocina AS-48, a circularina A e a reutericina 6.
- Classe III: é formada por proteínas com peso molecular maior que 10 kDa. São termolábeis, e consideradas complexas quanto à atividade e à estrutura proteica. São subdivididas em duas subclasses: IIIa ou bacteriolisinas e IIIb. A subclasse IIIa tem seu mecanismo de ação diferenciado das demais bacteriocinas, promovendo lise celular através da degradação da parede celular do micro-organismo alvo. A bacteriolisina melhor estudada é a lisostafina, um peptídeo de peso molecular de 27 kDa, responsável pela hidrólise da parede celular de muitas espécies de Staphylococcus, principalmente S. aureus (BASTOS, COUTINHO; COELHO, 2010). A subclasse IIIb, em contraste, compreende os peptídeos que não causam lise, mas sim dissipação do potencial de membrana e diminuição da concentração intracelular de ATP. A helveticina J é exemplo desta subclasse.
A utilização de bacteriocinas produzidas por BAL em alimentos é possível devido à certas características que estas apresentam, como: são reconhecidas como seguras (Generally Regarded As Safe - GRAS); não apresentam toxicidade às células eucarióticas e, geralmente, não são imunogênicas; são inativadas por proteases no trato gastrointestinal (TGI); em geral, apresentam tolerância a valores extremos de temperatura e pH; e, possuem espectro de ação antimicrobiano contra um grande número de bactérias (GÁLVEZ et al., 2007; TODOROV, 2009).
Há, pelo menos, três maneiras pelas quais as bacteriocinas podem ser incorporadas em um alimento para melhorar a sua segurança: utilizando uma preparação purificada ou semipurificada da bacteriocina como ingrediente alimentar; pela incorporação de um ingrediente que foi anteriormente fermentado com uma BAL produtora de bacteriocina ou pela utilização de BAL produtora de bacteriocina diretamente no produto fermentado para produção da bacteriocina in situ (ARTHUR; CAVERA; CHIKINDAS, 2014; CHEN; HOOVER, 2003; GÁLVEZ et al., 2008).
A aplicação das bacteriocinas na bioconservação dos alimentos oferece muitos benefícios, entre eles, o aumento da vida útil, redução do risco de veiculação de micro-organismos patogênicos, e a possibilidade de substituição
de conservantes químicos presentes em alguns alimentos (CASTELLANO et al., 2008; GÁLVEZ et al., 2007).
Atualmente, somente a nisina (Nisaplin), produzida por Lactococcus
lactis, e a pediocina PA-1/AcH (ALTATM 2431), produzida por Pediococcus acidilactici, são bacteriocinas aceitas como ingredientes comerciais para serem
utilizados como bioconservantes em alimentos (COTTER; HILL; ROSS, 2005; GÁLVEZ et al., 2007; GÁLVEZ et al., 2008). No Brasil, a única bacteriocina aprovada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para uso em queijos fundidos, preparados à base de queijos fundidos, queijos pasteurizados e requeijão, com limite máximo de 12,5 mg.Kg-1, é a nisina (ANVISA, 1996).
No entanto, a aplicação direta de bacteriocinas em alimentos pode resultar na diminuição ou perda da atividade antimicrobiana devido a fatores como, o pH do alimento, interações com fosfolipídios e proteínas, baixa solubilidade ou mesmo a inativação por enzimas endógenas (ALVES et al., 2006; BROMBERG et al., 2006). Dessa forma, a encapsulação de BAL bacteriocinogênicas (BARBOSA et al., 2015a) e a aplicação de bacteriocinas em filmes biodegradáveis (MASSANI et al, 2012; 2014; MEIRA et al., 2014), tornam-se alternativas para garantir a atividade antimicrobiana das bacteriocinas em alimentos.
Nas últimas décadas, o interesse por coberturas e filmes comestíveis e/ou biodegradáveis têm sido crescente devido a compatibilidade destes com o meio ambiente e a possibilidade de incorporação de agentes ativos, levando à uma maior segurança dos alimentos (BOTREL, 2007).
