Os isolados foram avaliados quanto a sua atividade antagonista e bacteriocinogênica, utilizando-se o cultivo puro e o sobrenadante livre de células (SLC), respectivamente, conforme descrito a seguir.
A atividade antagonista foi avaliada através do método spot-on-the-lawn, de acordo com Fleming et al. (1975), com adaptações. Como controle positivo, foi utilizada a cepa Lactobacillus lactis subsp. lactis DY13 e, como micro- organismo indicador, a cepa L. monocytogenes ATCC 7644.
A cepa L. monocytogenes ATCC 7644 foi recuperada em caldo Tripticase de Soja (Acumedia®) com 0,6 % de Extrato de Levedura (Himedia®) (TSB-YE) a 37 ºC por 24h, e quantificada a partir de diluições sucessivas e contagem das células, a fim de determinar e padronizar a quantidade necessária do micro-organismo indicador a ser utilizada nos ensaios (105
UFC.mL-1).
Os isolados de BAL e a cepa de L. lactis foram incubados em caldo MRS (1% v/v) a 37 ºC por 24h e, uma alíquota de 2 μL do cultivo foi aplicada sobre placas de Petri contendo ágar MRS. Após a adsorção, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h, sob anaerobiose, para não haver produção de peróxido de hidrogênio.
Decorridas as 24h, cada placa contendo os isolados recebeu uma sobrecamada de 10 mL de Brain Heart Infusion (BHI, Himedia®) semissólido (0,8 %) contendo, aproximadamente, 105 UFC.mL-1 de L. monocytogenes
ATCC 7644. Após a solidificação do meio, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h, sob aerobiose. A presença de halos de inibição (zonas de transparência ao redor dos isolados de BAL) de ≥ 2 mm, foi considerada como indicadora de atividade antagonista em relação ao micro-organismo indicador (FURTADO, 2010). A medida do tamanho do halo foi realizada utilizando paquímetro Digimess®.
A atividade bacteriocinogênica dos isolados de BAL foi avaliada através do método de difusão em ágar descrito por Biscola et al. (2013), com modificações. Primeiramente, foi obtido o SLC dos isolados de BAL a partir dos cultivos em caldo MRS (1% v/v) a 37 ºC, por 24h. Os cultivos foram centrifugados a 6.800 x g a 4 ºC, por 20min. Após, o sobrenadante de cada cultivo foi neutralizado (pH 7,0), utilizando-se solução de NaOH 1 N (Synth®), e aquecido a 80 °C por 10min (TODOROV; DICKS, 2004a).
Alíquotas de 20 µL de cada SLC dos isolados de BAL foram adicionadas sobre placas de Petri contendo ágar BHI com, aproximadamente, 105 UFC.mL-1
de L. monocytogenes ATCC 7644. Após a completa adsorção da alíquota pelo meio de cultura, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h. A presença de halo de inibição no meio foi considerada indicadora da produção de bacteriocina, caracterizando a capacidade bacteriocinogênica do isolado.
4.2.1 Perfil fermentativo
A capacidade de fermentar glicose com produção de gás (CO2) foi
determinada a partir do cultivo de 24h a 37 ºC em caldo MRS (1% v/v). Os isolados foram reinoculados (1 % v/v) em caldo MRS suplementado com 3 % de glicose (Synth®), em tubos de ensaio contendo tubos de Durhan e incubados a 37 ºC por 48h (LIMA et al., 2009). Lactobacillus fermentum ATCC 9338 e Lactobacillus plantarum ATCC 8014 foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente. Nos tubos em que se observou turbidez do meio e produção de gás, os isolados foram classificados como heterofermentativos, enquanto aqueles que apresentaram somente turvação do meio, foram classificados como homofermentativos. O ensaio foi realizado em duplicata.
4.2.2 Identificação fenotípica
Isolados de BAL homofermentativos foram selecionados para a identificação fenotípica pelo sistema Vitek®2 (bioMérieux), utilizando-se cartões
GP Test Kit VTK 2 (Gram-positivos). O preparo do inóculo, incubação, leitura e interpretação dos resultados foram realizados conforme instruções do fabricante. Resumidamente, os isolados foram cultivados em caldo MRS a 37 ºC, por 24h e recuperados em placas de Petri contendo ágar MRS, incubadas a 37 ºC, sob anaerobiose, por até 24h. Em seguida, a densidade celular foi ajustada em solução salina (CareFusion) a 0,43 %, em uma escala correspondendo a, aproximadamente, 0,61 a 0,63, em densímetro Densicheck® (BioMerieux), para posterior aplicação nos cartões contendo 43 testes bioquímicos.
