B. Méthodes d’analyse des protéines

VIII.B.1Solubilisation de complexes membranaires

Les membranes plastidiales sont obtenues par choc osmotique comme vu précédemment. La solubilisation de complexes membranaires est adaptée de Sazanov et al.

1998. Cette dernière est essentielle à une séparation par chromatographie. Elle requière l’utilisation de détergents, dont les propriétés doivent être appropriées à l’étude réalisée. Dans le cadre de l’analyse de complexes, ce traitement est réalisé dans les conditions les plus natives possible afin de conserver au mieux ces ensembles quaternaires. Les membranes sont sédimentées 30 min à 35 000 g (rotor JA 25,5, Beckman) puis lavées dans la solution de choc contenant du sel (NaCl 15 mM). Elles sont de nouveau centrifugées dans les mêmes conditions et resuspendues dans le milieu de choc, NaCl 15 mM, glycérol 10% (v/v). La suspension doit être alors ajustée à 2mg/mL de chlorophylle. La solubilisation dépend du

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rapport protéine/détergent, mais la chlorophylle étant plus rapide à doser, la concentration de la suspension est ajustée en fonction de ce paramètre. Les protéines membranaires sont solubilisées par l’ajout goutte par goutte d’un détergent doux, le n-dodécyl lauryl maltoside (Sigma) à une concentration mère de 5 % (p/v), sous agitation régulière, jusqu’à arriver à une concentration finale de 1 % (p/v). La solubilisation se poursuit sous agitation constante à 4°C pendant 30 min. Le matériel non solubilisé est éliminé par une centrifugation de 30 min à 35000g. L’extrait en suspension peut alors être séparé par chromatographie.

VIII.B.2 Séparation des protéines par chromatographie d’exclusion VIII.B.2.1 Caractéristiques et préparation de la colonne

La chromatographie d’exclusion permet de séparer des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. Une première chromatographie a été réalisée avec une colonne de matrice agarose, la superose 6 HR10/30 (Amersham Pharmacia), permettant une séparation des protéines comprises dans une gamme très large. Cet essai a permis d’affiner le choix d’une autre colonne afin de mieux cibler fenêtre de séparation pour le complexe d’intérêt. La colonne utilisée alors régulièrement, la superdex 200 HR10/30 (Amersham Pharmacia), est constituée d’une matrice composite de dextran et agarose. Les chromatographies sont réalisées dans le système ÄKTA Purifier d’Amersham Pharmacia, guidé par informatique. Ce contrôle est assuré par le logiciel UNICORN.

Préparation et définition des paramètres de la chromatographie : Caractéristiques des

colonnes

Volume total de la colonne (mL)

Pression maximale Mpa)

Débit (mL/min) Gamme de fractionnement

(kDa)

Superose6 HR10/30 24 1,2 0,3-0,5 5 - 5 000

Superdex 200 HR 10/30 24 1,5 0,25 – 0,75 10 – 600

Tableau 3 : Paramètres de chromatographies sur Superose 6 et Superdex S200.

Toutes les solutions utilisées doivent être préalablement filtrées (filtre 0,2 µm). La colonne est stockée dans l’éthanol 20%. Il est éliminé par un lavage de 2 volumes de colonne (vc) d’eau. Elle est alors prête à être équilibrée avec un tampon approprié. Le volume d’échantillon injecté ne doit pas excéder 1 à 3% du volume de la colonne. Après séparation

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d’un échantillon, la colonne est lavée avec au moins 2 vc d’eau et conservée dans de l’éthanol 20% (v/v) (2 vc) à 4°C.

VIII.B.2.2Etalonnage de la colonne

Les colonnes sont étalonnées avec des marqueurs de masse moléculaire standard (catalase,.240 kDa ; 2 mg/mL et gel filtration standards de BIORAD: thyroglobuline bovine 670 kDa ; γ-globuline bovine 158kDa ; ovalbumine de poulet 44kDa ; myoglobine de cheval 17kDa ; vitamine B₁₂ 1,35 kDa. La courbe étalon déduite est spécifique de la colonne et des conditions expérimentales utilisées lors de la chromatographie. Le volume mort (V0). De la colonne est estimé via l’utilisation du bleu de dextran (2000 kDa ; à 1 mg/mL).