Filmes antimicrobianos são uma forma de embalagem ativa que pode aumentar a vida útil dos produtos e fornecer segurança aos consumidores. Este tipo de embalagem visa reduzir, inibir ou retardar a multiplicação de micro-organismos patogênicos e deteriorantes em alimentos (OJAGH et al., 2010).
As embalagens antimicrobianas podem ser divididas em dois grupos: no primeiro, o agente antimicrobiano migra da embalagem para a superfície do produto e, no segundo, os agentes são efetivos contra a multiplicação microbiana superficial sem a necessidade de migração para o produto. Ou seja, o requisito necessário para o funcionamento da embalagem antimicrobiana é o intenso contato com o alimento, o que restringe o número de compostos a
serem utilizados na elaboração de filmes antimicrobianos, uma vez que estes não podem causar contaminação ou deixar resíduos no alimento (ANVISA, 2010; VERMEIREN; DEVLIEGHERE; DEBEVERE, 2002).
Nesse sentido, as substâncias reconhecidas como seguras (GRAS) têm sido incorporadas em diferentes matrizes poliméricas para a produção de embalagens antimicrobianas, como o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (GÜÇBILMEZ et al., 2007), o ácido sórbico (CAGRI et al., 2001), o ácido benzóico e o ácido propiônico (MANAB et al., 2011). Além destas, a nisina (MEIRA et al., 2014) e outras bacteriocinas (MASSANI et al., 2012, 2014) apresentam grande potencial para aplicação em filmes ativos.
3.3 BAL como probióticos
Etimologicamente, o termo probiótico é derivado da palavra grega
Probios, e significa para a vida. Este termo foi utilizado pela primeira vez em
1965, por Lilly & Stillwell, para descrever “substâncias secretadas por micro-organismos e que estimulam o crescimento de outros micro-micro-organismos” (LILLY; STILLWELL, 1965). Desde então, outras definições foram atribuídas ao termo e, atualmente, segundo a Food and Agriculture Organization of the
United Nations – World Health Organization - probióticos são
“micro-organismos vivos que ao serem administrados em quantidades adequadas conferem benefícios à saúde do hospedeiro” (FAO/WHO, 2002).
A recomendação de micro-organismos viáveis a serem ingeridos é baseada na porção diária do produto pronto para consumo, sendo o mínimo estipulado de 108 a 109 UFC por 100 gramas ou mililitro ao dia, para atender as
concentrações fisiológicas (105 a 107 UFC.g-1 no conteúdo intestinal) (BRASIL,
2008; SAAD, 2006;). Além disso, é necessário que haja o consumo regularmente para que se mantenha o efeito desses micro-organismos sobre a composição da microbiota intestinal, já que a colonização não é permanente e sim transiente. De acordo com as atualizações de julho de 2008 da lista de alegações de propriedade funcional aprovadas da ANVISA, a quantidade mínima viável para os probióticos deve estar situada na faixa de 108 a 109
pronto para o consumo, conforme indicação do fabricante, e deve ser declarada no rótulo, próximo à alegação da propriedade funcional (ANVISA, 2008).
Entre os benefícios à saúde, atribuídos aos probióticos, podemos citar: a estabilização da microbiota intestinal após a utilização de antibióticos, maior resistência gastrointestinal à colonização por patógenos, devido a ação de seus metabólitos (ácido acético, lático, bacteriocinas, etc), estimulação do sistema imune, prevenção de diarreias e doenças inflamatórias do intestino (REIS et al., 2012; VASILJEVIC; SHAH, 2008).
Estudos apontam, ainda, efeitos antimutagênicos, anticancerígenos, hipocolesterolêmicos, anti-hipertensivo, anti-osteoporose e imunomoduladores (CHIANG; PAN, 2012). Além disso, desempenham papéis importantes contra inflamações, alergias, doenças auto-imunes (KARIMI et al., 2009), estresse oxidativo (LAMBERTI et al., 2011; MANGIAPANE et al., 2014) e doenças cardiovasculares (PIGEON; CUEST; GILILLIAND, 2002).
No entanto, esses benefícios à saúde fornecidos por probióticos são cepa específicos, portanto, nenhuma cepa probiótica será capaz de desempenhar todos esses benefícios simultaneamente, nem mesmo isolados de uma mesma espécie (FIGUEROA-GONZALEZ et al., 2011).
