Londrina 2015
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU DOUTORADO
EM ODONTOLOGIA
MARIA BEATRIZ BERGONSE PEREIRA PEDRIALI
ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS NOS
GENES IL1A, IL1B, IL6 E VDR COM A PERIODONTITE
CRÔNICA EM IDOSOS COM E SEM OSTEOPOROSE
Londrina 2015
ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS NOS
GENES IL1A, IL1B, IL6 E VDR COM A PERIODONTITE
CRÔNICA EM IDOSOS COM E SEM OSTEOPOROSE
Tese apresentada à UNOPAR, como requisito à obtenção do título de Doutora em Odontologia.
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação-na-publicação
Universidade Norte do Paraná Setor de Tratamento da Informação
Pedriali, Maria Beatriz Bergonse Pereira.
P41a Análise da associação dos polimorfismos nos genes IL1A, IL1B, IL6 e VDR com a periodontite crônica em idosos com e sem osteorporose. / Maria Beatriz Bergonse Pereira Pedriali. Londrina: [s.n], 2015
93f.
Tese (Doutorado em Odontologia). Universidade Norte do Paraná.
Orientador: Profª. Drª. Regina Célia Poli-Frederico
1 - Odontologia – tese de doutorado- UNOPAR 2- Osteoporose 3- Idosos 4- Interleucinas 5- Receptor de Vitamina D- I-
Poli-Frederico, Regina Célia; orient. II -Universidade Norte do Paraná.
Londrina, 10 de julho de 2015. BANCA EXAMINADORA
Profa Dra Orientadora Regina Celia Poli- Frederico
UNOPAR
Profa Dra Componente da Banca Sandra Kiss Moura
UNOPAR
Profa Dra Componente da Banca Jeane Eliete Laguila Visentainer
UEM
Profa Dra Componente da Banca Sandra Mara Maciel
UNOPAR
Profa Dra Componente da Banca Solange de Paula Ramos
UEL
ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS NOS
GENES IL1A, IL1B, IL6 E VDR COM A PERIODONTITE
CRÔNICA EM IDOSOS COM E SEM OSTEOPOROSE
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Norte do Paraná - UNOPAR, como requisito à obtenção do título de Doutora em Odontologia. Área de Concentração: Dentística Preventiva e Restauradora.
À minha querida família pelo apoio incondicional em todos os momentos, principalmente nos de incerteza, sem vocês nenhuma conquista valeria à pena.
Agradeço primeiramente a Deus por iluminar e guiar meus caminhos, por me fortalecer e me fornecer a disposição necessária para a realização deste sonho, pela inspiração de todos os momentos.
À minha amada família, Paulo Marcio, Leonardo e Lucas, pelo carinho, incentivo, compreensão e encorajamento, durante todo este período.
Aos meus pais, Walter e Leniza, que são e sempre serão o alicerce da minha educação moral, religiosa e profissional. Obrigada pelos incontáveis conselhos e pelo constante apoio e incentivo.
À Profa. Dra. Regina Célia Poli-Frederico, muito orgulho tê-la como minha orientadora, por toda dedicação, ensinamentos, incentivo, amizade e fundamentalmente por ter acreditado na minha capacidade.
À toda equipe que integrou o projeto EELO (Estudo sobre Envelhecimento e Longevidade) e aos idosos que participaram da pesquisa.
Ao Prof. Dr. Alcides Gonini Júnior, coordenador do Programa de Pós-Graduação Stricto Senso em Odontologia, exemplo de liderança e competência. Manifesto aqui minha gratidão a todos os professores, funcionários e amigos do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, pelo aprendizado ao longo desses anos que muito contribuíram para minha formação docente.
Agradeço à Universidade Norte do Paraná e ao Programa de Pós-Graduação Stricto Senso por me acolher como aluna e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro.
Meus sinceros agradecimentos pela contribuição da banca do exame de qualificação e agradeço a participação dos membros da banca examinadora da defesa.
E a todos que de alguma forma estão próximos de mim que direta e indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho, meus agradecimentos.
polimorfismos nos genes IL1A, IL1B, IL6 e VDR com a periodontite crônica em idosos com e sem osteoporose. 85 f. [Tese de Doutorado]. Programa de Pós-Graduação em Odontologia – Universidade Norte do Paraná, Londrina, Londrina, 2015.
RESUMO
Até o momento, vários estudos relatam a associação da doença periodontal com a osteoporose e com polimorfismos genéticos, envolvidos com a densidade óssea mineral, tanto para a doença periodontal quanto para a osteoporose. Porém não existem estudos relacionando os polimorfismos genéticos comuns às duas condições. O objetivo deste estudo foi investigar a associação entre os polimorfismos da IL1A, IL1B, IL6 e VDR e a doença periodontal em idosos com e sem osteoporose. Idosos com 60 anos ou mais de idade, foram examinados clinicamente e a condição periodontal de cada indivíduo foi baseada na quantidade de perda de inserção periodontal (PIP), onde PIP ≤ 3 mm os indivíduos foram considerados saudáveis e PIP ≥ 4 mm foram considerados com periodontite. Todos os indivíduos realizaram o exame de densitometria óssea do fêmur e da coluna lombar (L1-L4) e foram classificados em três grupos: controle, osteopênicos e osteoporóticos. As amostras de DNA foram analisadas para o polimorfismo dos genes: IL1A C-889T, IL1B C+3954T, IL6 G-174C e entre os polimorfismos TaqI,
BsmI, ApaI e FokI do gene VDR. Os dados foram analisados utilizando o teste do
qui-quadrado, sendo estabelecido um intervalo de confiança de 95% e nível de significância de 5% (p˂0,05). O pacote de programas ARLEQUIN foi usado para calcular as frequências de haplótipos, equilíbrio de Hardy-Weinberg e desequilíbrio de ligação. Para análise de risco de alelos, genótipos e haplótipos o Odds Ratio, com intervalo de confiança de 95%, foi calculado. Houve uma associação significativa entre a frequência genotípica no gene IL1B +3954 em pacientes com osteoporose e com doença periodontal (p=0,02) sendo que 50% dos indivíduos portadores do genótipo CT apresentavam osteoporose e doença periodontal. Para o gene da IL6 -174, foi constatado que indivíduos com osteoporose e portadores do alelo G apresentam maior suscetibilidade à doença periodontal. 84,2% dos indivíduos portadores do genótipo GG apresentavam osteoporose e doença periodontal (p=0,04). O alelo C conferiu 25% de proteção aos indivíduos que abrigam este alelo em comparação aos que possuíam o alelo G. Pode-se verificar que indivíduos portadores do alelo G (genótipos GC e GG) apresentaram maiores níveis plasmáticos da IL-6 em comparação a indivíduos não portadores deste alelo (p=0,04). Os polimorfismos TaqI, BsmI, ApaI e FokI do gene VDR não mostraram diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e periodontite crônica, porém o haplótipo TBAF está associado com a prevalência da periodontite crônica (p=0,04). Podemos concluir, que o genótipo CT do polimorfismo genético da
IL1B +3954 e o genótipo GG do polimorfismo genético da IL6 -174 está associado
com o aumento da suscetibilidade à periodontite e à osteoporose. E o haplótipo TBAF construído a partir dos polimorfismos TaqI, BsmI, ApaI e FokI do gene VDR está associado com a prevalência da periodontite crônica em idosos Brasileiros. Palavras-chave: Doença periodontal. Polimorfismo genético. Osteoporose. Idosos. Interleucinas. Receptor de Vitamina D.
polymorphisms in IL1A, IL1B, IL6 and VDR with chronic periodontitis in elderly patients with and without osteoporosis. 85 f. [Tese de Doutorado]. Programa de Pós-Graduação em Odontologia – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2015.
