Programa de Pós-Graduação em Ciências em Saúde
EFEITO HIPOGLICEMIANTE E
IMUNOMODULADOR DA BOTRIOSFERANA EM
RATOS OBESOS COM TUMOR DE WALKER-256
PATRÍCIA KARINA COMIRAN
Sinop, Mato Grosso
Fevereiro, 2019
PATRÍCIA KARINA COMIRAN
EFEITO HIPOGLICEMIANTE E
IMUNOMODULADOR DA BOTRIOSFERANA EM
RATOS OBESOS COM TUMOR DE WALKER-256
Orientadora: Prof ª. Drª. Eveline Aparecida Isquerdo Fonseca de
Queiroz
Co-orientadora: Profª. Drª. Pamela Alegranci
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências em Saúde da
Universidade Federal de Mato Grosso,
Campus Universitário de Sinop, como
requisito para obtenção do título de Mestre
em Ciências em Saúde.
Sinop, Mato Grosso
Fevereiro, 2019
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter direcionado meu caminho em busca do conhecimento. À minha família pelo incentivo e tolerância à minha ausência.
À Universidade Federal de Mato Grosso, na qual em 2001 iniciei minha formação acadêmica e por agora findando minha terceira pós-graduação nesta mesma instituição, e como discente, tenho orgulho de fazer parte dela.
À minha orientadora, professora Eveline Queiroz que me recebeu com muito carinho, simpatia, atenção e positividade. Compartilhou seus conhecimentos e me impulsionou para o crescimento e desenvolvimento.
À minha co-orientadora, professora Pâmela Alegranci por me acolher, acompanhar com disposição para me ensinar com serenidade, carinho e pensamentos positivos.
Aos meus amigos do grupo de pesquisa, Mariana, John, Kamila, Izabela, Ana Emília, Amadeu, Túlio, que também me receberam de coração aberto, me ensinando e ajudando desde o princípio do nosso experimento.
Aos técnicos do laboratório, Morena, Cleberson e Larissa, pela atenção e contribuição neste processo.
Aos docentes que compõem o quadro do curso de mestrado em Ciências em Saúde. Aos meus amigos e colegas pelas palavras de estímulo e companheirismo.
À Universidade Federal de Mato Grosso – Campus Sinop pela estrutura no desenvolvimento da pesquisa.
RESUMO
Câncer é uma doença caracterizada pelo crescimento descontrolado de células que podem invadir outros tecidos causando metástase. Estudos tem demonstrado que a obesidade contribui para o desenvolvimento de diversos tipos de câncer, como o câncer de mama, sendo os mecanismos associados a esse efeito a resistência à insulina, hiperinsulinemia, inflamação crônica de baixo grau, e estresse oxidativo, frequentemente presentes na obesidade. Beta-glucanas fúngicas do tipo β-(1→3) são conhecidas por exibir efeitos antitumorais diretos, e podem diminuir indiretamente a proliferação tumoral por meio de respostas imunomoduladoras. Botriosferana, uma β-(1→3)(1→6)-D-glucana, produzida pelo fungo Botryosphaeria rhodina MAMB-05 tem demonstrado apresentar atividades antimutagênica, hipoglicemiante, hipocolesterolêmica, antiproliferativa e pró-apoptótica. No entanto, seus efeitos sobre o desenvolvimento tumoral não estão bem esclarecidos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da botriosferana sobre o desenvolvimento do tumor de Walker-256 em ratos obesos e não obesos, assim como analisar o perfil metabólico, hematológico e imunológico destes animais. Desta forma, ratos Wistar machos, com aproximadamente 30 dias de idade, foram divididos em dois grupos, controle e obesos. Ratos obesos receberam ração rica em gorduras (24,5% de gordura) e água com sacarose (300g/L) por 8 semanas. O grupo controle recebeu ração padrão (4% de gordura) e água sem sacarose. Na oitava semana, células de Tumor de Walker-256 foram inoculadas subcutaneamente no flanco superior direito dos ratos e concomitantemente foi iniciado o tratamento com botriosferana (12 mg/kg/dia, por 15 dias, via gavagem). Então, os ratos foram subdivididos em quatro grupos: controle tumor (CT); controle tumor botriosferana (CTB); obeso tumor (OT) e obeso tumor botriosferana (OTB). No final da 10ª semana, o efeito da botriosferana e o desenvolvimento tumoral foram avaliados. Foram analisados a presença da obesidade, consumo alimentar, perfil lipídico, glicídico e o hemograma. Também foram avaliados, peso do tumor, porcentagem dos ratos que desenvolveram tumor e presença de caquexia, bem como a expressão das proteínas Bax, Bcl-2, caspase-3, p27, AMPK e FOXO3a, determinada pela técnica de Western Blotting. O desenvolvimento tumoral foi significativamente maior nos ratos OT quando comparado com o grupo CT, e a botriosferana não alterou este parâmetro. Os animais OT apresentaram acúmulo de tecido adiposo visceral, redução da massa magra, resistência à insulina, intolerância à glicose, hiperglicemia, dislipidemia, anemia, leucocitose e trombocitopenia. Ainda, a botriosferana corrigiu a resistência à insulina, hiperglicemia, e os níveis de colesterol, e aumentou a contagem de leucócitos totais e linfócitos nos ratos obesos. A botriosferana melhorou a tolerância a glicose no grupo CTB. Os ratos CT e CTB apresentaram granulocitose e monocitose, sugerindo uma ativação do sistema imunológico inato. Os ratos OT e OTB apresentaram granulocitose, linfocitose e monocitose, sugerindo uma ativação imune adaptativa. Não foi observada diferença significativa na expressão proteica das proteínas Bax, Bcl-2, caspase-3, p27, AMPK e FOXO3a. Para concluir, nossos dados sugerem que a botriosferana na dose de 12 mg/kg não alterou o desenvolvimento tumoral nos animais, mas melhorou o perfil metabólico e imunológico dos animais obesos com tumor.
