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I. A. Approche par transformation transitoire in planta
C Ch C h ha a ap p pi i it t tr r re e e 4 4 4 : : : E E Et t tu u ud d de e e f f fo o o n n n c c c t t t i i i o o o n n n n n n e el e l ll l le e e d d d e es e s s p pr p r ro o ot t té é éi i in n n e e e s s s N NI N I IP P P
Les protéines NIP ont été identifiées par test double hybride en utilisant comme appât l’ARN polymérase SoRPOT ;2. Nous avons vu dans le chapitre 1 que les protéines AtNIP1 et AtNIP2 pourraient comporter une séquence d’import vers un organite. En outre, cette famille présente un domaine d’interaction protéine-protéine de type RING Finger. Ces deux informations nous conduisent tout d’abord à contrôler si les protéines NIP sont effectivement retrouvées dans les organites. Puis, nous consacrerons une partie de cette étude à vérifier l’interaction des protéines NIP et NEP par une approche différente, en utilisant les anticorps caractérisés au chapitre 2. Ces expériences biochimiques nous permettent d’établir un modèle structural et de présenter l’organisation des protéines étudiées. Nous finirons en présentant la production et les prémisses d’analyse des mutants affectés dans l’expression des gènes AtNIP afin de comprendre le rôle des protéines correspondantes.
rapporteur. Ce dernier, s’il est exprimé, permet d’observer la répartition de la protéine hybride dans la cellule transformée. Le rapporteur utilisé ici est la protéine fluorescente eYFP (« enhanced Yellow Fluorescent Protein », version 4, CLONETECH).
I.A.1 Constructions des vecteurs binaires recombinants
Le site de coupure d’une séquence d’import ne pouvant être prédit de façon certaine par un logiciel, nous avons préféré produire plusieurs constructions AtNIP respectant l’organisation structurale des protéines. Afin de tester le potentiel d’adressage des régions N- terminales des protéines NIP, des constructions tronquées des ADNc NIP, ainsi que l’ADNc entier, ont éte fusionnées au gène eYFP. Finalement, elles sont introduites dans le vecteur binaire EL103 au niveau des sites des restriction 5’BamHI / 3’XbaI, situés en amont de l’ADNc eYFP cloné en 5’XbaI / 3’SstI, afin de générer une fusion traductionnelle au niveau du messager hybride (annexes 5).
Pour cela, les différents fragments AtNIP sont amplifiées par PCR à partir des vecteurs pBluescript (annexes 5), contenant les ADNc entiers correspondants. Les oligonucléotides utilisés comprennent un site de restriction adapté à leur extrémité 5’ (séquences : voir annexe 2). Ils sont, tout d’abord, introduits et amplifiés dans le vecteur pBluescript. Les séquences clonées sont contrôlées par séquençage automatique à partir des amorces universelles sur les promoteurs T7 et T3 du plasmide, avant l’insertion finale dans EL103. La fusion est également vérifiée par séquençage en utilisant des amorces 5’ pour les fragments NIP partiels (constructions A, B et C, Figure 28) ou une amorce interne pour les ADNc NIP entiers (construction D, Figure 28). Les différentes étapes de clonage sont réalisées chez E. coli avant d’introduire les plasmides binaires recombinants dans Agrobacterium tumefaciens.
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Figure 28 : Cartes des constructions hybrides AtNIP ::eYFP produites
A à D : cartes des fragments ADN-T comportant un ADNc AtNIP1, AtNIP2 et AtNIP3. E, F et G : cartes des ADN-T contrôles de l’efficacité de transfection et comme profils de localisation subcellulaire témoin (fournies par Dominique Pontier). P35S : promoteur 35s CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) ; Ter Nos : terminateur Nopaline Synthase. En vert : région correspondant à l’extrémité N-terminale; en marron : TM1, TM2 et TM3, hélices transmembranaires 1, 2 et 3 ; en bleu : région RING finger ; PT RECA : peptide de transit de la protéine RECA ; NLS : séquence de localisation nucléaire.