ABSTRACT
Until now, several studies reported an association between periodontal disease and osteoporosis and genetic polymorphisms involved in bone mineral density in both periodontal disease and osteoporosis. But there are no studies linking common genetic polymorphisms for the two conditions. This study investigates the association between IL1A, IL1B, IL6 and VDR polymorphisms and periodontal disease in elderly with or without osteoporosis. Seniors aged 60 and older, were examined clinically and periodontal condition of each individual was based on the amount of periodontal attachment loss, where PIP ≤ 3 mm were considered healthy and individuals with PIP ≥ 4 mm were considered with periodontitis . All subjects performed the examination of bone densitometry of femur and lumbar spine (L1-L4) and were classified into three groups: control, osteopenic and osteoporotic. The DNA samples were analyzed for the polymorphism of the gene: IL1A C-889T, IL1B C + 3954T, IL6 G-174C and
TaqI, BsmI, ApaI and FokI VDR polymorphism. Data were analyzed using the
chi-square test, and established a 95% confidence interval and a significance level of 5% (p˂0.05). The ARLEQUIN software package was used to calculate the haplotype frequencies, Hardy-Weinberg equilibrium and linkage disequilibrium. For analysis of risk alleles, genotypes and haplotypes the Odds Ratio, with 95% confidence interval, was calculated. There was a significant association between genotype frequency in
IL1B +3954 gene in patients with osteoporosis and periodontal disease (p=0,02), and
50% of individuals with the CT genotype had osteoporosis and periodontal disease. For the IL6 -174 gene, it was found that individuals with osteoporosis and G allele carriers show higher susceptibility to periodontal disease. 84.2% of individuals with the GG genotype had osteoporosis and periodontal disease (p=0,04). The C allele conferred 25% protection to individuals carrying this allele compared to those who had the allele G. It can be seen that individuals with the G allele (GC and GG genotypes) had higher plasma levels of IL-6 compared to individuals not carrying this allele (p=0,04). The TaqI, BsmI, ApaI and FokI VDR polymorphisms showed no statistically significant difference between the control group and chronic periodontitis, but TBAF haplotype is associated with the prevalence of chronic periodontitis (p=0,04). We conclude that genotype CT of the IL1B +3954 and genotype GG of the
IL6 -174 polymorphism is associated with an increased susceptibility to periodontal
disease and osteoporosis. In addition, TBAF haplotype constructed from TaqI, BsmI,
ApaI and FokI VDR polymorphisms is associated with the prevalence of chronic
periodontitis in Brazilian elderly.
Keywords: Periodontal disease. Genetic polymorphism. Osteoporosis. Elderly. interleukin. Vitamin D receptor.
1 INTRODUÇÃO ... 8
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 12
2.1 ADOENÇA PERIODONTAL ... 12
2.2 DOENÇA PERIODONTAL E A OSTEOPOROSE ... 14
2.3 DOENÇA PERIODONTAL:POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR DE VITAMINA D(VDR) ………..……..15
2.4 DOENÇA PERIODONTAL:POLIMORFISMOS DOS GENES CODIFICADORES DE CITOCINAS ……….20 3 PROPOSIÇÃO ... 26 3.1 PROPOSIÇÃO GERAL ... 26 3.2 PROPOSIÇÕES ESPECÍFICAS ... 26 4 ARTICLE 1 ... 27 5 ARTICLE 2 ... 43 6 ARTICLE 3 ... 58 7 CONCLUSÃO ... 74 REFERÊNCIAS ... 76 ANEXOS ... 83
ANEXO A - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UNOPAR ... 84
1 INTRODUÇÃO
O envelhecimento populacional caracteriza-se pela redução da participação relativa de criança e jovens, acompanhada do aumento proporcional dos adultos, particularmente, dos idosos e pode ser considerado um fenômeno mundial visto o ritmo de crescimento mais elevado do grupo etário acima de 60 anos quando comparado aos demais grupos, tanto em países desenvolvidos, quanto naqueles em desenvolvimento.1,2 O crescimento da população idosa deve-se a
vários fatores, dentre eles, a diminuição da taxa de natalidade e fecundidade, o avanço na ciência com consequente possibilidade de tratamento de doenças, em particular, doenças infectocontagiosas, além da melhoria nas condições de vida relacionadas ao saneamento básico e ao acesso aos serviços de saúde.1
Em se tratando da saúde bucal, a realidade atual revela situação crítica que pode afetar a saúde geral e agravar a qualidade de vida dos idosos.3,4,5
Estudo sobre o impacto das condições bucais na qualidade de vida e no bem-estar do indivíduo idoso revela que os aspectos funcionais, sociais e psicológicos são significativamente afetados por uma condição bucal insatisfatória.6 Sendo, portanto,
a proteção e promoção da função mastigatória essencial para manter a qualidade de vida física e social.7
Resultados dos levantamentos epidemiológicos, de abrangência nacional, realizados pelo Ministério da Saúde, demonstraram ser grave o quadro sanitário da saúde bucal em idosos. Os dados obtidos em 2002/2003 demonstraram que na faixa etária de 65 a 74 anos, a média de dentes atacados pela cárie era de 27,8 dentes; que a percentagem de pessoas com algum problema periodontal, igual a 92,1%; e que 75% dos idosos não possuíam nenhum dente funcional em pelo menos uma arcada.8 Resultados preliminares do último levantamento, divulgados
em 2010, apontaram que mais de 3 milhões de idosos necessitam de prótese total (nas duas arcadas dentárias) e que outros 4 milhões precisam usar prótese parcial (em uma das arcadas).9
A destruição periodontal é uma experiência frequente entre os idosos e contribui para a perda de, aproximadamente, um em cada cinco dentes entre adultos em populações ocidentais.10,11,12,13 É relevante coletar e analisar dados
sobre a progressão da doença periodontal em pessoas idosas, a fim de identificar aqueles que são propensos a perder os dentes.14
A doença periodontal é de etiologia multifatorial relacionada a um processo inflamatório que leva à destruição dos tecidos de suporte dos dentes.15
Com o acúmulo de biofilme na superfície dental, as células do periodonto entram em contato com produtos bacterianos e produzem citocinas pró-inflamatórias e outros mediadores químicos da inflamação que iniciam a resposta inflamatória no interior dos tecidos periodontais.16
As citocinas, tais como: interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) são proteínas, secretadas por muitos tipos celulares, que agem como mensageiras, iniciando e mantendo as respostas imunes e inflamatórias, regulando o crescimento e diferenciação das células.17
Aspectos microbiológicos, imunogenéticos e ambientais estão ligados ao início e à modulação da doença periodontal. Porém, a resposta aos agentes etiológicos pode variar entre os indivíduos. Acredita-se que esta resposta possa ser influenciada pelo perfil genético do indivíduo.18
Atualmente, o enfoque das pesquisas está na influência genética sobre a doença periodontal crônica, na busca sobre o papel dos genes e na identificação de polimorfismos genéticos que tenham relação com aspectos imunológicos do hospedeiro, que poderiam ajudar a elucidar a patogênese e a progressão da doença.19,20
Doenças com etiopatologia complexa, como a doença periodontal, são poligênicas, ou seja, vários genes podem contribuir para a progressão e risco do processo patológico. As variações genéticas poderiam atuar como fatores modificadores da doença e polimorfismos nesses genes podem proteger o hospedeiro ou contribuir para o desenvolvimento da doença. No caso da doença periodontal, o papel dos genes que podem modificar seu curso ainda precisa ser elucidado.21,22
Desta maneira, o estudo dos polimorfismos genéticos tem o potencial de identificar as pessoas com maior ou menor predisposição à doença periodontal, o que possibilitaria um ajuste individualizado da abordagem preventiva e terapêutica, com resultados clínicos mais positivos e consequente redução da perda dentária e dos impactos socioeconômicos.