ABSTRACT
Cancer is a multifactorial disease characterized by an uncontrolled growth of cells that can invade other tissues causing metastasis. Studies have demonstrated that obesity increases the development of several types of cancer, like breast cancer, and that it is associated with insulin resistance, hyperinsulinemia, chronic low grade inflammation and oxidative stress, frequently present in obesity. Fungal β-D-glucans of the (1→3)-type are known to exhibit direct antitumor effects, and can also indirectly decrease tumor proliferation through immunomodulatory responses. Botryosphaeran, a β-(1→3)(1→6)-D-glucan, produced by the fungus Botryosphaeria rhodina MAMB-05 have been demonstrated to present antimutagenic, hypoglycaemic, hypocholesterolaemic, antiproliferative and pro-apoptotic activities. However, its effects on tumor development are not well understood. Thus, the objective of the present study was to evaluate the effects of botryosphaeran on Walker-256 tumor development in obese and non-obese rats, as well as analyze the metabolic, hematologic and immunologic profile of these animals with tumor. This way, male Wistar rats (~30 days) were divided randomly in two groups, control and obese. Obese rats received high-fat diet (24.5% of fat) and water with sucrose (300g/L) for 8 weeks. Control received standard diet (4% of fat) and water without sucrose. On 8th week, 1x107 Walker-256 tumor cells were subcutaneously injected in the right flank of the rats and concomitantly the treatment with botryosphaeran (12 mg/kg/15 days, by gavage) started. Thus, the rats were subdivided in four groups: control tumor (CT), control tumor botryosphaeran (CTB), obese tumor (OT) and obese tumor botryosphaeran (OTB). On 10th week, the tumor development and botryosphaeran effect were analyzed. Obesity was characterized; feed intake, glucose and lipid profiles, and hemogram were analyzed. Tumor weight, percentage of rats that developed tumor and that presented cachexia were evaluated, and protein expression of Bax, Bcl2, caspase-3, p27, AMPK and FOXO3a was determined by Western blotting. Tumor development was higher in OT rats compared to CT rats, and botryosphaeran not altered this development. OT rats presented accumulation of visceral adipose tissue, reduced muscle, glucose intolerance, insulin resistance and hyperglycemia, dyslipidemia, anemia, leukocytosis and thrombocytopenia. Botryosphaeran corrected the insulin resistance, hyperglycaemia and cholesterol levels, and increased the total leukocyte and lymphocyte counts in obese rats. Furthermore, botryosphaeran improved the glucose tolerance of CTB. CT and CTB rats presented granulocytosis and monocytosis, suggesting an immediate immune response. OT and OTB rats presented granulocytosis, lymphocytosis and monocytosis, suggesting an
adaptive immune response. No difference was observed in Bax, Bcl-2, caspase-3, p27, AMPK and FOXO3a protein expression. In conclusion, our data allows us to suggest that botryosphaeran in the dose of the 12 mg/Kg. b.w., did not alter the tumor development, but improved the metabolic profile and the immune response of obese rats with tumor.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estágios da carcinigênese.. ... 12
Figura 2. Via intrínsica da apoptose. ... 17
Figura 3. Fatores que influenciam o desenvolvimento tumoral. ... 19
Figura 4. Estrutura da Beta - Glucana. . ... 19
LISTA DE TABELA
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 11
1.1 CÂNCER ... 11
1.2 OBESIDADE RESISTÊNCIA À INSULINA E CÂNCER ... 13
1.3 Β-GLUCANAS, BOTRIOSFERANA E CÂNCER ... 19
2 MATERIAL E MÉTODOS ... 22
2.1 MODELO ANIMAL ... 22
2.2 INDUÇÃO DA OBESIDADE ... 22
2.3 INOCULAÇÃO DO TUMOR DE WALKER-256 E TRATAMENTO COM BOTRIOSFERANA ... 23
2.4 CARACTERIZAÇÃO DA OBESIDADE E DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS BIOLÓGICOS ... 25
2.5 ANÁLISE DO CONSUMO DIÁRIO DE RAÇÃO E DE ÁGUA ... 26
2.6 ÍNDICE DE CAQUEXIA ... 27
2.7 TESTE DE TOLERÂNCIA À INSULINA INTRAPERITONEAL (IPITT) ... 27
2.8 TESTE DE TOLERÂCIA À GLICOSE ORAL (OGTT) ... 27
2.9 ANÁLISE DA VIABILIDADE DOS MACRÓFAGOS E DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO•) PELOS MACRÓFAGOS ... 28
2.10WESTERN BLOTTING... 29
2.11ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 30
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 31
1 INTRODUÇÃO
1.1 CÂNCER
A Organização Mundial de Saúde elenca o câncer como a segunda causa de morbidade no mundo e a estimativa para o ano de 2018 era de cerca de 9,6 milhões de mortes. No mundo a cada seis pessoas que vão à óbito, uma delas é em decorrência de câncer. Dentre os fatores de riscos, o tabagismo se destaca como responsável por 22% das mortes ocasionadas pelo câncer. O consumo de álcool, inatividade física, índice de massa corporal elevado, e baixo consumo de frutas, verduras e legumes também contribuem para o avanço da doença (WHO, 2018a).
De acordo com dados do Instituto Nacional de Câncer (INCA), para o biênio 2016-1017 no Brasil, surgiram 600 mil novos casos de câncer. Sendo que para o sexo masculino, o câncer de maior frequência foi o câncer de próstata (28,6%), na sequência, pulmão com 8,1% e intestino com 7,8%. Já no sexo feminino, o câncer de mama se destacou com 28,1%, intestino 8,6% e colo de útero 7,9% (BRASIL, 2015b).
Câncer é um distúrbio celular, a partir de uma célula normal, que resulta no crescimento e desenvolvimento desordenado de uma massa tecidual anormal (maligno) que possui potencial invasivo, não respeitando os limites teciduais, mesmo que o fator desencadeante desta alteração tenha cessado (MONTENEGRO; FRANCO, 2008; PORTH; MATFIN, 2010). As células, em circunstâncias normais, estão em um ciclo constante e permanente de proliferação, diferenciação e descamação, sob a ação de mecanismos regulatórios que mantém o equilíbrio entre a formação e a descamação, permitindo a manutenção da homeostase. Quando ocorre interrupção e/ou alteração destes mecanismos regulatórios, as células podem adquirir capacidade autônoma e acentuada de divisão, alteração na sua diferenciação e podem apresentar função e morfologia diferentes da célula - mãe (MONTENEGRO; FRANCO, 2008). O termo neoplasia (tumor) é denominado de “novo crescimento” e pode ser classificada como neoplasia benigna (tumor benigno) ou neoplasia maligna (tumor maligno ou câncer) (KUMAR et al., 2010).
Assim, o aglomerado de células bem diferenciadas, de crescimento lento que formam uma massa mais ou menos volumosa, sendo bem tolerada pelo organismo do hospedeiro, tem a característica de ser benigna (neoplasia benigna), não levando à morte do indivíduo, a menos que sua localização ou tamanho interfira nas funções vitais. Já a neoplasia maligna tem
por características o crescimento celular desordenado, rápido e invasivo, com capacidade de produzir metástase em tecidos e órgãos, perdurar ao tratamento e levar a óbito (PORTH; MATFIN, 2010; BRASIL, 2011).
Nas fases do processo de desenvolvimento tumoral, a iniciação corresponde ao primeiro estágio da carcinogênese, no qual ocorre a alteração irreversível e permanente do DNA pelo agente agressor à célula, fazendo com que a mesma apresente um genoma alterado e um fenótipo normal. Na promoção celular, após a célula precursora sofrer lesão genética e permanecer sobre ação de agentes carcinógenos e/ou agentes promotores, ocorre a proliferação das células mutadas, produzindo alteração fenotípica. Na terceira fase, compreendida por progressão, há expressão fenotípica da neoplasia maligna em nível histológico, com elevada taxa de proliferação celular, invasão e metástase (Figura 1) (MONTENEGRO; FRANCO, 2008; KUMAR et al., 2010).
Figura 1. Estágios da carcinigênese. Fonte: (BRASIL, 2011).
