5.5 Caracterização da substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC
5.5.5 Cinética de produção da substância antimicrobiana do isolado L curvatus
Os resultados da cinética de multiplicação de LC254 e de produção da substância antimicrobiana produzida em caldo MRS a 30 ºC e 37 ºC, estão apresentados nas figuras 6 e 7, respectivamente (Apêndice C).
Figura 6 - Mudanças no número de células viáveis (Log UFC.mL-1), pH e atividade
antimicrobiana (UA.mL-1) durante a multiplicação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a 30
ºC durante 48h. Resultados da análise de variância com índice de confiança de 95%. Cada ponto representa a média de 3 repetições testados em duplicata.Linha verde: pH;linha azul: LogUFC.mL-1; barra laranja: UA.mL-1 utilizando L. monocytogenes ATCC 7644 como micro-
organismo indicador;barra cinza: UA.mL-1 utilizando L. monocytogenes Scott A como micro-
organismo indicador. *: atividade antimicrobiana determinada em unidades arbitrárias (UA.mL-1)
Figura 7 - Mudanças no número de células viáveis (Log UFC.mL-1), pH e atividade
antimicrobiana (UA.mL-1) durante a multiplicação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a 37
ºC durante 48h. Resultados da análise de variância com índice de confiança de 95%. Cada ponto representa a média de 3 repetições testados em duplicata. Linha verde: pH;linha azul: Log UFC.mL-1; barra laranja: UA.mL-1 utilizando L. monocytogenes ATCC 7644 como micro-
organismo indicador;barra cinza: UA.mL-1 utilizando L. monocytogenes Scott A como micro-
organismo indicador. *: atividade antimicrobiana determinada em unidades arbitrárias (UA.mL-1)
por método de diluição crítica.
A redução do pH de 6 para 4 ocorreu no mesmo intervalo de tempo para as duas temperaturas testadas (30 e 37 ºC) e manteve-se constante até o final do período avaliado. Observa-se diferença significativa (p<0,05) no número de células viáveis e na produção de substância antimicrobiana entre os tempos avaliados.
O número de células viáveis manteve-se constante ao longo de 6 h de cultivo e, em 8h, foi significativamente maior (p<0,05) a 30 ºC que a 37 ºC, diferença mantida ao longo das 48h avaliadas, mesmo após a redução do número de células viáveis a partir de 24h.
Quanto à atividade antimicrobiana contra L. monocytogenes ATCC 7644, verificou-se que a máxima concentração atingida foi de 6.400 UA.mL-1, em 18h
a 30 ºC e, em 10h a 37 ºC. No entanto, em 48h a 37 ºC houve redução significativa (p<0,05) da atividade antimicrobiana. Resultados semelhantes já
foram relatados para outras bacteriocinas (BAREFOOT; KLAENHAMMER, 1984; LEROY; DE VUYST, 1999; MESSENS; DE VUYST, 2002; XIRAPHI et al, 2006, CASABURI et al., 2016) e pode ser devido à vários fatores, como agregação, presença e ação de proteases extracelulares ou mesmo a adsorção às células do próprio isolado produtor da substância antimicrobiana (DE VUYST; CALLEWAERT; CRABBE, 1996).
Utilizando L. monocytogenes Scott A como micro-organismo indicador da atividade antimicrobiana, o valor máximo atingido foi de 800 UA.mL-1 em 2h
e, 1.600 UA.mL-1 em 10h, mantendo-se constante ao longo das 48h.
As bacteriocinas MBSa2 e MBSa3, produzidas por isolados de L.
curvatus em caldo MRS foram avaliadas a 25 ºC, 30 ºC e 37 ºC por Barbosa et
al. (2015). O início da produção das bacteriocinas ocorreu em 4h, com diminuição depois de 12h a 37 ºC. O máximo de atividade antimicrobiana (12.800 UA.mL-1) foi atingido em 8h a 25 ºC e 37 ºC e, em 6h a 30 ºC, exceto
para a bacteriocina MBSa3 a 25 ºC, que obteve o valor máximo em 10h. Estas características indicam uma cinética de metabolismo primário, ou seja, a produção de metabólito ocorreu durante a fase logarítmica de multiplicação microbiana (SIP et al. 2012). Esta característica também foi observada para outras bacteriocinas, como Sakacina K, produzida por L. sakei CTC 494 (LEROY; DE VUYST, 1999), Sakacina P, produzida por L. sakei CCUG 42687 (MORETRO et al., 2000) e curvacina A, produzida por L. curvatus LTH 1174 (MESSENS; DE VUYST, 2002).