Os cartões foram inoculados automaticamente por um sistema a vácuo, inseridos no módulo de incubação e leitura, e submetidos a uma medida cinética fluorescente a cada 15min. Os resultados foram armazenados em um sistema computadorizado, o qual, ao final da análise, emite um relatório com o resultado referente aos testes bioquímicos. O relatório apresenta, também, a
identificação do micro-organismo em nível de gênero e espécie, o tempo de análise e, quando necessário, provas bioquímicas adicionais para confirmação da identidade daqueles isolados nos quais houve um baixo poder discriminatório.
4.2.3 Identificação molecular
4.2.3.1 Extração de DNA
O DNA genômico dos isolados de BAL foi extraído conforme método adaptado a partir de Sambrook e Russell (2001). Primeiramente, 1,5 mL de um cultivo de 24h a 37 ºC em caldo MRS, de cada isolado, foi centrifugado por 5min a 10.000 x g a temperatura ambiente. O pellet formado foi ressuspendido em 100 µL de tampão STES [Tris-HCl 0,2 M; NaCl 0,5 M; SDS 0,1 %; EDTA 0,01 M; pH 7,6] (Synth®) e, aproximadamente, 50 µg de pérolas de vidro (pérolas de zircônia/sílica 0,1 mm, BioSpec) e 100 µL de fenol-clorofórmio (1:1) (Synth®) foram adicionados à mistura, a qual foi homogeneizada e centrifugada nas mesmas condições anteriores. O sobrenadante coletado foi adicionado de etanol 100 % (Synth®) (2 vezes o volume inicial) e NaCl 5 M (Synth®) (0,1 uma vez o volume inicial) e a mistura foi incubada a - 20 °C por 1h. Em seguida, foi realizada nova centrifugação a 10.000 x g por 20min, o sobrenadante descartado, o pellet lavado 2 vezes em álcool 70 % (Synth®) e deixado secar a 37 °C. O DNA foi, então, eluído em 30 µL de água ultrapura (Invitrogen®),
adicionado 1 µL de RNAse (Invitrogen®), mantido a -20 ºC e quantificado em
espectrofotômetro Eppendorf BioSpectrometer kinetic® (Eppendorf).
4.2.3.2 Amplificação por PCR e sequenciamento parcial do gene 16S rDNA
Os primers utilizados para amplificar uma porção da região codificadora do gene 16S rDNA utilizando o DNA genômico de cada um dos isolados são descritos na tabela 2. Um fragmento de, aproximadamente, 252 pares de bases (pb) foi esperado após a amplificação por PCR.
Tabela 2 - Primers utilizados para identificação de bactérias ácido láticas
Primers Sequência 5´- 3´ pb Referência
16S1 16S2
GGACGGGTGAGTAACACGTGG
TCCCGTAGGAGTCTGGACCGT 252 Baron et al. (2004)
Os primers utilizados foram desenhados por Baron et al. (2004) para identificação das espécies de Staphylococcus coagulase-positiva (S. aureus, S.
hycus e S. intermedius) e tem como alvo uma região altamente conservada do
gene RNA ribossomal 16S (rDNA). Logo, para a reação, foram utilizados como controle positivo e negativo, as cepas S. aureus ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC 11229, respectivamente. As reações foram realizadas em um volume final de 25 μL, contendo 12,5 μL de GoTaq® Green Master Mix 2 X (Promega
Corporation), 1 μL de cada primer (1 pmol), 2 μL de DNA genômico (50 ng) e 8,5 μL de água ultrapura. As reações foram realizadas em termociclador MJ Research PTC 100, sendo submetidas às etapas de desnaturação inicial (95 °C, 4min) seguida de 32 ciclos de desnaturação (95 °C, 2min), anelamento (52,7 °C, 2min) e extensão (72 °C, 2min). Ao término destes ciclos, a reação foi submetida a um ciclo de extensão final (72 °C, 7min). Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5 % (Invitrogen™), visualizados sob luz UV em transiluminador (Loccus® L-Pix Touch) e
purificados utilizando o kit Illustra GFX™ PCR and gel Band Purification (GE Healthcare), de acordo com as orientações do fabricante.
O sequenciamento das amostras foi realizado na Unidade de Análises Moleculares e de Proteínas (Centro de Pesquisa Experimental, HCPA), utilizando o equipamento ABI 3500 Genetic Analyzer com capilares de 50 cm e polímero POP7 (Applied Biosystems). Os produtos de PCR foram marcados utilizando-se 5,0 pmol do primer 16S1 5’-GGACGGGTGAGTAACACGTGG-3’ e 1 µL do reagente BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) em um volume final de 10 µL. As reações de marcação foram realizadas em termociclador Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) com uma etapa de desnaturação inicial a 96 ºC por 1min, seguida de 35 ciclos de 96 ºC por 15s, 50 ºC por 15s e 60 ºC por 4min. Após marcadas,
as amostras foram purificadas pela precipitação com BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems) e eletroinjetadas no sequenciador automático. O programa Contig Express foi usado para geração dos contigs. A identificação da espécie foi realizada através de busca e alinhamento de sequências homólogas no GenBank utilizando a ferramenta BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).