4.5.1 Material
Foi testada a incorporação do SLC do isolado de BAL em filmes biodegradáveis de diferentes matrizes poliméricas. O SLC foi obtido a partir do cultivo do isolado em caldo MRS a 37 ºC por 24h, conforme descrito no item 4.4.1. O SLC também foi liofilizado por 48h a 25 ºC, 1,33 Pa (Edwards).
Foram elaborados filmes de amido (com e sem adição de Tween 20), de amido e celulose, e de zeína. Para a obtenção do amido foi utilizada batata inglesa adquirida no comércio local. Foi utilizada a celulose extraída de casca de arroz cultivar IRGA 417 e a zeína comercial (Z3625, Sigma-Aldrich®).
4.5.2 Extração de amido
O amido de batata foi isolado de acordo com Liu et al. (2003). As amostras de batata, da cultivar Baronesa (Solanum tuberosum L.), foram descascadas e imersas em bissulfito de sódio a 0,1% na proporção de 1:7 (p/v) por 2h. As batatas, dispersas na solução de bissulfito, foram trituradas em liquidificador doméstico, com adição de água destilada, por 5min e o material obtido foi filtrado em tecido de algodão e em peneira com abertura de 200 mesh, respectivamente. O material retido na peneira foi ressuspendido em água, sendo este processo repetido três vezes. Após, foi realizada uma etapa de decantação por 5h. O amido decantado foi seco em estufa com circulação forçada de ar a 40°C, até atingir 10% de umidade.
4.5.3 Elaboração de filmes biodegradáveis
4.5.3.1 Elaboração de filmes de amido incorporados com SLC de isolado de BAL
Os filmes foram elaborados utilizando a técnica de casting. As soluções filmogênicas (SF) foram compostas por 3 g de amido.100 mL-1 de água
destilada, 0,3 g de glicerol.g-1 de amido seco e diferentes concentrações do
SLC (líquido e liofilizado), as quais são apresentadas na tabela 4.
O amido e o glicerol foram suspensos em água e aquecidos em banho- maria a 85 ºC por 5min. Após, procedeu-se o resfriamento a 50 ºC e adição do SLC líquido ou liofilizado, de acordo com a formulação da SF. Quando adicionado o SLC liofilizado, a SF foi submetida a agitação em ultraturrax a 14.000 rpm durante 5min. Em seguida, 20 g de cada SF foi espalhada em placas de Petri acrílicas de 9 cm de diâmetro e mantidas em estufa de circulação de ar a 35 ºC por 24h. Após a secagem, os filmes foram acondicionados em ambiente com umidade relativa de 75 ± 5 % para posterior análise.
Tabela 4 - Formulações de soluções filmogênicas elaboradas com diferentes concentrações de sobrenadante livre de célula de isolado de bactéria ácido lática e diferentes matrizes poliméricas
Formulação Formulação básica SLC Tween 20 Agitação* A Amido de batata 0,25 g (liofilizado) Sem Com B Amido de batata 0,50 g (liofilizado) Sem Com C Amido de batata + celulose 0,25 g (liofilizado) Sem Com D Amido de batata + celulose 0,50 g (liofilizado) Sem Com E Amido de batata 10 mL (líquido) Sem Sem F Amido de batata 20 mL (líquido) Sem Sem
G Zeína 10 mL (líquido) Sem Sem
H Zeína 0,50 g (liofilizado) Sem Sem
I Amido de batata 10 mL (líquido) Com Sem J Amido de batata 20 mL (liquido) Com Sem * Ultraturrax 14.000 rpm
4.5.3.2 Elaboração de filmes de amido incorporados com SLC de isolado de BAL com adição de Tween 20
Os filmes foram elaborados utilizando a técnica de casting. As SF foram compostas por 3 g de amido.100 g-1 de água destilada, 0,3 g de glicerol.g-1 de
amido seco e 100 µL de Tween 20 e diferentes concentrações do SLC (líquido e liofilizado), as quais são apresentadas na tabela 4.