A diferença encontrada entre a atividade antimicrobiana contra L.
monocytogenes ATCC 7644 e L. monocytogenes Scott A, também foi relatada
por Murua et al. (2013). Estes autores avaliaram a atividade da bacteriocina produzida pelo isolado L. plantarum LP08AD, e obtiveram maiores valores contra L. monocytogenes, em comparação a L. curvatus e E. faecium, e atribuíram o resultado a presença de receptores presentes na superfície de L.
5.5.6 Efeito da substância antimicrobiana sobre a multiplicação de L. monocytogenes ATCC 7644
Os resultados obtidos para a multiplicação celular após adição de 20 % e 50 % do SLC do isolado LC254 (6.400 UA.mL-1) à cultura de L.
monocytogenes ATCC 7644 estão apresentados na figura 8 (Apêndice D).
Observa-se que a substância antimicrobiana presente no SLC do isolado LC254 foi capaz de reduzir significativamente (p<0,05) o número de células viáveis de L. monocytogenes ATCC 7644 logo após a adição do sobrenadante (de 8,26 ± 0,00 UFC.mL-1 para 7,39 ± 0,04 UFC.mL-1 e 6,66 ± 0,48 UFC.mL-1,
em 20 e 50 % de SLC adicionado, respectivamente) e, essa diferença entre o controle e os dois tratamentos se manteve ao longo das 6 h avaliadas. A adição de 50 % de SLC ao cultivo de L. monocytogenes ATCC 7644, apresentou o melhor resultado, com redução por cerca de 3h do número de células viáveis de L. monocytogenes ATCC 7644. No entanto, no decorrer do tempo avaliado, observa-se um aumento gradual do número de células, chegando a valores semelhantes (p>0,05) aos iniciais, o que sugere que L.
monocytogenes ATCC 7644 foi capaz de se recuperar a partir dos tratamentos
utilizados. Da mesma forma, Todorov e Dicks (2004a) verificaram que as bacteriocinas ST28MS e ST26MS, produzidas por L. plantarum, apresentaram capacidade de reprimir a multiplicação celular de L. casei e P. aeruginosa por 2h.
Figura 8 - Multiplicação de Listeria monocytogenes ATCC 7644 a 37 ºC após adição da substância antimicrobiana do isolado Lactobacillus curvatus LC254. Linha azul: (controle) L.
monocytogenes ATCC 7644 sem adição de SLC; Linha laranja: L. monocytogenes ATCC 7644 + 20 % do SLC do isolado LC254; Linha verde: L. monocytogenes ATCC 7644 + 50 % do SLC do isolado LC254.
Cabe ressaltar que este experimento foi realizado utilizando-se alta concentração inicial do micro-organismo indicador (108 UFC.mL-1), a qual
dificilmente é encontrada em alimentos contaminados por L. monocytogenes. Pode-se supor que em menores populações do patógeno, a substância antimicrobiana presente no SLC do isolado LC254 poderia ser mais eficaz. Rilla, Martinez e Rodrigues (2004) observaram a ação de L. lactis subsp. lactis IPLA729 frente ao micro-organismo patogênico S. aureus em duas diferentes concentrações: 104 UFC.mL-1 (amostra 1) e 106 UFC.mL-1 (amostra 2). Após
24h de incubação não foi detectado S. aureus na amostra 1, entretanto, na amostra 2, foram detectadas cerca de 104 UFC.mL-1 de S. aureus. Além disso,
é importante considerar que a atividade inibitória apresentada por bactérias produtoras de bacteriocina em meios de cultura (in vitro) pode não ocorrer em matrizes alimentares. Vários fatores presentes nos alimentos podem influenciar no efeito antimicrobiano, por exemplo, interação com aditivos e ingredientes,
inativação por enzimas alimentares e mudanças no pH do alimento (HARTMANN; WILKE; ERDMANN, 2011; BALCIUNAS et al., 2013).
Os resultados obtidos demonstram que a substância antimicrobiana presente no SLC do isolado LC254 apresenta potencial bacteriostático por até 3h o que pode ser considerado um aspecto positivo no controle de L.
monocytogenes, considerando a possibilidade de aplicação em alimentos.
5.5.7 Toxicidade da substância antimicrobiana produzida por L. curvatus