Bglucosamine

Corrélations ¹³C-¹⁵N

13C

15N

sucre aminé

NAG

13C NAG

b Glucanes Corrélations ¹³C-¹³C

13C

A B

NAG

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squelettes saccharidiques, et les corrélations ¹³C-¹⁵N spécifiques aux sucres aminés (Figure 2.2).

La carte 2D ¹³C-¹³C permet de mettre en évidence, entre autres, deux corrélations importantes pour l’attribution des signaux (Figure 2.2.A). La première se fait entre les carbones C=O résonnant à 175 ppm environ et CH3 à 27 ppm. Cette corrélation confirme l’attribution de ces deux signaux à des fonctions N-acétyl. La seconde se fait entre les C1 aux environs de 105 ppm et un signal à 56 ppm. Cette corrélation confirme la présence de sucres aminés (Heux et al., 2000). Les autres corrélations confirment la présence de β-1,3- et β-1,4- glucanes qui sont majoritaires au sein de la paroi. Les autres types de liaisons sont de fait plus difficiles à mettre en évidence avec cette expérience.

Bien que cette information soit importante, elle ne permet pas de trancher sur la nature des sucres aminés. La corrélation ¹³C-¹⁵N permet de mettre en évidence deux types de liaisons à l’azote dans les parois (Figure 2.2.B). Les deux corrélations du signal ¹⁵N à 125 ppm aux signaux à 105 et 56 ppm confirment que les unités N-acétyl sont bien celles de la N- acetyl glucosamine. La corrélation du signal ¹⁵N aux environs de 50 ppm à un groupe de signaux aux alentours de 70 ppm, appartient à un sucre portant une amine primaire, très probablement de la glucosamine.

Pour vérifier si les sucres aminés autres que la NAG étaient éliminés au cours des étapes ultérieures de purification et hydrolyse des parois, nous avons procédé à une analyse comparative par RMN du solide ¹⁵N des parois PAW et d’un hydrolysat obtenu après l’action d’un mélange de glycohydrolases (cf. paragraphe 1.2 de ce chapitre) (Figure 2.3). Alors qu’un signal intense correspondant à la NAG est détecté dans les deux échantillons, nous observons qu’un signal minoritaire (environ 4% du total) correspondant à la glucosamine est éliminé par la purification. Cela suggère que la glucosamine détectée dans les parois PAW est relative à des glycoprotéines pariétales qui n’ont pas encore été éliminées par le traitement au NaOH.

En conclusion, ces analyses confirment et étendent les interprétations de (Badreddine et al., 2008), à savoir que les hexosamines de la paroi d’A.euteiches sont majoritairement sous forme de NAG et que les chitosaccharides solubilisés par l’action de glycanases sur des parois déprotéinisées ne contiennent pas de glucosamine.

Tableau 2.5 : Activités spécifique des enzymes utilisées

Origine Dénomination Activité spécifique (U/mg de protéines) Culture

cellulaire de tabac BY2

β-1,3-endoglucanase 1.2

β-1,4-glucanase 1.2

endochitinase 0.4

exochitinase 0.5

Cellulase

(Megazyme) β-1,4-endoglucanase 80^a Westase

(Takara)

β-1,3-exoglucanase 0.7 β-1,6-endoglucanase 2

1U = quantité d’enzyme nécessaire pour hydrolyser 1 µmol de substrat en 1 min, à 40°C.

a activité enzymatique à 40°C donnée par le fabricant.

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1.1.3.2. Approche par hydrolyse enzymatique

Dans cette approche, il s’agit d’hydrolyser spécifiquement un type de liaison glycanique dans la paroi, puis de déterminer la quantité de chitosaccharides qui ont été libérés de la paroi. Les chitosaccharides sont quantifiés par le dosage de la NAG totale dans le surnageant et dans le culot par HPAEC-PAD (High-Performance Anion-Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection).

La première phase de ce travail a consisté à préparer des sources enzymatiques dotées d’un seul type d’activité hydrolytique, lorsque celles-ci n’étaient pas commercialement disponibles. Une chitosanase a été achetée chez Sigma-Aldrich (Chitosanase from Streptomyces griseus) et utilisée en l’état.

Pour la plupart des autres enzymes nécessaires, des cultures cellulaires de Nicotiana tabacum BY2, gracieusement fournies par Christian Mazars (UMR 5546 CNRS/UPS, LRSV), ont été utilisées comme matériel de départ. En effet, ces cultures cellulaires, sont une source abondante d’enzymes hydrolytiques (C.Laffite, communication personnelle). Nous avons obtenu de ce matériel biologique des extraits à activité exclusive endochitinase, exochitinase, β-1,3-endoglucanase et β-1,4-glucanase (Tableau 2.5).