Un premier jeu de constructions testées (Figure 28A) correspond à une courte région 5’ des ADNc codant pour un peptide de transit putatif situé juste en amont de la première hélice transmembranaire (Figure 13). Des fragments plus longs comprenant également la première hélice transmembranaire prédite par le logiciel Tmpred sont également produits et fusionnés au gène rapporteur (Figure 28). Un dernier lot de constructions partielles inclut la séquence codant l’intégralité des domaines transmembranaires (Figure 28C). Les ADNc NIP complets sont également introduits dans le vecteur EL103 en amont de eYFP (Figure 28D).
Nous disposons de trois constructions contrôles dans le vecteur binaire EL103 (Figure 28, E, F et G), bien caractérisées et fournies par Dominique Pontier (Matériel et Méthodes), exploitant des régions ou motifs connus, nous permettant d’établir des profil témoins en microscopie à fluorescence ainsi que de tester l’efficacité de la transformation. Ainsi, la construction E permet d’importer la GFP dans les chloroplastes (Figures 28E et 28A) ; les noyaux sont observés en flanquant une séquence de localisation nucléaire à l’extrémité C- terminale (NLS) du rapporteur eYFP (Figures 28F et 28B) ; la protéine eYFP seule se répartit dans le cytosol et le noyau (Figures 28G et 28C).
E
F
G A
B
C
D
YFP
GFP
YFP NLS
YFP NLSNLS
P35s CaMV ΩΩΩΩ N-terter YFPYFP NosTer
P35s CaMV ΩΩΩΩ N-terter TM1 YFP
P35s CaMV ΩΩΩΩ N-terN-terter TM1TM1TM1 TM2TM2TM2 TM3TM3TM3 YFPYFPYFPYFP
TM1 TM2 TM3 RF YFP
N-ter TM1 TM2 TM3 RFRF YFPYFP
P35s CaMV ΩΩΩΩ
Ter Nos
Ter Nos
Ter Nos
Ter Nos
Ter Nos
Ter Nos P35s CaMV ΩΩΩΩ
P35s CaMV ΩΩΩΩ
P35s CaMV ΩΩΩΩ
PT RECA E
F
G A
B
C
D
YFP YFP
GFP
NLS
YFP NLS
YFP NLSNLS
P35s CaMV ΩΩΩΩ N-terN-terterter YFPYFPYFPYFP NosTer
P35s CaMV ΩΩΩΩ N-terter TM1 YFP
P35s CaMV ΩΩΩΩ N-terN-terter TM1TM1TM1 TM2TM2TM2 TM3TM3TM3 YFPYFPYFPYFPYFPYFP
TM1 TM2 TM3 RFRF YFPYFP N-ter TM1 TM2 TM3 RFRF YFPYFP
P35s CaMV ΩΩΩΩ P35s CaMV ΩΩΩΩ
Ter Nos
Ter Nos
Ter Nos
Ter Nos
Ter Nos
Ter Nos P35s CaMV ΩΩΩΩ
P35s CaMV ΩΩΩΩ
P35s CaMV ΩΩΩΩ P35s CaMV ΩΩΩΩ
P35s CaMV ΩΩΩΩ P35s CaMV ΩΩΩΩ
PT RECA
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I.A.2 Détection des protéines hybrides AtNIP::eYFP in planta
Les figures 29 et 30 présentent les images confocales observées au microscope à fluorescence, de feuilles de tabac transformées et exprimant ces constructions témoins. Les jeunes feuilles de tabac (cultivar Samsun NN) sont transformées par agroinfiltration (Matériels et Méthodes) et les zones infiltrées observées au microscope à fluorescence 48h plus tard. Les bactéries entrent grâce aux stomates de l’épiderme inférieure, par conséquent, ce sont principalement les cellules épidermiques qui sont transformées par cette méthode.
