C. Méthodes de Transformation de bactéries

II.C.1Transformation d’ E. coli

II.C.1.1 Préparation de bactéries E. coli de souche XL1- blue chimiocompétentes

1,5 mL de LB frais est inoculé avec une colonie de E. coli XL1- blue isolée sur boîte de pétri contenant du milieu LB gélosé avec de la tétracycline, antibiotique de sélection de la souche (10 µg/mL final). Cette mini-culture est ensuite placée sous agitation (180 rpm) à 37°C pendant une nuit. Une pré-culture de 50 mL de LB (sans antibiotique) est alors ensemencée au 1/100 avec la mini culture, et incubée la nuit sous agitation et à 37°C. 1 mL de cette suspension est finalement ajouté à 100 mL de LB, puis cultivée à 37°C sous agitation jusqu'à atteindre une DO à 600 nm comprise entre 0,3 et 0,5. Les étapes suivantes sont réalisées dans la glace. Les bactéries sont sédimentées par une centrifugation de 10 min à 2000 rpm, et à 4°C. Le culot est délicatement repris dans 10 mL d'une solution froide, et fraîchement préparée, contenant 10 mM MgSO₄; 50 mM CaCl₂. La suspension est incubée 30 min dans la glace, puis centrifugée 10 min à 2000 rpm; et à 4°C. Le culot de bactéries compétentes est remis en suspension dans 1,7 mL de MgSO₄ 10 mM, CaCl₂ 50 mM froid.

300 µL de glycérol stérilisé est alors ajouté. Des aliquotes de 100 µL de cellules sont enfin congelées dans de l'azote liquide puis conservés à - 80°C.

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II.C.1.2Transformation de cellules E. coli compétentes

Les produits issus de la réaction de ligation et 100 µ L de cellules compétentes sont mis en présence pendant 30 min dans la glace. Un bref choc thermique (1 min, 42°C) stimule l’incorporation de l’ADN exogène par les bactéries. 1mL de milieu LB est ajouté aux cellules.

Elles sont alors incubées à 37°C pendant une heure afin d’initier l’expression et la réplication du plasmide intégré.

II.C.1.3Etalement de bactéries E. coli XL1 blue

Environ 100 µ L de la réaction de transformation sont étalés sur une boîte de Pétri contenant du milieu LB gélosé supplémenté en antibiotique de sélection apporté par le plasmide et en présence de 60µ L de X-Gal (20 mg/mL dans du N,N’diméthyl-formamide ) et de 20 µ L d’IPTG (solution filtrée à 0,2 g/mL dans de l’eau distillée) afin de permettre un criblage blanc-bleu. Les bactéries sont ensuite incubées à 37°C pendant une nuit. Seules les colonies blanches seront sélectionnées.

II.C.2 Transformation d’Agrobacterium tumefaciens

II.C.2.1Préparation d’agrobactéries chimiocompétentes

Une colonie d’A. tumefaciens est inoculée dans 20 mL de LB supplémenté de gentamycine (50 µg/mL), et incubée à 28°C sous agitation pendant une nuit. 2mL de cette préculture sont ensemencés dans 50 mL de LB + gentamycine et incubés dans les mêmes conditions jusqu’à atteindre une DO à 600 nm d’environ 0,5. La culture est alors incubée 10 min dans la glace. Toutes les étapes suivantes sont réalisées dans la glace ou à 4°C. Les agrobactéries sont récoltées par une centrifugation de 5 min à 3000 g et à 4°C. Le culot est repris délicatement dans 1 mL de CaCl₂, 20mM froid. Cette suspension est finalement aliquotée par fractions de 100 µL, congelées rapidement dans l’azote liquide, et stockées à - 80°C.

II.C.2.2Transformation d’A. tumefaciens

0,5 à 1 µ g d’ADN et cellules compétentes (100µ L) sont mis en présence pendant 5 min dans la glace. Un double choc thermique (5 min dans l’azote liquide puis 5 min à 37°C) achève la transformation. 1 mL de LB est alors ajouté, et la suspension laissée à 28°C pendant 4 h afin d’initier la réplication du plasmide. Les bactéries sont étalées sur milieu sélectif (LB gélosé contenant l’antibiotique de sélection de la souche et l’antibiotique de sélection du plasmide recombinant exogène), puis incubées à 36 h à 30°C.