Os tipos mais comuns de micro-organismos utilizados como probióticos são BAL, embora outras bactérias e certas leveduras também possam ser usadas (DIDARI et al., 2014), como Saccharomyces boulardii não patogênicas (MORROW et al., 2012) e, recentemente, Pichia pastoris, cuja capacidade probiótica e atividade antibacteriana contra Salmonela Typhimurium, foi demonstrada (FRANÇA et al., 2015). No entanto, apenas as cepas classificadas como BAL são consideradas de importância, no que diz respeito à alimentação e nutrição (HOLZAPFEL et al., 2001).
Os principais representantes das bactérias probióticas pertencem aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium e as principais cepas encontradas em alimentos são L. rhamnosus GG (Valio®), L. casei Shirota (Yakult®); L.
acidophilus NCFM (Rhodia®) e La- 5 e Lc-1 (Chr. Hansen®) (FAO/WHO, 2002;
As principais características que um micro-organismo deve apresentar para ser considerado como probiótico, incluem: sobrevivência, capacidade de multiplicação e adesão ao epitélio intestinal; suportar condições adversas, como a presença de sais biliares, suco gástrico, pancreático e entérico; ter efeito antagônico às bactérias prejudiciais; não ser toxigênico ou patogênico para o hospedeiro (HUANG; ADAMS, 2004; SCHILLINGER et al., 2005). Do ponto de vista tecnológico, deve ser cultivável em escala industrial, além de apresentar alta viabilidade e estabilidade no produto final (GOLDIN, 1998; FRANCO et al., 2006)
Assim como para a aplicação de bacteriocinas, algumas estratégias têm sido empregadas visando aumentar a viabilidade de linhagens probióticas em situações adversas, como a utilização de células imobilizadas e técnicas de microencapsulação (DEL PIANO et al., 2006; SANZ, 2007).
4 Material e métodos
4.1 Amostras, cepas e condições de cultivo
Foram utilizadas 137 isolados de BAL provenientes de queijo mussarela fatiado comercializado em mercados e minimercados na cidade de Pelotas, Rio Grande do Sul (RS), pertencentes a coleção de culturas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, da Universidade Federal de Pelotas (DCTA-FAEM-UFPel).
Os isolados foram reativados em caldo Man, Rogosa e Sharpe (MRS) (Acumedia®) a 37 ºC por 24h e submetidos a um ciclo de purificação em ágar MRS a 37 ºC por 48h, sob anaerobiose. Os isolados purificados, com morfologia típica, Gram-positivos e catalase negativos, foram cultivados em caldo MRS (Acumedia®), a 37 ºC por 24h. Alíquotas de 1 mL dos cultivos foram acrescidas de 20 % de glicerol (Synth®) (v/v) e mantidas a - 80 ºC até o
momento do uso (cultura estoque).
Foram utilizadas cepas bacterianas padrão de BAL, bactérias Gram-positivas e Gram-negativas de importância em alimentos e, L. monocytogenes isoladas de alimentos, as quais estão apresentados na tabela 1. Estas, foram mantidos sob refrigeração em tubos contendo ágar MRS (BAL) e ágar Triptona de Soja (TSA, Acumedia®) (demais micro-organismos).