Os polimorfismos genéticos podem ocorrer na região codificadora ou na região promotora do gene, o que pode ocasionar modificações quantitativas ou qualitativas da proteína codificada podendo resultar em alterações nas proteínas
(citocinas) ou na sua expressão, culminando possivelmente em alterações no sistema imune, podendo ser determinantes na evolução da doença periodontal (Figura 1).22 Portanto, o polimorfismo genético pode alterar a função da proteína
sem, no entanto, impedir sua ação. Estas diferenças no funcionamento fisiológico das proteínas podem ser acentuadas por fatores ambientais, como por exemplo, o hábito de fumar. Se a proteína afetada está envolvida em processos biológicos, como a resposta inflamatória a um agente antigênico, o polimorfismo pode aumentar ou diminuir o risco do indivíduo para diferentes fenótipos da doença.17
Figura 1 - Polimorfismos genéticos
Fonte: Da autora (2015).
A osteoporose e a periodontite são doenças com maior incidência associada ao processo de envelhecimento da população, ambas afetam a massa óssea e compartilham fatores de risco comuns, por estas razões foi sugerido que estas condições podem estar relacionadas.23
Até o momento, a maioria dos estudos relata a associação da doença periodontal com a osteoporose ou com polimorfismos genéticos, alguns destes polimorfismos são comuns às duas doenças, sendo os principais polimorfismos investigados nos genes da interleucina-1A (IL1A), interleucina-1B
(IL1B), interleucina-6 (IL6) e receptor da vitamina D (VDR), envolvidos com a densidade óssea mineral, tanto para a doença periodontal quanto para a osteoporose, no entanto, não existem estudos relacionando as três condições (doença periodontal, polimorfismos genéticos e a osteoporose).
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ADOENÇA PERIODONTAL
As doenças periodontais compreendem condições inflamatórias crônicas e infecciosas provocadas pela interação entre os biofilmes supra e subgengivais e a resposta inflamatória do hospedeiro. A presença do biofilme, os próprios micro-organismos que o compõem, e metabólitos bacterianos produzidos após colonização da área subgengival desencadeia uma resposta inflamatória. A ativação do sistema imune do hospedeiro, principalmente para fins de proteção, resulta em destruição dos tecidos, levando a síntese e liberação de citocinas, mediadores pró-inflamatórios e metaloproteinases da matriz. A progressão e gravidade da destruição periodontal causada pela periodontite depende do equilíbrio entre a virulência do biofilme local e a resposta imune do hospedeiro.24
Portanto, a doença periodontal é uma infecção polimicrobiana multifatorial, sendo considerada a manifestação patológica da resposta do hospedeiro contra o desafio bacteriano do biofilme na interface dente / gengiva, caracterizada pela inflamação e destruição dos tecidos de suporte do dente.25
Clinicamente, podem ser formadas bolsas periodontais, ocorrer reabsorção do osso alveolar e eventual perda do elemento dental.26,27
Embora as bactérias sejam, sem dúvida, a principal causa da lesão inflamatória inicial, evidências indicam ser mais provável a resposta do hospedeiro às bactérias que leva às alterações teciduais observadas tanto na gengivite quanto na periodontite. Assim, parece que é a resposta inflamatória e imune do hospedeiro, e não uma bactéria específica ou seus fatores de virulência, que determinará o desenvolvimento e a progressão da periodontite.24,28
As fases do desenvolvimento da doença periodontal são denominadas de lesão inicial, precoce e estabelecida. Foi observado que a lesão já estabelecida poderia permanecer inativa e não progredir a menos que algum outro fator desconhecido interfira na delicada relação micro-organismo-hospedeiro direcionando para uma maior destruição de tecidos e para o desenvolvimento da lesão avançada, já demonstrando indícios que a resposta inflamatória e imunológica descontrolada impulsiona a destruição dos tecidos.27,29
A inflamação pode causar destruição do periodonto marginal via dois mecanismos: pela ação direta dos subprodutos do metabolismo e enzimas bacterianas; ou estimulando a liberação de mediadores inflamatórios de células do hospedeiro. Embora a infecção por periodontopatógenos seja essencial para o início da doença periodontal, sua mera presença na cavidade oral não é suficiente para explicar diferenças na severidade da doença entre indivíduos.30
O caráter multifatorial da doença periodontal sofre influência de fatores de risco sistêmicos (diabetes, obesidade, estresse, osteopenia, osteoporose e consumo inadequado de cálcio e vitamina D), ambientais (tabagismo), bem como fatores genéticos e comportamentais, tais como a higiene oral. Ressalta-se que a eliminação ou modificação desses fatores de risco deve fazer parte do tratamento da doença periodontal. Embora fatores genéticos ou raciais não possam ser alterados, a identificação de pessoas em risco de resultados adversos por raça ou composição genética poderia direcionar as intervenções preventivas e terapêuticas.26,31-36
O conceito de fatores de risco e mecanismos envolvidos no início e progressão da periodontite se desenvolveu drasticamente nas últimas décadas, de uma visão simplista de micro-organismos diretamente causando os sinais e sintomas clínicos da periodontite, para a compreensão da importância do sistema imunológico e da resposta inflamatória do hospedeiro, sendo influenciada por fatores genéticos e ambientais.24,37
A presença de um fator de risco implica em um aumento direto da probabilidade de ocorrência de uma doença, e, se um fator de risco está ausente ou for removido, observa-se uma redução na probabilidade de que a mesma ocorra.38
Há um crescente reconhecimento de que a variabilidade interindividual da resposta imune se desenvolve como uma consequência de interações entre o hospedeiro, ambiente e microbiota dando origem a um fenótipo clínico específico. Sendo assim, este fenômeno representa uma reação biológica única para cada indivíduo.39 Portanto, cada pessoa tem uma resposta individual ao
desafio bacteriano que determina sua suscetibilidade a doenças, incluindo a periodontite.40
A inflamação periodontal envolve vários estágios caracterizando a resposta imune inata. Este processo é controlado por vários genes ou genes modificadores da doença, que codificam proteínas de natureza diferente (como, enzimas e citocinas). Devido a variações genéticas (por exemplo, polimorfismos
genéticos), a imunidade inata pode ser mais ou menos grave, resultando em perda óssea imprevisível.39 Atualmente, os pesquisadores têm se concentrado na
identificação de polimorfismos genéticos em vários aspectos da imunidade do hospedeiro.22
2.2 DOENÇA PERIODONTAL E A OSTEOPOROSE
Estudos têm chamado a atenção para o possível vínculo entre osteoporose e doença periodontal.41,23 Periodontite e a osteopenia podem ter
agentes etiológicos comuns que podem influenciar diretamente ou modular ambos os processos de doença.38,42-44 Esta relação surgiu a partir do fato de que ambas as
condições envolvem a perda óssea e podem compartilhar caminhos patológicos comuns. No entanto, enquanto a osteoporose é uma doença óssea metabólica, a periodontite é uma doença inflamatória, elas diferem em sua patogênese, mas compartilham fatores de risco comuns que podem explicar a associação proposta entre as duas condições.36
A suposição de um risco aumentado de doença periodontal na presença de osteoporose é baseada na hipótese de que a osteoporose resulta em perda de densidade mineral óssea em todo o corpo, incluindo a maxila e a mandíbula. A baixa densidade óssea leva a um aumento da porosidade alveolar, um padrão trabecular alterado e uma reabsorção óssea alveolar mais rápida após infecção com patógenos periodontais. Outra explicação é derivada do fato de fatores sistêmicos que afetam a remodelação óssea podem também modificar a resposta tecidual local contra uma infecção periodontal, pelo aumento da liberação sistêmica de citocinas inflamatórias como a IL-1 e IL-6.36
Uma revisão de literatura sobre a relação da osteopenia com a perda óssea alveolar e a doença periodontal concluiu que a gravidade da osteopenia está relacionada com a perda da altura da crista óssea alveolar e perda dental em mulheres na pós-menopausa.45
