D EVELOPPEMENT DE CONSTRUCTIONS RAPPORTRICES DE LA DEFENSE

Nous avons observé, à l’aide du bioessai décrit précédemment, que les oligo-β-1,3- glucanes linéaires n’induisent pas de production de ROS extracellulaires. La perception de ces oligosaccharides n’a été révélée que par l’induction de l’expression de gènes de la plante. Nous avons donc développé deux outils complémentaires pour mettre en évidence de façon rapide une activité biologique qui n’aurait pas pu être mise en évidence par la mesure de ROS : nous avons entrepris de cloner deux constructions rapportrices de la défense, afin de générer du matériel biologique transgénique contenant ces constructions.

La région promotrice du gène d’inhibiteur de protéase (PI) a été sélectionnée pour les raisons suivantes :

L’expression du gène PI est induite chez M.truncatula suite à de nombreux stress biotiques.

Comme présenté précédemment, son expression est induite par le β-glucane de Phytophthora, les COs de chitine, les oligo-β-1,3-glucanes linéaires ainsi que par l’infection par A.euteiches à 1, 3 et 6 jours après inoculation. Dans des résultats préliminaires obtenus au cours du développement du bioessai précédent, il a été observé que le gène PI est également induit par les éliciteurs glycoprotéiques CBEL et P2 de Phytophthora (Roux et al., 1994; Villalba Mateos et al., 1997) (résultats non présentés). The Medicago truncatula Gene Expression Atlas (MtGEA) Project (http://mtgea.noble.org/v2/) indique que l’expression de ce gène est induite dans les plantes infectées par Phymatotrichum à 72 h et 96 h, dans les cultures cellulaires traitées avec de l’extrait de levure (YE) à 2 h et 24 h, ainsi que dans les cultures cellulaires traitées par du méthyljasmonate après 24 h, et qu’il n’y a pas d’induction au cours de la mycorhization et la nodulation (Figure 1.6.A). Une construction de fusion traductionnelle comprenant 2500 bases en amont du codon d’initiation ainsi que le premier exon et le premier intron de ce gène a été clonée par la méthode du Gateway dans le plasmide pKGWL7.0 contenant la séquence codante du gène de la luciférase en aval du site de recombinaison, donnant la construction nommée promPI-luc.

La région promotrice du gène de pathogenesis-related protein 10.2 (PR10.2) a été sélectionnée pour les raisons suivantes :

Comme présentée précédemment, son expression est induite par le β-glucane de Phytophthora, et les COs de chitine. Les données de transcriptomique sur M.truncatula de l’équipe Interactions Plante-Microorganisme (Laboratoire de Recherche en Sciences

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Végétales, CNRS/Université Paul Sabatier, Toulouse) réalisées sur des puces 16kOliPlus, indiquent que l’expression de ce gène est induite au cours de l’infection des parties racinaires par A.euteiches à 1, 3 et 6 jours après inoculation, au cours de l’infection des parties aériennes par le champignon Colletotrichum lindemuthianum à 1 jours après inoculation et au cours de l’infection des parties aériennes par Colletotricum trifolii à 1 et 3 jours après inoculation. Elle est aussi induite par le traitement des parties aériennes des plantes par le Bion, analogue de l’acide salicylique, après 6 jours, ainsi que par l’acide β- aminobutyrique 1 et 2 jours après traitement. Les données disponibles sur le MtGEA Project indiquent que les régulations de l’expression de ce gène présentent des similitudes avec celles du gène PI dans les conditions d’infection par Phymatotrichum, de mycorhization et en réponse à l’élicitation par l’extrait de levure. L’expression du gène PR10.2 présente une induction dans les cultures cellulaires traitées par du méthyljasmonate après 2 h (Figure 1.6.B).

La séquence génomique en amont du gène PR10.2 n’est pas complète et a nécessité de réaliser des alignements pour la prolonger. La sonde 16kOliPlus MT015362 a été construite sur le MTGI9-TC123318 de la version 9 de la tentative d’assemblage des EST de M.truncatula. Ce TC s’aligne à 100% avec la sonde Affymétrix Mtr.8507.1.S1_at dont les régulations sont présentées en Figure 1.6.B. L’alignement du MTGI9-TC123318 sur les séquences des BAC-ends de M.truncatula a permis d’aligner les BACs mth2-146L14FM1 et mte1-76K22RM1, permettant d’obtenir une région d’environ 800 bases en amont de l’ATG prédit par le MTGI9-TC123318. Cette séquence a été clonée par GateWay dans le plasmide pKGWL7.0 donnant la construction nommée promPR10.2-luc.

Figure 1.7 : Visualisation de la bioluminescence dans des cultures racinaires de M.truncatula exprimant une construction rapportrice de la défense promoteur-luciférase

A, B : Racines exprimant la construction promPI-luc. C, D : Racines exprimant la construction promPR10.2-luc. A, C : Traitement eau. B, D : Traitement COs 100 µg/mL. 1 : Visualisation des racines sous lumière transmise. 2 : Bioluminescence enregistrée avec une caméra emCCD C9100-13.

A.1 A.2

B.1 B.2

C.1 C.2

D.1 D.2

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La transformation de racines de M.truncatula lignée R108 nous a permis d’obtenir deux lignées de culture de racines transgéniques, l’une exprimant la luciférase sous le contrôle de la région promotrice du gène PI, l’autre sous le contrôle de la région promotrice du gène PR10.2.

Des fragments des racines transgéniques générées avec les constructions promPI-luc ou promPR10.2-luc et ont été traités par des COs DP 7. La luminescence a été révélée à l’aide d’une caméra emCCD après 21 h d’incubation. Nous avons obtenu les résultats présentés en (Figure 1.7). Pour les deux constructions nous observons une induction de la luminescence émise suite au traitement par les COs DP 7. Nous constatons que le niveau de base d’expression de la construction promPI-luc est élevé comparé à celui de la construction promPR10.2-luc qui est presque indétectable. Ces résultats sont cohérents avec les résultats obtenus par RT-qPCR (niveau d’expression basal en 2^-ΔCt ± SE: PI = 0.09 ± 0.02 ; PR10.2 = 0.01

± 0.007).

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