L’activité β-1,6-endoglucanase n’est pas connue chez les plantes. Celle-ci a été apportée par un extrait enzymatique commercial, la Westase^© du fabriquant TAKARA, qui contient également une activité β-1,3-exoglucanase. Cette préparation enzymatique est obtenue par le fabriquant à partir de Streptomyces rochei. De la Westase^©, nous avons purifié séparément la β-1,6-endoglucanase et la β-1,3-exoglucanase.

La nature des activités enzymatiques a été déterminée en réalisant une incubation sur 1 h avec un substrat adapté insoluble. Les sucres solubilisés sont quantifiés après hydrolyse chimique, permettant la dépolymérisation des sucres solubilisés, par HPAEC-PAD.

Nous avons aussi déterminé si les sucres libérés étaient des monomères, dimères ou des fragments plus grands, en réalisant une analyse HPAEC-PAD sans hydrolyse chimique préalable. Cette information nous a renseigné sur l’activité endo- ou exo-glycanase de l’enzyme considérée. Les activités spécifiques de ces préparations enzymatiques sont présentées dans le Tableau 2.5.

Tableau 2.6 : Pourcentage d’hexosamines libérées à partir des parois PAW par des enzymes purifiées

hexosamines libérées après

endochitinase 6.7 ± 3 hexosamines libérées après

exochitinase 21.8 ± 17 hexosamines libérées après

β-1,4-endoglucanase 8 ± 1 hexosamines libérées après

β-1,3-endoglucanase 12.2 ± 9 hexosamines libérées après

β-1,6-endoglucanase 96.2 ± 1

Les valeurs présentées sont la moyenne de deux expériences indépendantes ± écart-type.

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Des parois PAW ont été hydrolysées pendant 24 h avec chacune des enzymes purifiées. Les hydrolyses ont été effectuées séparément sur les deux des trois lots de parois précédemment obtenus. Les quantités de NAG libérées par chaque hydrolyse enzymatique sont présentées dans le Tableau 2.6. La chitosanase n’a eu aucun effet sur les parois PAW (non montré), comme déjà observé par (Badreddine et al., 2008) sur des parois extraites au méthanol-chloroforme. Nous observons que l’action de l’endochitinase n’a pour effet de libérer en moyenne que 6.7% des hexosamines de la paroi, tandis que l’exochitinase a libéré en moyenne 21.8% (±17%) des hexosamines. Les chitinases sont en mesure de dégrader ou libérer plus de 22% des chitosaccharides de la paroi d’A.euteiches, ce qui indique une proportion imporante de liaisons β-1,4-NAG présentes ou accessibles. La β-1,4- endoglucanase a libéré dans le surnageant en moyenne 8% des hexosamines, ce qui indique que 8% des chitosaccharides sont liés à des polymères de glucose contenant des liaisons β- 1,4. De même, la β-1,3-endoglucanase a libéré en moyenne 12.2% des hexosamines, ce qui indique que 12.2% des chitosaccharides sont liés à des polymères de glucose contenant des liaisons β-1,3. De façon intéressante, l’hydrolyse de la paroi à l’aide de la β-1,6- endoglucanase a libéré en moyenne 96.2% des hexosamines. Ce dernier résultat signifie que les chitosaccharides sont principalement impliqués dans des liaisons covalentes avec des polymères de glucose contenant des liaisons β-1,6-glucanes, dans la paroi d’A.euteiches.

1.2. P

1.2.1. Extraction et purification

L’objectif a été de purifier les chitosaccharides de la paroi d’A.euteiches afin d’en étudier la structure ainsi que l’activité biologique. Nous avons donc souhaité libérer les chitosaccharides et éliminer au maximum les glucanes auxquels ils sont liés. L’extraction a été effectuée en utilisant une approche enzymatique, la seule permettant potentiellement d’atteindre notre objectif. Les résultats précédents nous ont indiqué que la présence d’une β-1,6-endoglucanase est indispensable pour extraire les chitosaccharides. Cette activité enzymatique n’a jamais été observée chez les plantes, néanmoins elle a pu être mise en évidence dans le milieu de culture d’A.euteiches, avec une activité spécifique moyenne de 0.82 ± 0.035 pKat/µg à 6 jours de croissance en milieu glucose-extrait de levure (Badreddine