Um outro estudo investigou se mulheres com osteoporose têm um aumento da gravidade e extensão da doença periodontal. Trezentas e oitenta mulheres com idade entre 45-65 anos, com radiografias recentes da coluna vertebral e do fêmur proximal concordaram em realizar um exame periodontal que incluía parâmetros de sangramento à sondagem, profundidade de bolsa periodontal,
recessão e presença de cálculo. O resultado do estudo concluiu que não houve associação entre a presença de doença periodontal grave e osteoporose.46
Com objetivo de determinar se a osteoporose alveolar é uma manifestação local de uma perda óssea sistêmica, com etiologia e fatores de risco semelhantes, ou um processo independente, dependendo principalmente dos fatores que causam a periodontite, foi realizada uma revisão sistemática de ensaios clínicos avaliando a relação entre osteoporose e periodontite.23 A maioria dos
estudos sugeriu uma relação entre a osteoporose e a periodontite, porém a demonstração dessa relação é complexa, pois são doenças multifatoriais e ambas compartilham de mecanismos comuns. Assim, existe uma plausibilidade biológica que sugere que pelo menos parte da destruição periodontal é influenciada pela perda de massa óssea sistêmica. A maioria dos estudos demonstrou que a periodontite é um sinal precoce de osteoporose e poderia ser utilizada como uma ferramenta de rastreamento para identificar indivíduos com alto risco de osteoporose o que os beneficiaria com medidas preventivas ou terapêuticas. Na prática, este é um tema controverso, provavelmente devido aos diversos critérios utilizados para definir a osteoporose e a periodontite na literatura.23 Portanto, os pesquisadores
concluem que existe evidência de uma associação, porém mais estudos controlados com parâmetros clínicos padronizados de osso a nível sistêmico e doença periodontal são necessários para melhor elucidar a inter-relação entre a perda óssea sistêmica e a alveolar, e determinar definitivamente se a osteoporose é um fator de risco para a doença periodontal e, em caso afirmativo, que medida contribui para o risco global de doença periodontal.23,35
2.3 DOENÇA PERIODONTAL:POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR DE VITAMINA D(VDR)
Alguns estudos relataram que a vitamina D possui importante papel regulatório no metabolismo ósseo,47,48 especialmente na regulação do metabolismo
do cálcio e do fósforo, e ainda no sistema imunológico. A função biológica da vitamina D está associada com o seu receptor sendo evidente que as variações no gene receptor da vitamina D (VDR) podem ter profundo efeito sobre o metabolismo mineral e sobre a densidade mineral óssea (DMO).49,50
Esta vitamina pode ser obtida a partir da ingestão de alguns alimentos, como peixes e frutos do mar, e suplementos alimentares, porém a síntese
cutânea é sua maior fonte, produzida sob estimulação da exposição adequada à radiação solar ultravioleta B (UVB).51
A vitamina D absorvida no intestino delgado é transportada por proteínas até o fígado e os rins onde é metabolizada em sua forma ativa, sendo que somente uma pequena fração é encontrada livre.52 Os níveis plasmáticos de
paratormônio (PTH), cálcio e fósforo, regulam a produção de vitamina D e sua principal ação é manter os níveis normais de cálcio e fosfato no plasma. Quando ocorre diminuição desses níveis, o PTH juntamente com a vitamina D ativa, estimulam a atividade de diferenciação de pré osteoclastos em osteoclastos maduros, acelerando assim a reabsorção óssea, aumentando os níveis plasmáticos desses íons. A vitamina D também tem função na mineralização óssea. Quando em contato com o VDR, promove um feedback negativo, fazendo com que haja menor liberação de PTH,53,54 como também promove a síntese de RNAm para formação de
proteínas como a osteocalcina que atua na formação óssea pelos osteoblastos.55
O gene VDR está localizado no cromossomo 12, na posição q13.1 e possui cerca de 100kb e 9 éxons.55 Os polimorfismos do gene VDR e alterações nas
vias sinalizadoras mediadas por VDR podem levar a diferentes efeitos celulares importantes na ativação de genes, tais como o aumento / diminuição da transcrição, metabolismo do cálcio, proliferação celular e resposta imunológica.56
Adicionalmente, os polimorfismos neste gene são comumente presentes e foram associados com a osteoporose.57
Entre os polimorfismos do gene VDR mais estudados, estão os de nucleotídeos únicos (SNPs): rs1544410I (BsmI), rs7975232 (ApaI), rs731236 (TaqI) e rs2228570 (FokI).58-60
Polimorfismos são alterações genéticas decorrentes da substituição, deleção ou inserção de bases nitrogenadas, alterando a sequência de DNA.61
Polimorfismos de um gene ocupando um sítio cromossômico específico (locus) são chamados alelos. Dois ou mais alelos para um dado locus podem existir na natureza ao longo da evolução, mas também podem ocorrer a qualquer momento.22 São
herdados pela linhagem germinativa e um polimorfismo genético é caracterizado pela ocorrência de, pelo menos, dois alelos em um locus, quando o alelo mais raro ocorre em pelo menos 1% na população.61,62 Estas alterações quando envolvem
somente um nucleotídeo são denominadas de polimorfismo de nucleotídeos únicos (SNPs) gerando ou não sítios de clivagem para o reconhecimento de enzimas de
restrição.61,63 SNPs ocorrem com mais frequência do que qualquer outro tipo de
polimorfismo genético e podem não ter nenhum efeito ou podem promover efeitos biológicos importantes.22
Os polimorfismos genéticos provavelmente existem em muitos, se não na maioria dos genes de mediadores inflamatórios e imunes. No entanto, é provável que: 1) nem todos os polimorfismos conferem suscetibilidade diferencial aos aspectos destrutivos da doença; 2) certo número de genes serão identificados como importantes a este respeito; e 3) conhecimento de que estes podem permitir a determinação do risco individual para muitos indivíduos. A chave será identificar os polimorfismos que são importantes o suficiente para dar risco significativo de doença.64
A maioria dos polimorfismos do gene VDR está localizada em regiões regulatórias, podendo modular a expressão gênica, mas não mudanças estruturais na sequência de aminoácidos das proteínas codificadas. 65
Há evidências que a deficiência de vitamina D pode colocar indivíduos em risco, não só para a baixa densidade mineral óssea, mas também em outras vias metabólicas, tais como aquelas envolvidas na resposta imune, doenças inflamatórias crônicas e câncer.66 No entanto, não há estudos que demonstrem o
papel que a deficiência de vitamina D pode ter na etiopatogenia da doença periodontal, como a periodontite. É precisamente por causa de seus efeitos sobre o metabolismo ósseo, que a vitamina D pode ter um papel fundamental na prática odontológica.56
O polimorfismo rs1544410 (BsmI) está localizado no intron 8 e resulta na substituição de adenina por guanina (A/G). Conforme a nomenclatura, é definido como alelo “B” a presença da base adenina e como alelo “b” a presença da base guanina. O polimorfismo rs7975232 (ApaI) também está localizado no intron 8 e resulta na substituição de timina por guanina (T/G). A nomenclatura define como alelo “A” presença da base timina e “a” presença da base guanina. O polimorfismo rs731236 (TaqI) está localizado no éxon 9 e resulta na substituição de timina por citosina (C/T), sendo definido como “T” presença da base timina e “t” presença da base citosina. O polimorfismo rs2228570 (FokI) está localizado na junção do intron 1 com o éxon 2, resultante da substituição de citosina por timina (C/T) e é definido como “F” quando há presença da base citosina e “f” quando há presença da base timina.67,68
O polimorfismo TaqI gera a troca do códon ATT por ATC, porém não altera o aminoácido a ser sintetizado, pois ambos os códons sintetizam a isoleucina, considerado portanto um polimorfismo silencioso.68
Devido ao fato dos polimorfismos BsmI, ApaI e TaqI estarem localizados próximos a região 3’ não traduzida (3’UTR) surge a hipótese de que a forma alterada do receptor pode influenciar a estabilidade de transcrição, no entanto há uma lacuna no conhecimento sobre prováveis efeitos na transcrição do gene ou na estrutura da proteína.69 Ressalta-se que, o final 3’UTR dos genes é conhecido
por estar envolvido na regulação da expressão gênica, especialmente por meio da regulação da estabilidade do RNAm. Especula-se que o haplótipo BAt para os polimorfismos citados acima, apresente um RNAm mais estável e com uma meia-vida maior. Desta forma, resultaria em aumento no número de VDR presentes em células-alvo e, assim fornecendo a essas células uma melhor resposta à vitamina D.