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II.D.

Extraction d’ADN plasmidique : criblage des vecteurs recombinants

II.D.1 Mini-préparation d’ADN plasmidique issu d’E. coli : protocole rapide

Ce protocole a été apporté au laboratoire par Dominique Pontier, il est idéal pour un criblage rapide de culture d’ E. coli, il peut être aussi utilisé pour produire des fragments ou vecteurs digérés à liguer, mais pas à séquencer. Une culture de 1,5 mL de LB + antibiotiques est ensemencée à partir d’une colonie sur boîte, et incubées à 37°C sous agitation pendant une nuit. Les bactéries sont sédimentées par une centrifugation (1min, 12 000rpm). Le surnageant est éliminé et les bactéries lysées par l’addition de 300 µ L de tampon TENS (Tris 1M, pH 8 ; EDTA 0,5M, pH8 ; NaOH 0,1N ; SDS 0,5%). ADN chromosomique et protéines sont précipités par 150µ L d’acétate de potassium (3M, pH4.7). Débris cellulaires, et protéines sont éliminés par une centrifugation (2 min, 12 000 rpm). 1mL d’éthanol absolu est alors ajouté au surnageant afin de précipiter les acides nucléiques récupérés par centrifugation (2 min, 12000 rpm). Le culot est lavé à l’éthanol 70%, séché et repris dans 20µ L d’eau distillée autoclavée.

Cette méthode d’extraction des plasmides est rapide mais n’élimine pas l’ARN contaminant.

Les digestions enzymatiques seront par conséquent réalisées en présence de RNase A (Fermentas, 10 mgLmL, 0.5µ L par réaction) afin d’améliorer l’observation des produits de digestion sur gel d’agarose.

II.D.2Mini-préparation d’ADN plasmidique issu d’E. coli : protocole long et propre (séquençage)

Le protocole utilisé pour extraire des vecteurs destinés au séquençage automatique est celui du (Molecular Cloning, a laboratory manual, Sambrook J et al. 1989).

II.D.3Mini-préparation de plasmides issus d’Agrobacterium

Une culture de 2 mL de LB sélectif inoculée à partir d’une colonie prélevée sur boîte est incubée pendant 24h à 28°C puis centrifugée 2 min à 12 000 rpm. Le culot est resuspendu dans 100 µ L de solution I froide (lysozyme 4 mg/mL ; glucose 50 mM ; EDTA 10 mM ; Tris.HCl pH8, 25 mM). Après une étape d’incubation de 10 min à température ambiante, les bactéries sont lysées par un traitement alcalin (200 µ L de solution II : 1% SDS ; 0,2N NaOH), vortexées et incubées dans les mêmes conditions. Les protéines sont précipitées par l’ajout de

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90µ L d’un mélange phénol-solution II (1 :2 v/v respectivement) puis vortexées 2 min. 150 µ L d’acétate de sodium (3M ; pH 4,8) sont ajoutés, le mélange agité et incubé 15 min à –20°C afin de précipiter les acides nucléiques. Une centrifugation de 3 min à 14000 rpm permet de récupérer les acides nucléiques dans le surnageant. Ces derniers sont précipités par l’ajout de 2 volumes d’éthanol absolu froid, et sédimentés suite par une centrifugation (3min, 14000 pm). Le culot est lavé à l’éthanol 70%, séché et repris dans 20 µL d’eau distillée autoclavée. 5 µ L sont utilisés pour transformer E. coli, afin de vérifier la présence de l’insert par digestion de mini-préparation de plasmide.

II.D.4Midi-préparation de plasmides (E. coli ou A. tumefaciens)

Une midi-culture de bactéries transformées (100 mL LB sélectif) est ensemencée au 1/100 à partir d’une culture de 1,5 mL sélective, et placée à 37°C sous agitation pendant 12 à 16 h. La purification de plasmides est réalisée par la technique de lyse alcaline des bactéries en suivant le protocole fourni par le kit « QIAfilter Midi » (QIAGEN). La concentration en ADN est estimée en mesurant la DO à 260 nm (une unité de DO correspond à 50µg/mL d’ADN double brin).