Com o crescimento e/ou metástase do tumor, iniciam-se as manifestações clínicas, último estágio da neoplasia maligna, na qual podem ser observadas alterações de vias metabólicas, presença de citocinas e outros mediadores que contribuem para as manifestações sistêmicas como caquexia, anorexia, anemia, alterações no sono, dor, alterações psicológicas, dentre outras (PORTH; MATFIN, 2010). A anorexia associada ao câncer pode estar relacionada com as alterações fisiológicas e respostas secundárias à administração de drogas durante o tratamento (EZEOKE; MORLEY, 2015).
O elevado gasto energético, bem como a elevada captação pelo tumor de substratos, como a glicose, com consumo aumentado entre 10 a 50 vezes, a depleção de tecido muscular para fornecimento de aminoácidos para a gliconeogênese, aumento da lipólise, diminuição da lipogênese, bem como a liberação de fatores tumorais lipolíticos, aumento da liberação de citocinas que estimulam a produção de leptina induzindo a saciedade precoce, caracterizam o
estado de catabolismo persistente, desencadeando a perda de peso, uma das manifestações iniciais da caquexia (SILVA, 2006; PORTH; MATFIN, 2010; ROSS et al., 2016).
Assim, a perda de peso, de tecido muscular e diminuição da gordura corporal, associadas à fraqueza extrema, à anemia e à anorexia é chamada de Síndrome da anorexia-caquexia do câncer. A redução da ingesta alimentar e a alteração do paladar, como consequência dos tratamentos radiológico e quimioterápico, não explica a perda acentuada de peso. Na inanição por falta de alimento, ocorre perda de peso a partir das reservas de gordura, já na caquexia ocorre perda de peso tanto das reservas de gordura quanto do tecido muscular esquelético e depleção de proteínas viscerais (PORTH; MATFIN, 2010). A atrofia muscular comumente relacionada ao câncer é um dos sintomas da fase avançada do desenvolvimento tumoral (MYTELKA; LI; BENOIT, 2017).
Na Síndrome da anorexia-caquexia do câncer, fatores circulantes, produzidos pelo tumor ou pelo sistema imunológico em resposta ao tumor, como citocinas pró-inflamatórias, dentre elas a interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interferon (IFN-alfa e IFN-gama), parecem estar envolvidos na patogênese da anorexia-caquexia (MANTOVANI et al., 2004).
Ainda, o câncer é uma doença multifatorial, que sofre influência de fatores hereditários, hormonais, imunológicos e agentes externos como, radiação, vírus e substâncias químicas. Outros fatores que tem despertado grande interesse na etiologia do câncer são a obesidade e a resistência à insulina (HURSTING; HURSTING, 2007: MONTENEGRO; FRANCO, 2008; OSORIO-COSTA et al., 2009;VENNIYOOR, 2017).
1.2 OBESIDADE, RESISTÊNCIA À INSULINA E CÂNCER
A obesidade é caracterizada como um grave problema de saúde pública. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO, 2018b), no ano de 2016, mais de 1,9 bilhões de adultos estavam com sobrepeso e dentre esses 650 milhões estavam com obesidade. Esses índices se expandem também para a faixa etária de menores de 5 anos, atingindo 41 milhões de crianças com sobrepeso e obesidade.
A obesidade é uma condição fisiopatológica crônica de origem multifatorial, que sofre influência de fatores nutricionais, aspectos genéticos, metabólicos, psicossociais, culturais, dentre outros, atuando em sua origem e manutenção (CUPPARI, 2014).
A obesidade é marcada por hiperplasia e hipertrofia de células adiposas e a localização desta gordura corporal irá caracterizar o tipo de obesidade. O acúmulo de tecido adiposo
visceral (obesidade andróide) demonstra ser fator de risco para morbidade e mortalidade em decorrência deste tipo de gordura ser mais sensível às catecolaminas e menos sensível à insulina, quando comparada à obesidade ginóide que apresenta maior distribuição de gordura subcutânea ou periférica (WAITZBERG, 2000; MCPHEE; GANONG, 2007), bem como por ser um tecido adiposo mais ativo e liberar maior quantidade de mediadores químicos, como a leptina, a resistina, o TNF-alfa, a IL-6, a IL-1, dentre outros.
Para diagnóstico e avaliação da obesidade e riscos associados em adultos, a Organização Mundial de Saúde dispõe de valores de referência para a classificação do estado nutricional utilizando medidas antropométricas, tais como a relação peso/altura2, pregas cutâneas, circunferência da cintura e relação cintura/quadril. De acordo com o IMC, a circunferência da cintura e a relação cintura-quadril, os riscos de comorbidades aumentam de forma proporcional à elevação dos mesmos, sinalizando complicações metabólicas associadas à obesidade (WAITZBERG, 2000; CUPPARI, 2014).
Diante da complexidade deste agravo, estudos experimentais, relacionados à genética da obesidade, também sugerem defeito em alguns genes como causa da obesidade, outros, consideram a inter-relação com fatores ambientais, enfatizando ingestão predominante de lipídios e carboidratos, como fator de maior relevância para o surgimento das comorbidades associadas à obesidade (PEREIRA; FRANCISCHI; LANCHA, 2003).
A ocorrência de complicações associadas à obesidade, como doenças cardiovasculares, apnéia do sono, dislipidemias, diabetes mellitus, refluxo e diversos tipos de câncer, aumentam progressivamente de acordo com o ganho de peso e acúmulo de tecido adiposo corporal (WAITZBERG, 2000).
O tecido adiposo é dividido em três tipos: tecido adiposo branco (TAB), tecido adiposo marrom (TAM) e tecido adiposo bege. O TAB desempenha a função de armazenar energia na forma de triacilglicerol e subdividi-se em tecido visceral e tecido subcutâneo, e o TAM tem por função produzir calor devido a presença da proteína desacopladora-1 (UCP-1) com elevada atividade termogênica (FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 2011). O tecido adiposo bege também chamado de “browning”, deriva do tecido adiposo branco mediado pela proteína UCP-1 e tem por característica contribuir para a lipólise e produção de calor (HU et., 2018).
O tecido adiposo também atua como um tecido endócrino, envolvido na regulação da energia corporal, e gerando uma rede de sinais autócrinos, parácrinos e endócrinos, produzindo sinais químicos por meio da liberação de fatores como o fator de necrose tumoral-α (TNF-tumoral-α), interleucina-6 (IL-6), leptina, fator de crescimento semelhante à insulina-1
(IGF-1), fator de crescimento de transformação-β (TGF-β), angiotensinogênio, resistina e adiponectina (DOUGLAS, 2011; TILG; MOSCHEN, 2006).
Na obesidade ocorre aumento de ácidos graxos livres na circulação devido à lipólise, aumento das concentrações de IL-6 e TNF-α, que são antagônicos à insulina, somados à produção de resistina, leptina e menor concentração de adiponectina, levando ao desenvolvimento de resistência à insulina, que é caracterizada como a resposta diminuída dos tecidos periféricos (fígado, músculo e tecido adiposo) à insulina (ASCASO et al., 2003; CALLE; KAAKS, 2004; CAMPOS et al., 2006).