70
A presença do alelo f gera uma versão mais longa da proteína com 3 aminoácidos a mais quando comparada com a presença do alelo F. Estudos demonstram que a proteína mais longa possui menor atividade transcricional quando comparada à proteína curta, podendo resultar em diminuição da funcionalidade do VDR, modificando assim o efeito determinado pela vitamina D.67
Alguns estudos se concentram na análise do polimorfismo do gene
VDR Taql, a fim de avaliar a possível associação desse polimorfismo e um aumento
da suscetibilidade individual para o desenvolvimento da periodontite associada com a perda de osso alveolar. Em particular, o genótipo TT e a presença do alelo T estão associados com a doença periodontal crônica em pacientes japoneses, chineses e caucasianos.71,72 Esses dados também estão de acordo com estudo realizado por
Martelli et al.73 que mostrou uma forte correlação entre o genótipo TT de indivíduos
italianos e periodontite crônica, mas também com a doença periodontal agressiva. Em um estudo transversal, Borges et al.74 examinaram a relação
entre o polimorfismo do VDR TaqI e a microbiota subgengival em adultos brasileiros com periodontite crônica, mostrando uma associação do genótipo TT com a doença sem observar qualquer associação entre o genótipo e o componente bacteriano.
Além disso, a deficiência de vitamina D provoca uma diminuição da densidade mineral óssea a nível esquelético, incluindo a maxila e a mandíbula, com um aumento da porosidade alveolar e reabsorção mais rápida do osso alveolar,
após a invasão de patógenos periodontais. Essas evidências podem explicar a maior suscetibilidade à periodontite quando os pacientes apresentam genótipo TT, levantando a hipótese de uma resposta do hospedeiro mais difícil a bactérias periodontopatogênicas e uma perda óssea acentuada. Em contradição, os estudos de Hennig et al.75 e Sun et al.57 encontraram uma associação entre o alelo t (alelo
raro) com um risco aumentado de desenvolver a doença periodontal agressiva em indivíduos Caucasianos e Chineses, respectivamente.
Um estudo mostrou que o suplemento de cálcio e de vitamina D utilizados para prevenir ou tratar a osteoporose ainda parece ter efeito benéfico sobre a retenção de dentes.76 Mais recentemente, Miley et al.77 mostraram, em um
estudo randomizado controlado de 5 anos, que indivíduos que tomaram cálcio e vitamina D perderam menos dentes do que os indivíduos do grupo controle.
Uma vez que a reabsorção de osso alveolar é uma das principais características da doença periodontal, é possível especular que os mediadores do metabolismo ósseo como o VDR e seus polimorfismos genéticos desempenham um papel na determinação da suscetibilidade individual para o desenvolvimento da periodontite. Por estas razões, o gene VDR pode ser considerado um candidato interessante para a investigação na prática periodontal, isoladamente ou em combinação com outros marcadores de inflamação, e a suplementação de vitamina D pode representar uma forma simples de regular a perda óssea na doença periodontal.56
A prática odontológica pode ter um papel importante na detecção precoce da osteoporose. Com o advento de novas técnicas de diagnóstico de triagem genética, é possível o dentista especialista identificar pacientes com doença periodontal com a densidade mineral óssea diminuída e, assim, encaminhar o paciente para uma avaliação da densidade mineral óssea. Pacientes com doença periodontal também diagnosticados com osteopenia / osteoporose devem ser tratados clinicamente de forma mais agressiva para eliminar os patógenos periodontais, devido aos riscos adicionais. Eventualmente, o dentista pode encaminhar o paciente para um endocrinologista para avaliar abordagens farmacológicas, como suplementos de vitamina D normais ou drogas mais específicas, como bisfosfonatos, calcitonina além de modificações no estilo de vida.56
densidade óssea do esqueleto e a saúde periodontal, também permite uma melhor colaboração dos pacientes na terapia periodontal, percebendo os periodontistas ou a equipe odontológica como participantes ativos na promoção da saúde geral dos pacientes.56
2.4 DOENÇA PERIODONTAL:POLIMORFISMOS DOS GENES CODIFICADORES DE CITOCINAS
Tem se observado grande interesse da comunidade científica internacional sobre o papel que os fatores genéticos podem desempenhar na doença periodontal e como os resultados seriam aplicados no prognóstico da doença.34 Uma linha de pesquisa atual tem sido à busca de fatores de risco
genéticos e marcadores, com alta sensibilidade e especificidade que poderia ser usado para identificar indivíduos com risco à periodontite.36
Os polimorfismos, preferencialmente investigados, são aqueles presentes em genes que participam da resposta imune do hospedeiro, da sinalização intracelular ou das vias enzimáticas de degradação tecidual. Nota-se uma tendência mundial em identificar marcadores genéticos de suscetibilidade não só à doença periodontal, mas a doenças importantes como câncer, diabetes, doenças inflamatórias e auto-imunes, como artrite, asma, lúpus eritematoso sistêmico, entre outras.34
Citocinas são proteínas solúveis de baixo peso molecular que agem como mensageiras, transmitindo sinais para outras células, e desta forma, atuam como reguladores positivos e negativos das respostas imunológica e inflamatória e da resposta de reparo do hospedeiro a lesões.78
A resposta inflamatória local nas periodontopatias é iniciada por fatores de virulência bacterianos, como os lipopolissacarídeos.79 Estes fatores
estimulam e amplificam a produção de várias citocinas pró-inflamatórias, dentre elas as interleucinas. Os mediadores inflamatórios possuem primordialmente papel protetor contra patógenos, mas podem induzir respostas imunes altamente destrutivas quando há alterações na concentração de citocinas e estimulação de receptores. A resposta inflamatória aumentada na doença periodontal eleva os níveis de citocinas, o que pode levar à severa perda de inserção e reabsorção óssea.80
patogênese da periodontite, pois a maioria dos genes que são considerados responsáveis pelo desenvolvimento de periodontite estão também relacionados à resposta imune. Estes incluem os genes que afetam a expressão da IL-1, IL-6,
TNF-, IL-10TNF-, E-selectinasTNF-, receptor de Fc-gamaTNF-, CD14TNF-, receptores Toll-like e VDR.36
Os primeiros polimorfismos investigados na doença periodontal foram nos genes que formam o “cluster” ou agrupamento da IL1 (IL1A, IL1B, IL1RN), além do gene do fator de necrose tumoral-alfa (TNF). Diferenças individuais nos níveis de interleucina relacionados aos diferentes graus de suscetibilidade à doença periodontal são atribuídas a polimorfismos nos genes de citocinas.34
A IL-1B pode ter participação na patogênese da periodontite, devido à suas propriedades pró-inflamatórias e de estimulação à reabsorção óssea (Figura 2). A frequência dos genótipos, incluindo o alelo 2 da IL1B +3953, está significantemente aumentada em pacientes com periodontite crônica severa comparado com aqueles com doença em estágios iniciais, sugerindo que o alelo 2 está correlacionado com um aumento na produção da IL-1B, predispondo o indivíduo a um aumento da gravidade da doença periodontal. Embora este mecanismo seja incerto, o alelo 2 da IL1B +3953 pode atuar de forma independente ou interagir epistaticamente com um suposto gene da doença para promover o desenvolvimento da forma mais grave da periodontite crônica nos casos onde existem outros fatores de risco para a doença.81
Figura 2 - Propriedades da Interleucina-1
Determinados polimorfismos no “cluster” da IL1 estão relacionados à doença periodontal em diferentes populações. Alguns alelos desses polimorfismos mostraram-se raros em algumas populações e prevalentes em outras, ou seja, apresentaram frequências alélicas diferentes em populações distintas. Portanto, apesar da importância da IL-1 na resposta imune do indivíduo, deve-se ter cautela ao utilizar seus polimorfismos como marcadores genéticos da doença periodontal.34
Polimorfismos genéticos na IL1 foram associados com um aumento nos níveis de mediadores inflamatórios e várias doenças inflamatórias, como a doença periodontal. Os polimorfismos genéticos da IL1A (-889), IL1A (+4845), e
IL1B (+3954) foram associados com a periodontite crônica em caucasianos. Uma
revisão sistemática e meta-análise foram conduzidas por Karimbux et al.82 na
tentativa de esclarecer se variações genéticas na IL1 estão associadas com fenótipos clínicos bem definidos de periodontite crônica em pacientes brancos. A meta-análise encontrou efeitos significativos para duas variações genéticas individuais, IL1A (odds ratio = 1.48), IL1B (odds ratio = 1.54) e por um genótipo composto que combina os alelos raros em cada locus (odds ratio = 1.51). Concluíram que variações genéticas nos genes IL1A e IL1B contribuem significativamente para a periodontite crônica em caucasianos.