Tabela 1 - Micro-organismos utilizados, condições de cultivo e origem
Micro-organismo Condições de cultivo Origem
Escherichia coli O157 H7 ATCC 43895 BHI, 37 ºC, aerobiose
American Type Culture Collection
Escherichia coli ATCC 43895 BHI, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes ATCC 7644 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Listeria ivanovii ATCC 19119 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 BHI, 37 ºC, aerobiose
Salmonella Enteritidis ATCC 13076 BHI, 37 ºC, aerobiose
Salmonella Typhimurium ATCC 14028 BHI, 37 ºC, aerobiose
Shigella dysenteriae ATCC 13313 BHI, 37 ºC, aerobiose
Staphylococcus aureus ATCC 25923 BHI, 37 ºC, aerobiose
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 MRS, 37 ºC, aerobiose
Lactobacillus plantarum ATCC 8014 MRS, 37 ºC, aerobiose
Lactobacillus fermentum ATCC 9338 MRS, 37 ºC, aerobiose
Lactobacillus brevis ATCC 367 MRS, 37 ºC, aerobiose
Lactobacillus delbrueckii ATCC 3744 MRS, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes Scott A TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Food and Drug Administration
Listeria monocytogenes SILIKEN TSB-YE, 37 ºC, aerobiose University of Tasmania
Listeria innocua CLIP 12612 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Listeria collection of Institute Pasteur
Lactobacillus lactis subsp. lactis DY13 MRS, 37 ºC, aerobiose Gordons Bay, África do Sul
Listeria monocytogenes L6P4 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Laboratório de Microbiologia de Alimentos –
DCTA-FAEM-UFPel
Listeria monocytogenes L80P2 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes L89P2 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes L101P5 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes L136P8 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes L137P2 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes L164P5 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes L167Q5 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes L172P2 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes L177P4 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
Listeria monocytogenes L190Q5 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose
TSB-YE: Caldo Tripticase de Soja (Acumedia®) com 0,6% de Extrato de Levedura (Himedia®); BHI: Caldo Brain Heart Infusion (Himedia®); MRS: Caldo de Man Rogosa & Sharpe (Acumedia®).
4.2 Identificação de isolados de BAL produtores de substâncias antimicrobianas
Os isolados foram avaliados quanto a sua atividade antagonista e bacteriocinogênica, utilizando-se o cultivo puro e o sobrenadante livre de células (SLC), respectivamente, conforme descrito a seguir.
A atividade antagonista foi avaliada através do método spot-on-the-lawn, de acordo com Fleming et al. (1975), com adaptações. Como controle positivo, foi utilizada a cepa Lactobacillus lactis subsp. lactis DY13 e, como micro-organismo indicador, a cepa L. monocytogenes ATCC 7644.
A cepa L. monocytogenes ATCC 7644 foi recuperada em caldo Tripticase de Soja (Acumedia®) com 0,6 % de Extrato de Levedura (Himedia®) (TSB-YE) a 37 ºC por 24h, e quantificada a partir de diluições sucessivas e contagem das células, a fim de determinar e padronizar a quantidade necessária do micro-organismo indicador a ser utilizada nos ensaios (105
UFC.mL-1).
Os isolados de BAL e a cepa de L. lactis foram incubados em caldo MRS (1% v/v) a 37 ºC por 24h e, uma alíquota de 2 μL do cultivo foi aplicada sobre placas de Petri contendo ágar MRS. Após a adsorção, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h, sob anaerobiose, para não haver produção de peróxido de hidrogênio.
Decorridas as 24h, cada placa contendo os isolados recebeu uma sobrecamada de 10 mL de Brain Heart Infusion (BHI, Himedia®) semissólido (0,8 %) contendo, aproximadamente, 105 UFC.mL-1 de L. monocytogenes
ATCC 7644. Após a solidificação do meio, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h, sob aerobiose. A presença de halos de inibição (zonas de transparência ao redor dos isolados de BAL) de ≥ 2 mm, foi considerada como indicadora de atividade antagonista em relação ao micro-organismo indicador (FURTADO, 2010). A medida do tamanho do halo foi realizada utilizando paquímetro Digimess®.
A atividade bacteriocinogênica dos isolados de BAL foi avaliada através do método de difusão em ágar descrito por Biscola et al. (2013), com modificações. Primeiramente, foi obtido o SLC dos isolados de BAL a partir dos cultivos em caldo MRS (1% v/v) a 37 ºC, por 24h. Os cultivos foram centrifugados a 6.800 x g a 4 ºC, por 20min. Após, o sobrenadante de cada cultivo foi neutralizado (pH 7,0), utilizando-se solução de NaOH 1 N (Synth®), e aquecido a 80 °C por 10min (TODOROV; DICKS, 2004a).