A insulina é um importante hormônio hipoglicemiante, sintetizada pelas células β pancreáticas, presentes nas ilhotas de Langerhans, sendo o principal estímulo para a sua produção o aumento da concentração de glicose circulante. A insulina promove alterações no metabolismo dos carboidratos, proteínas e lipídeos, atuando de forma anabólica levando à síntese e acúmulo de metabólitos como glicogênio e triacilglicerol (CURI, PROCÓPIO, 2009). Também estimula a síntese de proteínas e a proliferação celular, dentre outras atividades biológicas.
A ação da insulina inicia-se no receptor de insulina (IR), uma proteína heterotetramérica presente na membrana plasmática das células e composta de duas subunidades α extracelulares e duas subunidades β, que possui atividade tirosina quinase. A ligação da molécula de insulina à subunidade α produz autofosforilação da subunidade β, que adquire atividade quinase e fosforila a tirosina de substratos protéicos, chamados de substratos dos receptores de insulina (IRS). A ligação dessas proteínas aos receptores de insulina proporciona ativação de outras vias de sinalização desencadeando diversas ações deste hormônio (CURI; PROCÓPIO, 2009).
Nas últimas décadas a relação entre sobrepeso e obesidade com o desenvolvimento de neoplasias tem sido alvo de estudos epidemiológicos e experimentais, sugerindo a estreita relação do aumento do índice de massa corporal com alguns tipos de câncer, como útero, cólon, mama, ovário, colorretal, rim, pâncreas, fígado e próstata (FRANCISCHI et al., 2000; CALLE; KAAKS, 2004; FONSECA et al., 2011; HURSTING et al., 2012; ARNOLD et al., 2015; QUEIROZ et al., 2015; VENNIYOOR, 2017).
A relação da obesidade na carcinogênese pode ocorrer devido ao estado de hiperinsulinemia, resultante da resistência dos tecidos à ação da insulina, bem como devido à liberação pelo tecido adiposo de citocinas, metabólitos e hormônios sexuais, como o estrogênio que atua de forma crucial promovendo a proliferação celular e progressão do
câncer (HURSTING; HURSTING, 2012; CHENG et al., 2018; PETERSEN; SHULMAN, 2018.
A atuação da insulina sobre o desenvolvimento e proliferação das células tumorais parece ter ligação direta com seus receptores localizados nas células cancerígenas e também por alterações hormonais (AVGERINOS et al., 2018). Na obesidade, a hiperinsulinemia contribui para a maior quantidade de IGF-1 livre circulante, devido a uma diminuição da expressão de IGFBPs (proteínas ligadoras ao IGF) (CALLE; KAAKS, 2004). Assim, o fígado após estímulos hormonais produz IGF-1 que regula o crescimento e o desenvolvimento de muitos tecidos, ainda, sabe-se que níveis sanguíneos aumentados de IGF-1 configura fator de risco para o desenvolvimento de diversos tipos de câncer (HURSTING; HURSTING, 2012; FUKUMURA et al., 2016).
Ainda, o estado de hiperinsulinemia pode estimular o desenvolvimento tumoral por meio do bloqueio/inibição de alguns fatores de transcrição, como os fatores de transcrição FOXO (Forkhead trancription fator), os quais são reguladores do balanço energético, suprimem o desenvolvimento tumoral, promovem apoptose, autofagia, prolongando assim a expectativa de vida (BLUHER; KAHN; KAHN, 2003; HOLZENBERGER et al., 2003; HU et al., 2004; CALNAN; BRUNET, 2008; ROPELLE et al., 2007; NHO; HERGERT, 2014)
Fatores de transcrição – FOX, da classe O, dentre eles o FOXO3a, tem sido alvo de estudos, que sugerem ação de manter a homeostasia celular e inibir a progressão das células neoplásicas. Sua regulação se dá através da ação de vários fatores, como insulina, IGF-I, nutrientes, citocinas e estresse oxidativo, que levam a reações de fosforilação, acetilação e/ou ubiquitinação dos fatores FOXO e consequentemente controlam os seus níveis protéicos, sua localização subcelular, ligação ao DNA e sua atividade transcricional, ativando ou inibindo a sua ação (CALNAN; BRUNET, 2008; NHO; HERGERT, 2014).
Expressa no tecido de mamíferos, a AMPK (Proteína kinase ativada pelo AMP) tem como conformação, um complexo heterotrimérico com subunidade catalítica - α e subunidades regulatórias β e γ, ativada pela fosforilação do resíduo de Treonina 172 (Trh 172) e por regulação alostérica por meio do aumento celular de adenosina monofosfato, bem como estresse metabólico, medicamentos e xenobióticos (HARDIE; ROSS; HAWLEY, 2017; MORITA et al., 2018). Conforme alguns estudos, promove ativação do FOXO3a e efeitos pró-apoptóticos em células de câncer de mama, contribuindo para um menor desenvolvimento tumoral (CHIACCHIERA et al., 2009; QUEIROZ et al., 2014a; QUEIROZ et al., 2015b). Ainda, Xu e colaboradores (2018) sugerem que a ativação da AMPK melhora a autofagia de
células cardíacas de ratos diabéticos pela inibição da via da proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) que regula negativamente a autofagia.
Após uma célula sofrer uma alteração gênica/mutação gênica, essa célula pode ser reparada, por meio dos mecanismos de reparo do DNA ou pode ser levada à apoptose (morte celular programada). Na apoptose, ocorre a ativação de proteínas pró-apoptóticas como a Bax e a caspase-3 e/ou inibição de proteínas anti-apoptóticas, como a Bcl-2. Desta forma, assim que as células sofrem algum insulto, como lesão no DNA, ocorre emissão de sinais que são antagonistas às proteínas da família Bcl-2, proteínas anti-apoptóticas, como a Bcl-xL, Bcl-w, A1 e Mcl1, e estímulo às proteínas pró-apoptóticas, como a Bax e a BH3, contribuindo para o extravasamento de proteínas mitocôndriais, como citocromo c e fator indutor de apoptose (AIF), ao citoplasma por canais formados por proteínas como a Bax e Bak, ativando a cascata de caspases que vão levar à apoptose (KUMAR et al., 2010; MARIA et al., 2013; GREEN; LLAMBI, 2015).
Figura 2. Via intrínsica da apoptose.Adaptado de Green; Llambi (2015); Kumar et al. (2010).
Outro mecanismo presente no tecido adiposo obeso em expansão é a hipóxia, devido à hiperplasia e hipertrofia do tecido adiposo proporcionando diminuição da vascularização deste tecido. Assim, com o intuito de aumentar o fluxo sanguíneo e proporcionar melhora na oxigenação tecidual, ocorre liberação de fatores pró - angiogênicos, como o fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) e citocinas inflamatórias (RAMALHO; GUIMARÃES, 2008).