A IL-6 é bastante investigada por apresentar funções imunológicas importantes, como, estimular a diferenciação ou maturação de células da linhagem B a secretarem imunoglobulinas. Tem importante papel na proliferação ou ativação de macrófagos e células T, estimulação da hematopoiese; diferenciação neural,83
estimulador da diferenciação dos osteoclastos e inibidor da formação óssea (Figura
Figura 3 - Propriedades da Interleucina-6
Fonte: Da autora (2015).
Na periodontite, a IL-6 é expressa por uma variedade de células na lesão periodontal e, em sinergia com a IL-1, atua no aumento da reabsorção óssea.85,86 Foi demonstrado que elevados níveis de IL-1B e IL-6 são induzidos por
patógenos periodontais e são correlacionados com a contínua destruição de tecido observada na periodontite.87
A literatura evidencia associações de alta concentração de IL-6 no soro e em outros fluidos biológicos com morbidades representadas por doenças inflamatórias crônicas, tais como artrite reumatoide e osteoporose. Por esta razão, a IL-6 é considerada um dos principais mediadores da resposta inflamatória em processos crônicos e infecções. Devido a estas características, pesquisadores sugeriram que a IL-6 poderia ser utilizada como indicador de doença periodontal.88
Na atualidade, acredita-se que polimorfismos na região promotora do gene IL6 estão relacionados com alterações na produção deste mediador. Sugere-se que essas variações genéticas possam explicar a suscetibilidade a doenças, uma vez que podem vir acompanhadas pela elevação ou diminuição dos níveis séricos da substância. O polimorfismo de nucleotídeo único na posição -174, com a mudança de bases G (guanina) para C (citosina) afeta a transcrição do gene, o que acarreta alteração nos níveis plasmáticos da IL-6.88
Em um estudo com uma população caucasiana brasileira, indivíduos com o genótipo GG do polimorfismo da IL6 na região -174 foram estatisticamente associados ao aumento da suscetibilidade à doença periodontal. Os pesquisadores
acreditam que a presença do alelo raro C confere fator de proteção contra a progressão da doença, já que resulta em menor expressão da IL-6 após estímulo da resposta inflamatória.88
Resultados similares foram encontrados por Tervonen et al.80, que
evidenciaram uma relação entre sinais clínicos da doença periodontal e a presença de polimorfismo no gene da IL6 na posição -174, considerando o genótipo homozigoto GG.
Análogo a outras doenças complexas, foi estimado que para periodontite, entre 10 e 20 genes modificadores da doença podem estar envolvidos. No entanto, é importante perceber que o número e o tipo de genes modificadores da doença para a mesma condição podem não ser iguais para diferentes populações étnicas e eles também são influenciados por fatores ambientais.22
Uma extensa revisão de polimorfismos genéticos na periodontite crônica foi realizada por Laine et al.20 que analisaram estudos para os polimorfismos
no cluster da IL1; no cluster do TNF; nos genes IL4 e IL4RA; nos genes IL6 e IL6R; nos genes IL10; nos genes FcR; nos genes VDR; nos genes de receptores de reconhecimento de padrões, tais como CD14; e uma série de genes diversos. Muitas vezes, as associações encontradas são restritas a grupos raciais ou étnicos específicos. No geral, as evidências apontam para polimorfismos nos genes IL1, IL6,
IL10, VDR e CD14 desempenhando um papel na periodontite crônica, mas a maioria
destas associações é restrita a determinadas populações. Os pesquisadores concluíram que não existe ainda nenhum polimorfismo genético que foi definitivamente demonstrado ser um fator de risco para a suscetibilidade à periodontite crônica em uma população amplamente representativa.
É importante identificar o maior número possível de polimorfismos genéticos e suas frequências nas populações em todo o mundo para que se possa atribuir a um determinado polimorfismo, com segurança, uma porcentagem de suscetibilidade ou severidade à doença. Somente no futuro, e baseado no conhecimento das frequências dos alelos nas populações, é que um determinado polimorfismo poderia ser utilizado como marcador genético da doença periodontal.34
Além de conseguir uma melhor compreensão do processo da doença, tais polimorfismos podem ser usados como marcadores de diagnóstico ou de prognóstico.89
fenotípicas estáveis de grupos de pacientes com periodontite pode levar à identificação de biomarcadores moleculares para serem incorporados em perfis de riscos individuais, além de ajudar a definir as bases para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento, permitindo aos profissionais personalizar o tratamento adequadamente.64,90,91
Informações do DNA combinadas com informações clínicas se tornam uma necessidade para o tratamento periodontal altamente individualizado. No futuro, pode ser possível usar essas informações para ajustar a resposta do hospedeiro à infecção microbiana, inibindo ao máximo o micro-organismo e minimizando os danos inflamatórios.39,92
É importante saber a biologia por trás dos procedimentos, visto que o papel do cirurgião-dentista já não se limita a ser apenas cuidador, deve-se tentar compreender as características biológicas de cada paciente que ditam a progressão da doença para destinar um tratamento de forma eficiente, para que o resultado clínico possa ser previsto, gerenciando posteriormente melhor os pacientes.39 De
acordo com Kim et al.34, poderia ser confeccionado um “kit”, talvez adaptado para
uma determinada população, para detectar indivíduos com genótipo de alto risco para a doença, auxiliando desta forma na prevenção da doença periodontal.
Razzouk e Termechi (2013) mencionaram o termo terapia periodontal individualizada como o próximo conceito de tratamento para um resultado clínico avançado.39 Até o momento, estudos genéticos de associação de
doenças estimam que haja centenas de genes associados com a periodontite. Todos esses recursos têm facilitado a compreensão da inflamação na tentativa de estratificar pacientes de acordo com o risco para uma doença e tornaram-se necessárias para programar a medicina periodontal individualizada podendo ser vista como terapia sob medida com base nas interações entre fatores genéticos, clínicos e ambientais que afetam um indivíduo.91
Portanto, é imperativo que o cirurgião-dentista olhe além da cavidade oral, para fatores que potencialmente favorecem uma alteração, a fim de ajudar os pacientes a alcançar o objetivo comum de prevenção ou tratamento da doença periodontal, e assim, possivelmente, melhorar a saúde de forma geral.35
3 PROPOSIÇÃO
3.1 PROPOSIÇÃO GERAL
Investigar a associação entre polimorfismos dos genes IL1A, IL1B,
IL6 e VDR e a doença periodontal, em idosos fisicamente independentes com e sem
osteoporose, cadastrados nas Unidades Básicas de Saúde do município de Londrina, Pr.
