2.8 Etude d’enzymes mutantes de la topo 2 de S. cerevisiae
2.8.2 Activité du mutant E66Q/WT en molécule unique
Nous avons réalisé des expériences avec le mutant hétérodimérique E66Q/WT dans les mêmes conditions de force et d’ATP que précédemment. La figure 2.12 montre à gauche les signaux obtenus en suivant l’extension de molécules super-enroulées de +50 tours .
La relaxation se fait par sauts isolés dont la taille est un multiple de 100 nm ( la grille a une échelle de 100 nm), ce qui correspond à la relaxation de deux boucles plectonémiques (c’est-à-dire un cycle enzymatique). Les sauts les plus fréquents correspondent à un cycle enzymatique, mais il n’est pas rare d’observer une séquence rapide de 2 ou plusieurs cycles enzymatiques.
En comparaison, à droite sur la figure 2.12, nous avons reporté des relaxations typiques obtenues avec l’enzyme native WT/WT (fournie par James Berger). La relaxation (d’environ 50 tours) est cette fois très processive, comme dans le cas de la topoisomérase II de drosophile [122]. La vitesse de réaction est d’environ 1.5 cycles par seconde.
L’analyse de la taille des bouffées enzymatiques permet de tracer la distribution de processivité des enzymes E66Q/WT et WT/WT. Pour l’analyse nous avons toléré les pauses jusqu’à 5 secondes à l’intérieur d’une relaxation. La figure 2.13 montre les distributions de processivité intégrées obtenues pour E66Q/WT (300 événements) et WT/WT (une vingtaine de traces).
L’ajustement d’une exponentielle donne les processivités moyennes : 1.9 cycles et 9.8 cycles , res- pectivement pour le mutant et l’enzyme native. Notons cependant que la processivité de l’enzyme native est certainement sous-estimée par le fait que la taille du substrat limite la relaxation par l’en- zyme. Il faudrait offrir à l’enzyme des substrats beaucoup plus grand , ou bien enrouler la molécule au fur et à mesure de la relaxation , pour obtenir une réelle estimation de la processivité.
FIG. 2.12 –Activité de l’enzyme E66Q/WT et comparaison avec l’enzyme WT/WT. A gauche : relaxa- tion typique par l’enzyme E66Q/WT (concentration 0.4 nM) à 0.7 pN (la pente des courbes extension rotation est alors de 49 nm/tour). L’acquisition est faite à 25 Hz et filtrée passe-bas à 1 Hz (courbes rouges). On dis- tingue clairement des cycles uniques et des événements processifs de deux cycles. Les événements plus longs sont plus rares mais pas inexistants. A droite : même expérience avec l’enzyme native WT/WT. La relaxation, souvent totale, est beaucoup plus processive.
Ces résultats montrent que l’enzyme E66Q/WT est également capable de relaxation par bouffées, mais avec une probabilité d’arrêt beaucoup plus importante. Il semble clair d’après les expériences de [6] que l’hydrolyse du seul ATP hydrolysable soit utilisé pour le passage de brin. Compte tenu de la constante d’hydrolyse du deuxième ATP , il parait peu probable que celui-ci ait le temps d’être hydrolysé avant le début d’un autre cycle enzymatique, lors des événements où l’enzyme effectue plusieurs cycles de suite.
Dans ce cas, le fait que le deuxième ATP ne soit pas hydrolysable pourrait entraîner que l’ADP produit par la première hydrolyse doive être libéré pour permettre l’accrochage d’un autre ATP dont l’hydrolyse permettra le réamorçage du cycle. Cependant, Bairdet al.doutent de la possibilité d’un accrochage d’une tierce molécule au cours du cycle[6]. Il est également possible d’envisager que l’enzyme ait plusieurs chemins réactionnels possibles pour effectuer son cycle, dont l’un nécessite l’hydrolyse d’un ATP unique (pour le passage de brin) et pourrait facilement se réamorcer.
Cependant, dans tous les cas, il est difficile de comprendre que l’enzyme soit capable de réinitier un cycle , alors que l’ATP qui n’a pas été hydrolysé (et qui reste accroché) continue à fermer la porte N-terminal de l’enzyme.
FIG. 2.13 –Distribution de probabilité intégrée de la processivité du mutant E66Q/WT (en bleu) et de l’enzyme native WT/WT (en rouge).Les ajustements exponentiels donnent une processivité moyenne de 1.9 cycles pour le mutant (300 événements) contre 9.8 pour le natif (20 événements) .
Chapitre 3
Reconnaissance chirale de l’ADN par la topoisomérase 4
La topoisomérase 4 se différencie des topoisomérases eucaryotes par sa capacité à reconnaître un susbstrat spécifique : des expériences d’ensemble et de molécule unique ont montré qu’elle relaxe préférentiellement les supertours (+) par rapport aux supertours (-). Cette apparente chiralité dans le fonctionnement de la topo 4 pose la question cruciale du mécanisme utilisé pour opérer cette reconnaissance. L’objet de ce chapitre est d’abord de présenter les différentes modèles qui permettent d’expliquer le comportement asymétrique de l’enzyme. Ensuite, nous nous attachons à tester les différentes hypothèses, pour tenter de démontrer que c’est l’angle entre deux segments d’ADN qui conditionne l’action de l’enzyme.
La section 3.2, qui relate les propriétés d’accrochage de l’enzyme sur l’ADN en absence d’ATP, montre que l’enzyme n’effectue pas (ou peu) de discrimination lors de son accrochage. Ces expé- riences nous permettent de tirer des informations quantitatives sur l’accrochage de l’enzyme, comme la variation d’énergie libre d’accrochage, et la constante de dissociation. Dans la section 3.3, nous montrons que l’observation de la chiralité de l’enzyme est confirmée par les expériences de décaté- nation d’ADN, avec certaines différences que nous tentons d’expliquer. Ces expériences confirment également que les caténanes constituent un excellent substrat pour les topoisomérases, au même titre que les plectonèmes. Elles excluent également un modèle de reconnaissance lié à la torsion dans la molécule d’ADN. Enfin, nous proposons, dans la section 3.4, la validation directe du modèle de reconnaissance de l’angle dans un croisement d’ADN par l’enzyme.