Sob a influência de quimiocinas, monócitos são recrutados e infiltram no tecido adiposo iniciando reações que desencadeiam o processo inflamatório crônico de baixo grau, característico da obesidade, com aumento da vascularização, permeabilidade vascular, presença de células imunes, adipocinas e citocinas, tais como TNF- α, IL-6, IL-1β, fator transformador de crescimento β (TGF-β1) e proteína C- reativa (PCR) (WEISBERG et al., 2003; CANCELLO et al., 2005; GUZIK et al., 2017). Ainda, a expressão aumentada de TNF-α pelos adipócitos estimula os pré - adipócitos e células endoteliais a secretarem proteína quimioatrativa de macrófagos (MCP-1) atraindo mais macrófagos para o tecido adiposo (ROP et al., 2009).
O recrutamento de células do sistema imunológico também parece estar relacionado ao desenvolvimento de metástase e angiogênese tumoral, uma vez que macrófagos associados ao tumor (TAM) compõem grande parte da massa tumoral (MURDOCH; GIANNOUDIS; LEWIS, 2004; NEVES, 2015). A ativação de monócito/macrófagos provém da ação de quimiocinas (MCP-1), citocinas, VEGF, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator estimulante de colônias (CSF-1), liberados pelo tumor alterando o microambiente tumoral, ou liberados por outros tecidos, como o tecido adiposo (CHANMEE et al., 2014).
Ainda, nível sanguíneo elevado de leptina, outra importante adipocina liberada pelo tecido adiposo, está associada à proliferação, sobrevivência e diferenciação das células neoplásicas, contribuindo para o desenvolvimento do tumor (FORTE et al., 2012; HURSTING; HURSTING, 2012; FUKUMURA et al., 2016). Participa da modulação da hematopoiese e respostas imunes, por meio da mediação de receptores transmembranas e ativação de proteínas como MAPK - quinases ativadas por mitógenos e via de sinalização Janus Kinase/ Transdutores de sinal e ativadores de transcrição JAK/STAT (MAURO et al., 2007). Em indivíduos obesos os níveis de leptina estão aumentados, sugerindo associação da obesidade com resistência à leptina (ROP et al., 2009).
Assim, como descrito nesta sessão, podemos observar que a obesidade contribui positivamente para o desenvolvimento tumoral, por meio de vários fatores presentes na obesidade, como a inflamação crônica de baixo grau, a resistência à insulina, a hiperinsulinemia compensatória e o estresse oxidativo (Figura 3).
Figura 3. Fatores que influenciam o desenvolvimento tumoral.
1.3 Β-GLUCANAS, BOTRIOSFERANA E CÂNCER
As β-glucanas são biopolímeros de glicose, presentes na parede celular de fungos, bactérias, algas e alguns cereais como aveia e cevada, também podem ser obtidos de forma extracelular em meio de cultura, secretados por certas bactérias e fungos, e nesses casos são denominados exopolissacarídeos (CUNHA et al., 2012; KAGIMURA et al., 2015; QUEIROZ et al., 2015b; KERCHE-SILVA et al., 2017).
Figura 4. Estrutura de Beta - Glucana. Fonte: Chen; Senviour (2007).
Dentre as propriedades biológicas atribuídas às β-glucanas, pode-se citar efeitos imunomoduladores, atividade antiproliferativa em células neoplásicas, ação hipocolesterolêmica, redução dos riscos de doenças cardiovasculares e infecções microbianas, bem como atuam como prebióticos (YANG et al., 2006; CUNHA et al., 2012; LIN, 2011; KAGIMURA et al., 2015; RAA, 2015; MALINI et al., 2016).
Os efeitos imunomoduladores das β-glucanas estão relacionados com a modulação do sistema complemento e estimulação de macrófagos, que interagem com linfócitos T modulando a resposta imune adaptativa (ROUDBARY et al., 2015). Com a ativação de macrófagos ocorre a expressão da isoenzima óxido nítrico sintase induzida (ONSi) que sintetiza óxido nítrico (NO•). Este, quando liberado em concentrações fisiológicas desempenha função antibacteriana, antiparasitária, antiviral e antitumoral. Ao passo que quando ocorre descontrole na síntese de NO pode ocasionar dano tecidual, atividade pró-tumoral, pró-inflamatória, estímulo a doenças cardiovasculares, degenerativas e genotoxicidade (COSTA et al., 2003).
Estudos relatam que a ativação de células imunes por β-glucanas ocorre por meio da ligação da β-glucana aos receptores Dectin-1 e receptores Toll-like (TLRs) e que a atividade antitumoral seria mediada por macrófagos e células dendríticas (BATBAYAR; LEE; KIM, 2012). Experimentos demonstram que β-glucanas alteram a conformação de macrófagos e induzem a produção de citocinas como o TNF-α, a IL-6 e a IL-1, estimula a produção de NO, hidrogênio, enzimas lisossomais e proteínas da via alternativa do sistema complemento (CHOI et al., 2016). Além do que, beta-glucanas podem ativar linfócitos B que atraem outras células do sistema imune, como neutrófilos, atuando em tecidos que apresentam processo inflamatório através de fagocitose (MOHAMED et al., 2015).
A botriosferana, um expolissacarídeo produzido em meio aquoso pelo fungo ascomiceto, Botryosphaeria rhodina, isolado do cancro do eucalipto e foi caracterizado como uma β-(13;16)-D-glucana, com 22% de ramificações as quais são constituídas por resíduos de glicose e gentiobiose (BARBOSA et al., 1995; BARBOSA et al., 2003). Possui conformação em tripla hélice (GIESE, 2008), que contribui para as atividades biológicas apresentadas pelas β-(1-3;1-6)-D-glucanas (BOHN; BEMILLER, 1995; LEUNG et al., 2006; CHEN; SERVIOUR, 2007; NOVAK; VETVICKA, 2008).
Estudos tem demonstrado que a botriosferana apresenta ação não mutagênica, anti-clastogênica, hipoglicêmica, hipocolesterolêmica e ação anti-coagulante e anti-trombótica quando sulfatada (MIRANDA et al. 2008; MIRANDA-NANTES et al., 2011; QUEIROZ et al., 2015b; MALINI et al., 2016; KERCHE-SILVA et al., 2017; SILVA-SENA et al., 2018a). Ainda, Queiroz et al. (2014a) demonstrou que a botriosferana teve efeito antiproliferativo e pró-apoptótico direto relacionado à ativação da AMPK e do FOXO3a, em células de câncer de mama (MCF-7) in vitro.
Ainda, recentemente, em nosso grupo de pesquisa foi demonstrado que o tratamento com botriosferana durante 15 dias em ratos obesos induzidos por dieta rica em lipídeos e
carboidratos (e sem a presença do tumor) reduziu significativamente o consumo de ração, o peso corporal final, o ganho de peso, gordura periepididimal, e melhorou significativamente a resistência à insulina, a tolerância à glicose, bem como corrigiu a dislipidemia e reduziu a esteatose hepática presentes nos animais obesos sem tumor (SILVA et al., 2018). No entanto, os seus efeitos e o seu mecanismo de ação ainda não estão completamente elucidados, e não foram encontrados trabalhos publicados que demonstrassem os efeitos da botriosferana sobre esta condição de obesidade e câncer.