Alíquotas de 20 µL de cada SLC dos isolados de BAL foram adicionadas sobre placas de Petri contendo ágar BHI com, aproximadamente, 105 UFC.mL-1
de L. monocytogenes ATCC 7644. Após a completa adsorção da alíquota pelo meio de cultura, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h. A presença de halo de inibição no meio foi considerada indicadora da produção de bacteriocina, caracterizando a capacidade bacteriocinogênica do isolado.
4.2.1 Perfil fermentativo
A capacidade de fermentar glicose com produção de gás (CO2) foi
determinada a partir do cultivo de 24h a 37 ºC em caldo MRS (1% v/v). Os isolados foram reinoculados (1 % v/v) em caldo MRS suplementado com 3 % de glicose (Synth®), em tubos de ensaio contendo tubos de Durhan e incubados a 37 ºC por 48h (LIMA et al., 2009). Lactobacillus fermentum ATCC 9338 e Lactobacillus plantarum ATCC 8014 foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente. Nos tubos em que se observou turbidez do meio e produção de gás, os isolados foram classificados como heterofermentativos, enquanto aqueles que apresentaram somente turvação do meio, foram classificados como homofermentativos. O ensaio foi realizado em duplicata.
4.2.2 Identificação fenotípica
Isolados de BAL homofermentativos foram selecionados para a identificação fenotípica pelo sistema Vitek®2 (bioMérieux), utilizando-se cartões
GP Test Kit VTK 2 (Gram-positivos). O preparo do inóculo, incubação, leitura e interpretação dos resultados foram realizados conforme instruções do fabricante. Resumidamente, os isolados foram cultivados em caldo MRS a 37 ºC, por 24h e recuperados em placas de Petri contendo ágar MRS, incubadas a 37 ºC, sob anaerobiose, por até 24h. Em seguida, a densidade celular foi ajustada em solução salina (CareFusion) a 0,43 %, em uma escala correspondendo a, aproximadamente, 0,61 a 0,63, em densímetro Densicheck® (BioMerieux), para posterior aplicação nos cartões contendo 43 testes bioquímicos.
Os cartões foram inoculados automaticamente por um sistema a vácuo, inseridos no módulo de incubação e leitura, e submetidos a uma medida cinética fluorescente a cada 15min. Os resultados foram armazenados em um sistema computadorizado, o qual, ao final da análise, emite um relatório com o resultado referente aos testes bioquímicos. O relatório apresenta, também, a
identificação do micro-organismo em nível de gênero e espécie, o tempo de análise e, quando necessário, provas bioquímicas adicionais para confirmação da identidade daqueles isolados nos quais houve um baixo poder discriminatório.
4.2.3 Identificação molecular
4.2.3.1 Extração de DNA
O DNA genômico dos isolados de BAL foi extraído conforme método adaptado a partir de Sambrook e Russell (2001). Primeiramente, 1,5 mL de um cultivo de 24h a 37 ºC em caldo MRS, de cada isolado, foi centrifugado por 5min a 10.000 x g a temperatura ambiente. O pellet formado foi ressuspendido em 100 µL de tampão STES [Tris-HCl 0,2 M; NaCl 0,5 M; SDS 0,1 %; EDTA 0,01 M; pH 7,6] (Synth®) e, aproximadamente, 50 µg de pérolas de vidro (pérolas de zircônia/sílica 0,1 mm, BioSpec) e 100 µL de fenol-clorofórmio (1:1) (Synth®) foram adicionados à mistura, a qual foi homogeneizada e centrifugada nas mesmas condições anteriores. O sobrenadante coletado foi adicionado de etanol 100 % (Synth®) (2 vezes o volume inicial) e NaCl 5 M (Synth®) (0,1 uma vez o volume inicial) e a mistura foi incubada a - 20 °C por 1h. Em seguida, foi realizada nova centrifugação a 10.000 x g por 20min, o sobrenadante descartado, o pellet lavado 2 vezes em álcool 70 % (Synth®) e deixado secar a 37 °C. O DNA foi, então, eluído em 30 µL de água ultrapura (Invitrogen®),
adicionado 1 µL de RNAse (Invitrogen®), mantido a -20 ºC e quantificado em
espectrofotômetro Eppendorf BioSpectrometer kinetic® (Eppendorf).