O amido, o glicerol e o Tween 20 foram suspensos em água e aquecidos em banho-maria a 85 ºC por 5min. Após, procedeu-se o resfriamento a 50 ºC e adição do SLC líquido de acordo com a formulação da SF. Em seguida, 20 g de cada SF foi espalhada em placas de Petri acrílicas de 9 cm de diâmetro e mantidas em estufa de circulação de ar a 35 ºC por 24h. Após a secagem, os filmes foram acondicionados em ambiente com umidade relativa de 75 ± 5 % para posterior análise.
4.5.3.3 Elaboração de filmes de amido e celulose incorporados com SLC de isolado de BAL
Os filmes foram elaborados utilizando a técnica de casting. As SF foram compostas por 3 g de amido.100 g-1 de água destilada, 0,3 g de glicerol.g-1 de
amido seco, 0,05 g de celulose.100 g-1 de amido seco, goma guar 0,01 g/g de
amido seco (para evitar a sedimentação de fibras) e diferentes concentrações do SLC liofilizado, as quais são apresentadas na tabela 4.
As fibras de celulose e a goma-guar foram suspensas em água, submetidas a agitação em ultraturrax a 14.000 rpm durante 10min e, após, adicionado à esta solução, o amido e o glicerol. As SF foram aquecidas em banho–maria a 85 ºC durante 5min, com posterior resfriamento a 50 ºC, adição do SLC liofilizado e homogeneização em ultraturrax a 14.000 rpm por 5min. Em seguida, 20 g de cada SF foi espalhada em placas de acrílico de 9 cm de diâmetro e secas em estufa com circulação de ar a 35°C por 24h. Após a secagem, os filmes foram acondicionados em ambiente com umidade relativa de 75 ± 5 % para posterior análise.
4.5.3.4 Elaboração de filmes de zeína incorporados com SLC do isolado de BAL
Os filmes à base de zeína foram elaborados utilizando o método descrito por Chen et al. (2014), com modificações. As SF foram compostas por 10 g de zeína.100 g-1 de solução etanólica 70%, 3 g de glicerol e diferentes
concentrações do SLC (líquido e liofilizado) as quais são apresentadas na tabela 4.
A zeína, o glicerol e o SLC foram suspensos em solução etanólica, homogeneizados com bastão de vidro e aquecidos em banho-maria a 60 ºC por 10min de acordo com a formulação da SF. Em seguida, 20 g de cada SF foi espalhada em placas de Petri acrílicas de 9 cm de diâmetro e mantidas em estufa de circulação de ar a 39 ºC por 2h e, posteriormente, a 30 ºC por 16h. Após a secagem, os filmes foram acondicionados em ambiente com umidade relativa de 75 ± 5 % para posterior análise.
4.5.4 Avaliação da atividade antimicrobiana dos filmes incorporados com SLC do isolado de BAL
A atividade antimicrobiana do SLC líquido, liofilizado e dos filmes incorporados com o SLC do isolado de BAL foi determinada utilizando-se o método de difusão em ágar (BISCOLA et al., 2013). Para determinação da atividade antimicrobiana do SLC liofilizado, o mesmo foi ressuspendido em PBS na concentração de 1 mg.mL-1. Primeiramente, os filmes foram
assepticamente cortados em círculo, de cerca de 8 mm de diâmetro, e expostos à luz ultravioleta (UV) em capela de fluxo laminar, durante 30min, para esterilização (CAGRI et al., 2001). Em seguida, os filmes foram adicionados à superfície de placas de Petri contendo ágar BHI, previamente inoculado com L. monocytogenes ATCC 7644 (micro-organismo indicador), na concentração de 105 UFC.mL-1. Como controle positivo, foi utilizado o SLC
puro. As placas foram incubadas a 37 °C por 18h e, após esse período, analisadas quanto à formação de halos de inibição, expressos em mm, como a média de duas medições.
A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada nos tempos 1, 3, 6 e 10 dias, a fim de verificar a estabilidade da atividade antimicrobiana ao longo do tempo. Os filmes foram armazenados a temperatura ambiente e umidade relativa de 75 %.