Assim, com base no exposto acima, acredita-se que a obesidade induzida por uma dieta rica em lipídeos e carboidratos contribua significativamente para um maior desenvolvimento do tumor de Walker-256 e que isso seja decorrente da resistência à insulina, intolerância à glicose, hiperglicemia e dislipidemia presententes nessa condição de obesidade. Ainda, acredita-se que a botriosferana contribuirá para um menor desenvolvimento tumoral, corringindo os parâmetros metabólicos dos animais, estimulando o sistema imunológico e ativando as proteínas AMPK e FOXO3a no tecido tumoral.
Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade biológica da botriosferana sobre o desenvolvimento tumoral em animais obesos e não obesos, bem como avaliar o perfil glicídico, lipídico, perfil hematológico e imunológico dos animais, e a expressão proteica de Bax, Bcl-2, Caspase-3, p27, AMPK e FOXO3a no tecido tumoral.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 MODELO ANIMAL
No presente estudo foram utilizados ratos Wistar machos, com 30 dias de idade, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para uso animal e experimental da UFMT (Protocolo nº 23108.722108/2017-19). Os ratos foram alojados coletivamente durante todo o período experimental em caixas de polipropileno (4 animais por caixa), em ambiente com temperatura controlada de 22 ± 2º C e ciclo claro-escuro de 12h, com livre acesso à água e alimento.
Os animais foram divididos em dois grupos da 1ª à 8ª semana, grupo Controle (C) e grupo Obeso (O). Na 8ª semana foram subdivididos em quatro grupos experimentais com 12 animais cada grupo: I) Controle com tumor (CT); II) Controle com tumor tratado com botriosferana (CTB); III) Obeso com tumor (OT) e IV) Obeso com tumor tratado com botriosferana (OTB) (Figura 5). Todos os grupos foram submetidos ao protocolo experimental de 10 semanas.
2.2 INDUÇÃO DA OBESIDADE
Durante as 10 semanas de experimento os animais do grupo controle foram alimentados com ração padrão para roedores (NUVILAB CR-1, Nuvital®, Colombo, Paraná, Brasil) e água sem sacarose. Os animais induzidos à obesidade receberam ração hiperlipídica (Tabela 1) e
água com sacarose (300g/litro). O modelo dietético foi adaptado de Luvizzotto et al. (2013) e Nascimento et al. (2008).
No final da 10ª semana foi avaliada a presença da obesidade.
Tabela 1. Composição das rações.
Componentes Ração Padrão (%) Ração
Hiperlipídica (%) Carboidratos 65.5 45.2 Proteínas (Caseína >99%) 22 20.9 Lipídeos 4 24.5 Fibras 4 4 Mistura de Vitaminas* 1 1 Mistura de Minerais* 3.5 3.5 Total (%) 100 100
Valor Calórico (Kcal ) 3.800 4.849
*Conteúdo suplementado de vitaminas e minerais a cada 1000g de ração hipercalórica: Ferro: 25,2 mg; Potássio: 104,8 µg g; Selênio: 73,1 µg; Sulfato de molibdênio: 150,0 µg; Vitamina B12: 34,5 µg; Vitamina B6: 6 µg; Biotina: 0,12 µg; Vitamina E: 48,9 UI; Vitamina D: 2447,0 UI; e Vitamina A: 15291,2 UI.
2.3 INOCULAÇÃO DO TUMOR DE WALKER-256 E TRATAMENTO COM BOTRIOSFERANA
O primeiro ensaio utilizando o Tumor de Walker-256 foi registrado no início do século IX, por George Walker. Algumas décadas após, Agostino e Cliffton (1968), transplantaram o tumor da forma sólida para a ascítica na cavidade peritoneal de ratos Wistar, e demonstraram que células de tumor ascítico poderiam ser inoculadas na cavidade abdominal de outros animais produzindo tumor ascítico, e quando injetadas em órgãos e tecidos produziam tumores sólidos. Este modelo experimental, desde então, é muito utilizado por ser específica para ratos, de fácil manuseio no transplante e por apresentar crescimento rápido e letal, associado a distúrbios homeostáticos e à caquexia do câncer (GUIMARÃES et al., 2010; FONSECA et al., 2011; LOUSAN; TOLEDO, 2012).
Para a manutenção do Tumor de Walker - 256 foi inoculado suspensão de 2 x 106 células viáveis de Tumor de Walker-256 intraperitonialmente em um animal. Após o desenvolvimento do tumor ascítico, este animal foi anestesiado com solução de Cetamina e Xilasina (0,15 mL/ 100 g de peso) e eutanasiado. Na sequência, após incisão abdominal e com
auxílio de pipeta, o líquido ascítico foi removido e adicionado em um tubo falcon com 5 mL de solução de EDTA a 5%.
Para contagem do número de células tumorais foi utilizada câmara de Neubauer com o auxílio do método de exclusão pelo azul de trypan. Foi realizada a contagem no quadrante central da mesma câmara e em seguida 2 x 106 células foram inoculadas na cavidade abdominal de dois ratos Wistar, utilizados apenas para manutenção de células tumorais. Esse mesmo protocolo foi realizado três vezes, aproximadamente a cada 7 dias.
Após a terceira passagem, células tumorais foram inoculadas nos animais controles e obesos, por via subcutânea no flanco superior direito (para a formação do tumor sólido).
Assim, na oitava semana, após serem anestesiados com uma mistura de Cetamina e Xilazina intraperitonialmente, na dose de 0,15 mL/100g de peso corporal, os ratos controles (C) e obesos (O) receberam a inoculação de células do tumor de Walker-256 (1 x 107 células), subcutâneamente no flanco superior direito.
No mesmo dia da inoculação do tumor, na oitava semana de experimento, foi iniciado o tratamento com botriosferana uma vez ao dia, via gavagem, na dose de 12 mg/kg de peso corpóreo por dia, em parte dos ratos dos grupos CT e OT (controle tumor botriosferana CTB e obeso tumor botriosferana OTB). Os grupos CT e OT receberam água destilada via gavagem, para serem submetidos ao mesmo fator de estresse que os animais CTB e OTB. Todos os grupos foram tratados até a décima semana.
A produção do exopolissacarídeo – botriosferana, produzido pelo fungo Botryosphaeria rhodina MAMB-05, foi cultivo através do fungo em meio submerso contendo sacarose como descrito previamente (BARBOSA et al., 2003), e a dose de botriosferana utilizada neste experimento foi baseada em estudo prévio e representa a dose na qual a máxima atividade hipoglicemiante e hipocolesterolêmica foram observadas (MIRANDA et al., 2008). Solução estoque de botriosferana foi preparada em água destilada na concentração de 2,0 g/L, autoclavada a 121°C por 20 min e estocada a 4°C.