VIII.B.2.3Elution des échantillons

Les colonnes sont équilibrées par 2 vc de tampon de choc osmotique ; NaCl 15 mM, lauryl maltoside 0,1% (p/v). L’échantillon est injecté manuellement et élué par 1,5 vc de tampon de choc; NaCl 15 mM ; lauryl-maltoside 0,1%. Les chromatogrammes sont établis en fonction de l’absorbance des protéines (280 nm) et de l’absorbance de la chlorophylle totale et/ou caroténoïdes (652 nm et 450 nm respectivement) au cours de l’élution.

VIII.B.3Analyse des fractions obtenues par gel filtration par SDS- PAGE

VIII.B.3.1Concentration des échantillons par précipitation au TCA

Une aliquote des fractions collectées est précipité dans la glace pendant 30min à 1h en présence d’1/10 de volume final de TCA. La sédimentation des protéines est accélérée par une centrifugation de 10 min à 20 000 g. Le culot est lavé à l’acétone 80% (v/v), puis séché.

L’échantillon est alors repris dans du tampon de dépôt de protéines, et dénaturé 10 min à 100°C.

VIII.B.3.2 Séparation et détection des protéines

Les extraits des fractions précipités sont alors séparés par électrophorèse en conditions dénaturantes. Les dépôts sont réalisés en double afin de pouvoir d’une part, observer le profil d’élution et la séparation des protéines, et d’autre part, détecter la ou les protéines d’intérêt au cours de l’élution par immunodétection .

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VIII.B.4Etude d’interactions protéine-protéine la surface des membranes

VIII.B.4.1 Pontage chimique

Le pontage chimique est réalisé suivant plusieurs cinétiques sur des membranes plastidiales d’épinard et d’arabidopsis obtenues directement après choc osmotique des chloroplastes (comme vu précédemment). Il faut cependant exclure, lors de la préparation de membranes, l’utilisation de tout tampon source de groupements amines, ainsi que l’utilisation d’agent réducteur dans les tampons. Des cinétiques sont réalisées jouant sur la concentration de DSP, la quantité de matériel à ponter, et la durée de réaction afin d’optimiser les conditions expérimentales. Le volume de DSP utilisé ne doit pas excéder 10% du volume réactionnel. La réaction se fait dans un volume de 1ml, comprenant : des membranes de chloroplaste (quantité ajustée en fonction de la quantité de chlorophylle, entre 0,5 et 2 mg) ; le DSP (concentrations comprises entre 0,5 et 2mM) ; le volume final étant ajusté à 1mL avec du tampon de choc. La réaction se déroule à température ambiante, sous agitation, pendant 15 à 60 min. Elle est stoppée par l’ajout de Tris pH7.5 à 50 mM final, durant 15 min. Les réactions optimales sont déterminées comme indiqué dans la partie suivante. Elles seront ensuite solubilisées et fractionnées par chromatographie d’exclusion.

Les produits de ces réactions sont tout d’abord séparés par SDS-PAGE et les complexes d’intérêt analysés par immunodétection afin de contrôler la spécificité d’action du DSP. Les échantillons déposés sur gel sont cependant préparés différemment. Pour chaque réaction, les dépôts sont doublés sur gel afin de contrôler l’action du DSP. Deux aliquotes de chaque réaction sont dilués dans deux tampons de dépôt de protéines (2X ou 4X concentrés) contenant ou non du ß-mercaptoethanol, devant représenter 5% (v/v) du volume total de l’échantillon à dénaturer 5 min à 100 °C. L’utilisation de tampon sans agent réducteur permettra de distinguer l’effet du pontage chimique. La présence de ß-mercaptoethanol, au cours de la dénaturation, permettra de dissocier les ponts disulfures engendrés par le DSP, et de retrouver la protéine cible à l’état de monomère ou individualisée. Ces deux traitements assurent la spécificité de l’action du DSP. Après séparation par SDS-PAGE, les polypeptides sont transférés sur membrane de nitrocellulose et la protéine d’intérêt détectée par anticorps.

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