4.2.3.2 Amplificação por PCR e sequenciamento parcial do gene 16S rDNA
Os primers utilizados para amplificar uma porção da região codificadora do gene 16S rDNA utilizando o DNA genômico de cada um dos isolados são descritos na tabela 2. Um fragmento de, aproximadamente, 252 pares de bases (pb) foi esperado após a amplificação por PCR.
Tabela 2 - Primers utilizados para identificação de bactérias ácido láticas
Primers Sequência 5´- 3´ pb Referência
16S1 16S2
GGACGGGTGAGTAACACGTGG
TCCCGTAGGAGTCTGGACCGT 252 Baron et al. (2004)
Os primers utilizados foram desenhados por Baron et al. (2004) para identificação das espécies de Staphylococcus coagulase-positiva (S. aureus, S.
hycus e S. intermedius) e tem como alvo uma região altamente conservada do
gene RNA ribossomal 16S (rDNA). Logo, para a reação, foram utilizados como controle positivo e negativo, as cepas S. aureus ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC 11229, respectivamente. As reações foram realizadas em um volume final de 25 μL, contendo 12,5 μL de GoTaq® Green Master Mix 2 X (Promega
Corporation), 1 μL de cada primer (1 pmol), 2 μL de DNA genômico (50 ng) e 8,5 μL de água ultrapura. As reações foram realizadas em termociclador MJ Research PTC 100, sendo submetidas às etapas de desnaturação inicial (95 °C, 4min) seguida de 32 ciclos de desnaturação (95 °C, 2min), anelamento (52,7 °C, 2min) e extensão (72 °C, 2min). Ao término destes ciclos, a reação foi submetida a um ciclo de extensão final (72 °C, 7min). Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5 % (Invitrogen™), visualizados sob luz UV em transiluminador (Loccus® L-Pix Touch) e
purificados utilizando o kit Illustra GFX™ PCR and gel Band Purification (GE Healthcare), de acordo com as orientações do fabricante.
O sequenciamento das amostras foi realizado na Unidade de Análises Moleculares e de Proteínas (Centro de Pesquisa Experimental, HCPA), utilizando o equipamento ABI 3500 Genetic Analyzer com capilares de 50 cm e polímero POP7 (Applied Biosystems). Os produtos de PCR foram marcados utilizando-se 5,0 pmol do primer 16S1 5’-GGACGGGTGAGTAACACGTGG-3’ e 1 µL do reagente BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) em um volume final de 10 µL. As reações de marcação foram realizadas em termociclador Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) com uma etapa de desnaturação inicial a 96 ºC por 1min, seguida de 35 ciclos de 96 ºC por 15s, 50 ºC por 15s e 60 ºC por 4min. Após marcadas,
as amostras foram purificadas pela precipitação com BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems) e eletroinjetadas no sequenciador automático. O programa Contig Express foi usado para geração dos contigs. A identificação da espécie foi realizada através de busca e alinhamento de sequências homólogas no GenBank utilizando a ferramenta BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
4.3 Caracterização de isolados produtores de substância antimicrobiana
4.3.1 Avaliação fenotípica de motilidade
Após cultivo em caldo MRS (1% v/v) durante 24h a 37 ºC, o isolado foi inoculado em tubos de ensaio contendo 4 mL de ágar Motilidade (Difco®). Os
tubos foram incubados a 35 ºC, e a multiplicação celular observada entre 24 e 48h de incubação. O ensaio foi realizado em duplicata.
4.3.2 Avaliação da suscetibilidade a antimicrobianos
A suscetibilidade a antimicrobianos foi avaliada pelo teste de difusão em ágar Müller-Hinton (MH, Oxoid®), realizado de acordo com as normas do
documento M100-S22 do Clinical and Laboratory Stardards Institute (CLSI, 2012). Após o cultivo em ágar MRS a 37 ºC por 24h, o isolado de BAL foi repicado para solução salina 0,85% até atingir turbidez equivalente a 0,5 na escala de McFarland. Em seguida, com o auxílio de swab, a cultura foi semeada em ágar MH e foram adicionados os discos impregnados com diferentes tipos de antimicrobianos. Foram utilizados 10 agentes antimicrobianos: amicacina (30 µg), ampicilina (10 µg), cloranfenicol (30 µg), estreptomicina (10 µg), eritromicina (15 µ), gentamicina (10 µg), penicilina G (10U), sulfametoxazol-trimetoprim (25 µg), tetraciclina (30 µg) e vancomicina (30 µg) (Laborclin®). Após, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h e os
Digimess® e expressos em milímetros. Os resultados foram expressos como
isolado resistente (≤ 15mm), sensibilidade intermediária (16 – 20mm) ou sensível (≥ 21mm), conforme descrito por Liasi et al. (2009).