No final da 10ª semana de vida, após 15 dias de tratamento, todos os grupos experimentais (CT, CTB, OT e OTB) foram estudados. Após a eutanásia, a massa tumoral foi removida e pesada. Para o cálculo do peso relativo (g/100g de peso corporal) do tumor foi utilizada a seguinte fórmula:
Peso relativo do tumor (g\100g): Peso do tumor x 100 Peso da carcaça*
A porcentagem de pega do tumor foi calculada em porcentagem de animais inoculados e que desenvolveram o tumor.
2.4 CARACTERIZAÇÃO DA OBESIDADE E DETERMINAÇÃO DOS
PARÂMETROS BIOLÓGICOS
No decorrer do experimento o peso corporal dos animais foi acompanhado toda segunda, quarta e sexta-feira, e após a eutanásia, amostras de tecido tumoral, tecido adiposo (gordura periepididimal, retroperitoneal e mesentérica), tecido muscular (sóleo e EDL), fígado, baço, rins e adrenais foram coletadas. Os tecidos foram lavados com solução fisiológica e pesados para a determinação dos pesos absoluto (g) e relativo (g/100g peso corporal). Para a caracterização da obesidade foram avaliados os seguintes parâmetros:
a) Evolução ponderal = peso do animal da primeira à oitava semana (para os grupos controle e obeso).
b) Ganho de Peso: Peso da carcaça – peso do animal na oitava semana (para os grupos CT; CTB; OT e OTB).
c) Peso relativo das gorduras periepididimal, retroperitoneal e mesentérica: Peso relativo das gorduras (g\100g): Peso da gordura x 100
Peso da carcaça
d) Peso relativo da massa magra (músculos sóleo e extensor digital longo (EDL)): Peso relativo dos músculos (g\100g): Peso dos músculos x 100
Peso da carcaça
e) Índice de adiposidade: [(gorduras periepididimal + retroperitoneal + mesentérica) / peso da carcaça x 100].
Amostras de tecido tumoral foram retiradas e armazenadas a -80 ºC para avaliação da expressão de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular e na apoptose pela técnica de Western blotting.
Para análise dos perfis glicêmico e lipídico sérico, os animais foram expostos a jejum de 10-12 horas, anestesiados com tiopental sódico (50mg/kg/ip; Cristália® Produtos Químicos
Farmacêuticos Ltda, Itapira, São Paulo, Brasil) e eutanasiados por decapitação. A seguir, amostras do sangue foram coletadas, centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos (Eppendorf®
Centrifuge 5804-R, Hamburg, Germany) e o soro utilizado para as determinações séricas de glicose, triacilglicerol, colesterol total e HDL-colesterol (kits Analisa®, Belo Horizonte, Minas
Gerais, Brasil); o método utilizado foi o enzimático-colorimétrico e as análises foram realizadas em aparelho automatizado (Technicon, RA-XTTM System, Global Medical Instrumentation, Minessota, USA).
Também foram avaliados alguns parâmetros hematológicos como o hemograma (eritrograma, leucograma e plaquetograma), parâmetros imunológicos como a viabilidade dos macrófagos peritoneais e a produção de óxido nítrico (NO•) por esses macrófagos peritoneais.
2.5 ANÁLISE DO CONSUMO DIÁRIO DE RAÇÃO E DE ÁGUA
Para a determinação do consumo diário de ração, os ratos foram mantidos em caixas de polipropileno (quatro animais por caixa) acondicionados em ambiente com temperatura controlada de 22 ± 2 ºC e ciclo claro-escuro de 12h, com livre acesso à água e alimento. Foram colocados 600g de ração na caixa e após 48h foi pesado o alimento que restou, sendo a diferença considerada a quantidade de alimento consumida pelos ratos presentes na caixa, esse valor foi dividido pelo número de animais na caixa e por 2 (valor referente ao intervalo de dias entre uma pesagem e outra). Essa análise foi feita durante as 10 semanas de experimento, para avaliar o consumo de ração desde o início do experimento (1ª semana) até o último dia de tratamento (10ª semana). O consumo foi expresso em gramas. Para a análise do consumo de água foi realizado o mesmo protocolo do consumo de ração, porém a quantidade de água ofertada aos animais a cada dois dias foi de 1 litro.
O consumo dos animais expresso em calorias foi obtido por meio da seguinte fórmula: Grupos CT e CTB: (valor consumido de ração/dia/rato (g) X 3,80 (kcal)) + (valor consumido em água/dia/rato (mL) X 0 (kcal)) = valor consumido em calorias por dia por rato (kcal)
Grupos OT e OTB: (valor consumido de ração/dia/rato (g) X 4,85 (kcal)) + (valor consumido em água/dia/rato) (ml) X 1,2 (kcal)) = valor consumido em calorias por dia por rato (kcal)
2.6 ÍNDICE DE CAQUEXIA
O índice de caquexia ou perda de massa corpórea (PMC) foi calculado utilizando a seguinte equação:
PMC (%) = 100 x (MCi – MCf + MT + GMC) / (MCi + GMC) Onde: MCi: massa corpórea inicial de um animal com tumor (g); MCf: massa corpórea final de um animal com tumor (g); MT: massa tumoral (g);
GMC: ganho de massa corpórea de um animal sem tumor durante os 15 dias do experimento;
Os ratos foram considerados caquéticos quando apresentaram um índice de caquexia igual ou maior que 10 (TISDALE, 2010). A presença de animais que apresentavam caquexia foicalculada em porcentagem.
2.7 TESTE DE TOLERÂNCIA À INSULINA INTRAPERITONEAL (IPITT)
Após submeter os animais a um período de restrição alimentar de 4 horas, foi coletada uma amostra de sangue da veia caudal correspondendo à glicemia basal (To). Em seguida, foi administrada insulina regular (Iolin, Biobrás) na dose de 1,0 U/Kg de peso corporal por via intraperitoneal e foram coletadas amostras de sangue nos tempos 4, 8, 12, 16 e 20 minutos após a sobrecarga de insulina, correspondendo a T4’, T8’, T12’, T16’ e T20’. A glicemia foi determinada por meio de glicosímetro e fitas (Glicosímetro ALERETM G2, Alere S.A. Brasil).
A constante de decaimento de glicose (Kitt) em resposta à sobrecarga de insulina foi calculada a partir da regressão linear do logaritmo neperiano dos valores glicêmicos obtidos de 4 a 20 minutos no teste (BONORA et al., 1989). Este índice é expresso em porcentagem por minutos e traduz que quanto maior o valor do Kitt maior a sensibilidade à insulina. Os animais foram avaliados após 15 dias de tratamento com botriosferana (10ª semana de experimento).
Após submeter os animais a um período de jejum de 15 horas, foi coletada uma amostra de sangue da veia caudal correspondendo à glicemia basal (To). Em seguida, foi administrada glicose na dose de 2,5 g/kg de peso corporal via gavagem (solução de glicose a 0,5 g/mL). Foram coletadas amostras de sangue nos tempos 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a administração de glicose, correspondendo a T15’, T30’, T60’ T90’ e T120’. A glicemia foi determinada através de glicosímetro e fitas (Glicosímetro ALERETM G2, Alere S.A. Brasil). O
resultado foi calculado por meio do valor da área sob a curva, representado por glicose [(mg/dl x min-1) x 1000]. Os animais foram avaliados após 15 dias de tratamento com botriosferana na 10ª semana de experimento.