3.2 PROPOSIÇÕES ESPECÍFICAS
- Determinar a prevalência e gravidade da doença periodontal em idosos com e sem osteoporose fisicamente independentes;
- Verificar as frequências alélicas e genotípicas de polimorfismos nos genes IL1A, IL1B, IL6 e VDR na população de estudo;
- Avaliar a associação entre os polimorfismos desses genes e a doença periodontal em idosos com e sem osteoporose.
4 ARTICLE 1
ANALYSIS OF THE ASSOCIATION BETWEEN POLYMORPHISMS IN THE IL1 GENE, PERIODONTITIS AND OSTEOPOROSIS IN ELDERLY INDIVIDUALS IN
BRAZIL
(Submitted to the “Archives of Oral Biology”)
Running title: Genetic, osteoporosis and periodontitis
M. B. B. P. Pedriali1, S. K. Moura1, S. M. Maciel1, R.C. Poli-Frederico2
1 Department of Restorative Dentistry, Faculty of Dentistry, Norte do Paraná
University, Londrina, PR, Brazil
2 MS, PhD, Department of Genetics and Molecular Biology, Faculty of Dentistry,
Norte do Paraná University, Londrina, PR, Brazil
CORRESPONDING AUTHOR
Regina Célia Poli-Frederico.
Universidade Norte do Paraná, Faculdade de Odontologia. Rua Marselha 183, Jardim Piza, Londrina, Pr, Brasil. Cep 86041-120.
Phone: +55-43-3371-7820 Fax: +55-43-3371-7741.
email: reginafrederico@yahoo.com.br
Abstract
Objective: Polymorphisms in the IL1 gene have an important role in the pathogenesis of periodontal disease, may cause both quantitative and qualitative changes in the coded protein, and may result in alteration to the proteins or in its expression possibly culminating in alterations to the immune system. This study aimed to investigate the prevalence of the polymorphism in the IL1A -889 and IL1B +3954 genes, as well as their association with periodontal disease, in a sample of Brazilians elderly with and without osteoporosis.
Design: A sample of 145 individuals was grouped according to the presence of periodontal disease and the presence of osteopenia or osteoporosis. DNA was extracted from blood, and PCR-RFLP was used to identify the polymorphism: IL1A C-889T (rs1800587) and IL-1B C+3954T (rs1143634). Differences in the genotype/allele frequencies were evaluated using the Chi-squared test (p<0.05). For the risk analysis of the alleles, genotypes and haplotypes, the Odds Ratio (OR) was calculated, with 95% confidence intervals.
Results: In the group with periodontal disease, no significant difference was observed in the distribution of the genotypes between patients without osteoporosis and patients with osteopenia and osteoporosis for the IL1A -889 polymorphism. A significant association between the genotypic frequency in the IL1B gene in patients with osteoporosis in the group with periodontal disease where 50% of individuals with the CT genotype had osteoporosis and periodontal disease.
Conclusion: Genotype CT of IL1B +3954 polymorphism may be a risk factor for periodontal disease and osteoporosis in a sample of elderly Brazilians.
Keywords: Periodontal disease, genetic polymorphism, osteoporosis, elderly, interleukin.
Introduction
Periodontal disease has a multifactorial etiology related to an inflammatory process that leads to the destruction of the tooth’s supporting tissue, being regarded as the pathological manifestation of the host’s response to the bacterial challenge of the biofilm at the tooth/gum interface (Bodet, Chandad, & Grenier, 2006; Sanz & Van Winkelhoff, 2011). With the buildup of biofilm on the tooth surface, the cells of the periodontium come into contact with bacterial products and produce proinflammatory cytokines, including interleukins and other chemical mediators of inflammation that initiate inflammatory response inside the periodontal tissue (Liljenberg, Lindhe, Berglundh, Dahlén, & Jonsson, 1994). Basically, these cytokines have the role of protecting against pathogens, but they may become highly destructive when the concentration of these mediators is altered (Tervonen, Raunio, Knuuttila, & Karttunen, 2007).
Interleukin-1 (IL-1) is an important inflammatory mediator in a variety of chronic diseases. This cytokine is an activator of the first chemotactic cytokines, as well as of the expression of adhesion molecules which facilitate the migration of leukocytes into the tissue (Moreira et al., 2005). It is a protein which appears in two main forms, alpha (IL-1A) and beta (IL-1B), and is produced by various cell types such as macrophages, monocytes, polymorphonuclear leukocytes, fibroblasts, epithelial and endothelial cells and also osteoblasts, in response to bacterial antigens (Grigoriadou, Koutayas, Madianos, & Strub, 2010; Graves & Cochran, 2003).Studies have suggested that IL-1 plays a role in the initiation and progression of periodontitis, relating it to the degradation of the extracellular and bone matrix of the periodontal tissue. Indeed high levels of IL-1B in the tissue and gingival fluid is associated with periodontitis (Kinane, Shiba, & Hart, 2005). IL-1 is also known for being a stimulator of osteoclastic activity in bone resorption (Lang et al., 2000). IL-1, therefore, is a proinflammatory cytokine that is intimately connected with all inflammatory reactions, as well as the immune or healing response and any uncontrolled variation in its level may have far-reaching consequences, not limited to periodontal disease (Kinane, Shiba, & Hart, 2005). Therefore, polymorphisms in the IL1 gene must have an important role in the pathogenesis of periodontal disease as these genetic alterations may cause both, quantitative and qualitative changes in the coded protein and may result in alteration to the proteins (cytokines) or in its expression, possibly culminating
in alterations to the immune system and may be determinants in the evolution of periodontal disease (Loos, John, & Laine, 2005).
The genetic polymorphism in position -889 of the IL1A gene is related to the substitution of cytosine with thymine (C/T), and the presence of the allele T is associated with an almost fourfold increase in the expression of the protein IL-1A (Shirodaria, Smith, McKay, Kennett, & Hughes, 2000). Moreover, the genetic polymorphism at position (+3954) of gene IL1B is associated with an increased production of this cytokine (Moreira et al., 2005). The genotype frequency, including allele T of IL1B +3954, is significantly higher in patients with severe, chronic periodontitis when compared to those in the early stages of the disease, suggesting that the allele T is related to an increase in the production of IL-1B, predisposing the individual to a greater severity of periodontal disease (Gore, Sandrers, Pandey, Palesch, & Galbraith, 1998).
It should be pointed out that studies have called attention to the possible link between osteoporosis and periodontal disease (Martínez-Maestre, González-Cejudo, Machuca, Torrejón, & Castelo-Branco, 2010). The supposition of increased risk of periodontal disease in the presence of osteoporosis is based on the assumption that osteoporosis results in a loss of bone density throughout the whole body, including the maxilla and mandibular. Low bone density leads to an increase in alveolar porosity, an altered trabecular pattern and faster alveolar bone resorption after infection with periodontal pathogens. Another explanation derives from the fact that systemic factors such as increased release of IL-1 and IL-6 affecting bone metabolism may also modify the local tissue response to a periodontal infection (Stabholz, Soskolne, & Shapira, 2010).
Up to now, the majority of studies have related periodontal disease to osteoporosis or genetic polymorphisms, as well as the association of osteoporosis and genetic polymorphisms in different populations. Amongst the main polymorphisms that have been investigated are those of the genes of IL1A and IL1B, involving bone density, for both periodontal disease and osteoporosis, though there have been no studies relating the three conditions (periodontal disease, genetic polymorphisms and osteoporosis). Therefore, the aim of this study is to investigate the prevalence of the polymorphism in the IL1A -889 and IL1B +3954 genes, as well as their association with periodontal disease, in a sample of elderly Brazilians with and without osteoporosis.