4.3.3 Avaliação do potencial probiótico
4.3.3.1 Tolerância ao trato gastrointestinal de forma simulada
A resistência à passagem do trato gastrointestinal foi avaliada de forma simulada, sendo realizada conforme Huang e Adams (2004). Primeiramente, foi realizada a ativação do isolado de BAL a partir do cultivo em 5 mL de caldo MRS, com posterior passagem para 10 mL de caldo MRS e incubação a 37 ºC, por 24h cada. O cultivo foi então centrifugado a 7.000 x g por 10min, a 4 ºC, e o
pellet obtido, lavado duas vezes com Tampão Fosfato Salina (PBS, Laborclin®),
com posterior ressuspensão em solução salina a 0,5 %. Uma alíquota de 200 µL da suspensão celular foi misturada em 300 µL de solução salina e à 1 mL de suco gástrico ou suco intestinal simulado, com posterior incubação à 37 ºC.
O suco gástrico simulado consistiu de 3 mg.mL-1 de pepsina
(Sigma-Aldrich®) e pH 2,5, enquanto o suco intestinal foi composto por 1 mg.mL-1 de
pancreatina (Sigma-Aldrich®) e pH 8,0.
A influência da presença de um alimento na sobrevivência do isolado à passagem do trato gastrointestinal de forma simulada, foi avaliada substituindo a solução salina por 300 µL de leite integral, reconstituído a 10 % (m/v) e, a influência da presença de sais biliares na sobrevivência à passagem do trato intestinal de forma simulada, foi avaliada pela adição de 0,5 % de bile bovina (Sigma-Aldrich®) ao suco intestinal.
A contagem do número de células viáveis durante a passagem pelo trato gástrico foi realizada nos tempos 0, 15, 30, 60, 120, 180 e 240min, enquanto a contagem à passagem pelo trato intestinal, foi realizada nos tempos 0, 60, 120, 180 e 240min, em placas de Petri contendo ágar MRS.
4.3.3.2 Capacidade de autoagregação, coagregação e hidrofobicidade
A capacidade de autoagregação e coagregação foi avaliada conforme metodologia descrita por Collado, Meriluoto, Salminen (2008). As suspensões celulares utilizadas nos ensaios foram obtidas a partir de cultivo do isolado em caldo MRS, e de L. monocytogenes ATCC Scott A (micro-organismo indicador) em BHI, ambos a 37 ºC, por 24h. Os cultivos foram centrifugados a 7.000 x g por 10min, a 4 ºC, e os pellets lavados duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram ressuspendidas em solução salina 0,5 % e a absorbância (600 nm) foi ajustada a 0,25 ± 0,02.
A autoagregação foi determinada a partir da leitura da absorbância (600 nm) das suspensões celulares, denominada suspensão bacteriana total e, após 2h, 20h e 24h de incubação a 37 ºC, denominadas de suspensão superior. Os resultados foram expressos em percentual, conforme a fórmula a seguir:
Onde: As = absorbância da suspensão superior; At = absorbância da suspensão total.
Para determinar a capacidade de coagregação, suspensões celulares do isolado de BAL e L. monocytogenes Scott A foram preparadas conforme descrito acima, incubadas a 37 ºC isoladamente (controles) e, em igual proporção do isolado e do patógeno (1:1). A leitura da absorbância (600 nm) foi realizada nos tempos 0, 2h, 4h e após 24h de incubação. Os resultados foram expressos em percentual, conforme a fórmula a seguir:
% autoagregação = 1 – (As/At) x 100