2.9 ANÁLISE DA VIABILIDADE DOS MACRÓFAGOS E DA PRODUÇÃO DE
ÓXIDO NÍTRICO (NO•) PELOS MACRÓFAGOS
Após a eutanásia dos animais, foi realizada a coleta dos macrófagos peritoneais dos ratos dos quatro grupos experimentais (CT, CTB, OT e OTB). Na sequência, os macrófagos foram contados e colocados em placas de 96 poços para realizar os testes de viabilidade celular por meio do teste colorimétrico do (3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) (BERRIDGE; HERST; TAN, 2005), que avalia a atividade enzimática mitocondrial (desidrogenases mitocondriais) de células viáveis, alterando o composto de coloração amarela para coloração azul escuro, formando cristais insolúveis em solução aquosa chamado de formazan. Quanto maior a quantidade de formasan formado maior é a quantidade de células viáveis.
Assim, para a análise do MTT, os macrófagos (5 x 105 células por poço) foram cultivados em placas de 96 poços e incubadas por 2 horas a 37 ºC e 5% CO2 em meio de
cultura RPMI contendo 10% de soro fetal bovino para aderir à placa. Após este período, o meio foi removido e as células foram incubadas com meio de cultura RPMI na presença de botriosferana (100 µg/mL) por 4 horas a 37 ºC e 5% CO2. Após o período de incubação, as
células foram tratadas com a solução de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina, 15 μL, 5 mg mL-1 em PBS, Sigma-Aldrich, Brasil) e a placa foi incubada por um período adicional de 4 horas. Após esse período, o meio de incubação foi aspirado e 50 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado em cada poço. A placa foi colocada em agitação por 10 minutos, protegida da luz. Após este tempo, a redução do MTT foi determinada espectrofotometricamente pela medida da absorbância (A) no comprimento de onda de 630
nm. Os grupos tratados foram comparados com o grupo controle e os resultados foram expressos em porcentagem.
A fim de analisar a produção de NO• pelos macrófagos foi utilizado o método de Griess (GREEN et al., 1982). Sendo NO• dosado indiretamente pela concentração de nitrito presente no meio de cultura após incubação com os macrófagos. Inicialmente, os macrófagos (5 x 105 células por poço) foram cultivados em placas de 96 poços e incubadas por 2 horas a 37 ºC e 5% CO2 em meio de cultura RPMI contendo 10% de soro fetal bovino para aderir à placa.
Após este período, o meio foi removido e as células foram incubadas com meio de cultura RPMI na presença de botriosferana (100 µg/mL) por 4 horas a 37 ºC e 5% CO2. Após o
período de incubação, foi coletado o sobrenadante dos poços e incubados com 100 µL do reagente de Griess, em temperatura ambiente por 10 minutos ao abrigo da luz. Na sequência, a produção de NO• foi determinada espectrofotometricamente pela medida da absorbância (A) após a leitura da placa no microleitor de ELISA em comprimento de onda de 560 nm. Resultados foram expressos em µmoles de NO• por 5 x105 células.
2.10 WESTERN BLOTTING
As amostras de tecido tumoral dos animais mantidas a -80 ºC, foram trituradas em nitrogênio líquido e homogeneizadas em tampão contendo Triton-X-100 (1%), Tris (100 mM, pH 7,4), pirofosfato de sódio (100 mM), fluoreto de sódio (100 mM), EDTA (10 mM), ortovanadato de sódio (10 mM), PMSF (2 mM) e aprotinina (0,01 mg/mL). Os extratos teciduais foram centrifugados a 12000 g a 4 ºC por 30 minutos para a remoção dos debris celulares. Após a centrifugação, o conteúdo proteico total foi quantificado pelo método de Bradford (BioRad). O sobrenadante foi tratado com tampão de Laemmli contendo DTT (100 mM), aquecido a 100 ºC por 5 minutos e 50 µg de proteína total foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 10%).
A transferência das proteínas separadas no gel foi feita eletricamente para uma membrana de nitrocelulose, por 1 hora e 30 minutos a 100 V. Após transferência, a membrana de nitrocelulose foi incubada com uma solução bloqueadora com 5% de albumina bovina sérica (BSA-bovin serum albumin) por 1 hora e 30 minutos em temperatura ambiente para reduzir a ligação inespecífica dos anticorpos às proteínas na membrana. Em seguida, as membranas foram lavadas com TTBS (pH = 7.4), três vezes de 10 minutos e, então, incubadas com o anticorpo primário a 4 ºC durante a noite. Após este período, as membranas
foram lavadas exaustivamente com TTBS (pH = 7,4) e foram incubadas com o anticorpo secundário, conjugado com peroxidase por 1 hora e 30 minutos em TA. Em seguida as membranas foram lavadas 3 vezes de 10 minutos com TTBS (pH = 7,4) e, logo após, incubadas com a solução de quimioluminescência, por 3 minutos, como descrito no protocolo do kit (Amersham).
Todos os anticorpos primários foram adquiridos da Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA), exceto os anticorpos para Bax e Bcl-2 que foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). A diluição dos anticorpos foram as seguintes: anti-p27 (1:1000), anti-Bax (1:100), anti-Bcl-2 (1:100), anti-caspase 3 (1:1000), anti-AMPK e FOXO3a e β-actina (1:10000). Os anticorpos secundários utilizados foram: anti-rabbit IgG (1:5000; Cell Signaling Technologies) usado para todos os anticorpos primário exceto para Bcl-2 e β-actina que foi usado o anticorpo anti-mouse IgG (1:5000). Por fim, a imuno-detecção foi realizada por meio do método de quimioluminescência, de acordo com as instruções do fabricante (ECL SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate - Thermo Scientific, Rockford, IL, USA, #34080), e analisada por meio de um sistema de imagens (Image J).
2.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média erro padrão da média (EPM). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste “t” de Student no caso de comparação de duas médias ou usando o teste de análise de variância de duas vias (ANOVA two-way) seguido do teste de múltiplas comparações Tukey-Kramer para a comparação de mais de duas médias. Ainda, nos casos em que os resultados não passaram pelo teste de normalidade foi realizado o teste de Kruskal-Wallis e pós teste de Dunns. A curva glicêmica do OGTT foi mostrada de acordo com os valores da média erro padrão da média (EPM) para cada ponto da curva e comparados ponto por ponto usando o teste de análise de variância de duas vias (ANOVA two-way) seguido do teste de múltiplas comparações Tukey-Kramer para a comparação de mais de duas médias. O nível de significância mínima aceitável foi de p < 0,05. Os resultados foram gerados por meio do programa estatístico Sigma Stat e os gráficos por meio do programa Graph Pad Prism 7.
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