Materials and methods
Selection of individuals
A sample of individuals aged 60 or above, from both sexes, was selected for the study based on a cross-sectional study on Aging and Longevity (EELO Project) conducted at the Norte do Paraná University, Londrina/Paraná, Brazil (approved by the UNOPAR Research Ethics Committee, PP0070/09). Of the 323 elderly who comply with the inclusion criteria, 42 were not found, 28 declined, 9 died and 99 were edentulous. Thus, the present study sample consisted of 145 elderly who agreed to take the examination of bone densitometry. The patients hail from the southern region of Brazil and all participants signed the Free and Informed Consent Form.
Eligibility criteria were as follows: aged 60 years and over, of both genders, who were living independently and classified at level 3 or 4 as proposed by Spirduso (2005). This classification evaluates the independence level of the elderly, with level 1 indicating a lack of self-mobility and level 5 indicating athletes. Elderly people who had any illness (other than osteoporosis) or limitation that would prevent the testing, such as physical or mental disabilities were excluded from the sample.
The diagnosis and classification of periodontal disease were carried out by way of a physical examination that included an analysis of clinical parameters and medical and dental histories. The oral cavity was divided into sextants and was performed the examination of the indexes teeth: 16:17; 11; 26 and 27; 36 and 37; 31; 46 and 47. A sextant was only examined if there were two or more teeth present. In the absence of indexes teeth, all the remaining teeth that sextant were examined. The clinical parameters included periodontal probing and the evaluation of clinical attachment loss (CAL). The CAL were recorded at six points around each tooth.
The periodontal condition of each individual was based on the quantity of clinical attachment loss. Individuals with CAL ≤ 3 mm were regarded as healthy and those with a CAL ≥ 4 mm were considered to be suffering from periodontitis.
All the individuals underwent a bone densitometry examination of the femur and lumbar spine (L1-L4) using a dual-energy densitometer (GE-PRODIGY PRIMO;
X-ray; fan beam). The individuals were sorted into three groups: control (above -1.0 Sd), osteopenic (-1.0 to -2.5 Sd) and osteoporotic (below -2.5 Sd), observing criteria advocated by the World Health Organization (WHO).
Collection and extraction of DNA
Peripheral blood specimens were collected in 6% Ethylenediaminetetraacetic acid vacuum tubes. The extraction of the DNA was performed using the PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen, Foster City, USA), in accordance with the manufacturer’s instructions. The extracted DNA was stored in a freezer at -80ºC before polymorphism analyses.
The evaluation of DNA quality and quantity was carried out by analyzing absorbance in a spectrophotometer (NanoDrop 2000 – Thermo Scientific, USA) at 260 nm and 280 nm. Subsequently the DNA was diluted in Milli-Q® ultrapure water
for a final concentration of 100 ng/µL.
Identification of genetic polymorphisms
PCR-RFLP conditions for the gene IL1A C-889T (rs1800587)
The primers used in the PCR to amplify the samples of genomic DNA were as follows: AAGCTTGTTCTACCACCTGAACTAGGC-3’ (forward) and 5’-TTACATATGAGCCTTCCATG-3’ (reverse) (Nicklin, Weith, & Duff, 1994). The PCR mixture consisted of a final volume of 50 L containing 75 mM Tris-HCl, 20 mM (NH4)2SO4, 1.5 mM of MgCl2, 0.2 mM of dNTPs, 20 ρM of each primer, 1 U of Taq
DNA polymerase (Invitrogen) and 2 L of DNA solution. The amplification conditions consisted of 94ºC for 30s, followed by 45 cycles of 94ºC for 30s, 56ºC for 35s and 72ºC for 30s. After amplification, 10 L of the PCR product were analyzed by electrophoresis in agarose gel (1%). The gel was then stained using SYBR Safe (Invitrogen) and the synthesized fragments were viewed under ultraviolet light. The size of the product amplified by PCR was estimated based on the electrophoretic migration of the product in relation to the 100 bp DNA Ladder marker (Invitrogen). For the polymorphism IL1A, 5 U of the Ncol restriction enzyme were used and the products of digestion obtained were: allele C (83 + 16 bp) and allele T (99 bp). The product of digestion was viewed via polyacrylamide gel electrophoresis at 10% stained by silver nitrate.
PCR conditions for gene IL1B C+3954T (rs1143634)
The primers used in the PCR to amplify the samples of genomic DNA were as follows: 5’-CTCAGGTGTCCTCGAAGAAATCAAA-3’ (forward) and 5’-GCTTTTTTGCTGTGAGTCCCG-3’ (reverse) (Kaarthikeyan et al., 2009). The PCR mixture consisted of a final volume of 50 L containing 75 mM Tris-HCl, 20 mM (NH4)2SO4, 5 mM of MgCl2, 0.2 mM of dNTPs, 20 ρM of each primer, 0.4 L of Taq
DNA polymerase (Invitrogen) and 2 L of DNA solution. The amplification conditions consisted of 94ºC for 30s, followed by 35 cycles of 94ºC for 30s, 55ºC for 35s and 72ºC for 30s. After amplification, 10 L of the PCR product were analyzed by electrophoresis in agarose gel (2%). The gel was then stained using SYBR Safe (Invitrogen) and the synthesized fragments were viewed under ultraviolet light. The size of the product amplified by PCR was estimated based on the electrophoretic migration of the product in relation to the 100 bp DNA Ladder marker (Invitrogen). For the polymorphism IL1B, 5 U of the TaqI restriction enzyme were used and the products of digestion obtained were: allele C (97 + 85 + 12 bp) and allele T (182 + 12 bp). The product of digestion was viewed via polyacrylamide gel electrophoresis at 10% stained by silver nitrate.
Statistical analysis
The differences in the genotypic and allelic frequencies (categorical variables) were evaluated using the chi-squared test (X2), with Yates correction or
Fisher’s exact test. The differences were deemed to be significant when p <0.05. The physical proximity of the polymorphisms explains the simultaneous analysis of the haplotypes. The ARLEQUIN 3.0 (Arlequin, Switzerland) suite of programs was used to calculate haplotype frequencies, Hardy-Weinberg equilibrium and disequilibrium of linkage. . The statistical analysis was performed using the application BioStat 2.0 for Windows (AnalystSoft, Canada), SPSS 10.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL), and the ARLEQUIN 3.0 statistical package (Arlequin, Switzerland).
Results
The demographic distribution, genotypic and allelic frequencies of the IL1A and IL1B genes, periodontal disease and bone mineral density (BMD) of the elderly individuals are displayed in Table 1.
The mean age of the elderly individuals was 67.95 (± 5.047) years, with a predominance of ethnic whites (62.1%) and those who have never smoked (58.6%). A total of 58.6% of the sample were carriers of the CT genotype for the IL1A gene and 55.2% harbored the CC genotype of the IL1B gene. The majority of the elderly presented with periodontitis (64.1%) but did not have osteoporosis (56.6%).
The frequency distribution of the genotypes and alleles for the polymorphisms in the IL1A -889 and IL1B +3954 genes, according to the presence or absence of periodontal disease in individuals with or without osteoporosis, is displayed in Table 2.
In the group with periodontal disease, no statistically significant difference was observed in the distribution of the genotypes between patients without osteoporosis, patients with osteopenia and patients with osteoporosis for the polymorphism in the IL1A -889 gene (p=0.22), nor was any statistically significant association observed between the frequency of alleles for the same polymorphism (p= 0.39).
There was a significant association between the genotypic frequency in the
IL1B +3954 gene in patients with osteoporosis in the group with periodontal disease
(2= 11.764; p= 0.02). A total of 50% of individuals who were carriers of the CT
genotype presented with osteoporosis and periodontal disease, while 60% of those elderly individuals harboring the CC genotype were found to be free of osteoporosis. No significant association was observed, however, between allelic frequency, periodontal disease and osteoporosis (p= 0.71).
In the group with periodontal disease, there was no significant association in the haplotype frequency consisting of at least one allele T of the IL1A -889 gene and an allele T of the IL1B +3954 gene, between patients with periodontal disease and without OP and those with OPE or OP (p= 0.91).