Elles sont identifiées par une forme caractéristique en « puzzle », observée sur la figure 29C.
Ces observations, répétées à chaque nouvel essai de transformation en parallèles des clones hybrides AtNIP, montrent de façon reproductible les images attendues (chloroplastes sur figure 29A ; le noyau sur la figure 29B ; et le cytosol et noyau en 29C). La technique de transformation transitoire est donc validée. En revanche il ne nous a pas été possible d’observer une accumulation significative d’un signal dans un compartiment précis en utilisant les constructions AtNIP ::eYFP présentées sur la figure 30.
Les images confocales présentées dans la figure 30 représentent les résultats obtenus en utilisant les constructions A et C (Figure 28) respectivement pour AtNip2 et AtNip3. La fluorescence de la GFP co-localise avec l’autofluorescence de la chlorophylle (Figure 30A).
Cependant, le signal émis est faible par rapport à ce qui est habituellement obtenu lors de transformations transitoires. La construction C AtNip3, comprenant les trois hélices transmembranaires, présente un profil indéterminé (Figure 30B) dans une cellule comportant peu ou pas de chloroplastes (Figure 30B, volet (b)). Nous ne pensons pas qu’il s’agisse de mitochondries car la surface est finement délimitée et nous n’observons aucun filament.
Nous avons finalement décidé de revenir à un système homologue pour tenter de déterminer la localisation subcellulaire des protéines NIP. Des transformations transitoires ont été effectuées sur de très jeunes plantules d’Arabidopsis (voir Matériels et Méthodes), cultivées en milieu liquide pendant 48h. Les plantules sont mises en présence d’un petit volume de suspension d’agrobactéries pendant 30 à 48h sur une unité de filtration, en chambre de culture. Elles sont alors observées au microscope à fluorescence. Des constructions témoins identiques à celles utilisées plus haut sont testées en parallèle. Cette technique présente un taux de transformation élevé puisque entre 80 et 90% des cellules émettent un signal fluorescent avec les constructions témoins. Cependant, il ne nous a pas été possible d’obtenir de résultats concluants.
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Figure 29 : Observation en microscopie confocale de feuilles de tabac après agroinfiltration
Cellules épidermiques exprimant : A : RECA ::GFP ; B : eYFP ::NLS ; C : eYFP. (a) : fluorescence de la GFP ; (b) : autofluorescence de la chlorophylle ; (c) : vue en transmission; (d) : superposition). Le grossissement de l’objectif et les échelles sont indiquées sous les images.
Par conséquent, l’expression de protéines de fusion in planta ne permet pas d’établir de façon claire un profil de distribution cellulaire des protéines NIP. Aucune détection claire n’a été observée avec les constructions comprenant AtNIP1 et AtNIP3. Les 40 premiers acides aminés d’AtNIP2 pourraient conduire le rapporteur dans les chloroplastes mais le signal émis est trop faible pour conclure. L’efficacité de la méthode employée ne peut être remis en question puisque les transformations effectuées avec les constructions contrôles ont toujours conduit aux résultats attendus.
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Figure 30 : Localisation des protéines AtNIP2 et AtNIP3 in planta chez le tabac
A : Image confocale obtenue avec la construction A (figure 28) pour AtNIP2, représentative de trois expériences ; B : Image confocale obtenue avec la construction C (figure 28) AtNIP3, représentative de deux expériences. (a) : fluorescence émise par le rapporteur eYFP ; (b) : autofluorescence de la chlorophylle ; (c) : vue superposée des deux images précédentes. Le grossissement et les échelles sont indiqués sous les images.
Les essais de localisation subcellulaire in planta présentées n’ayant pas été concluants, une seconde approche est mise en place. Les protéines NIP et NEP sont détectées, grâce aux anticorps dressés contre ces protéines, dans des extraits subcellulaires purifiés chez les deux organismes : Arabidopsis et l’épinard.
I.B.