Merci à Thomas avec qui j'ai partagé de très bons moments depuis notre arrivée dans l'équipe il y a cinq ans et merci à Catherine, Cécilia, Daniel, Diana, Donia, Sophie et Valérie dont l'amitié m'est chère et qui m'ont aidé dans les difficultés. Enfin, je remercie toute ma famille qui m'a toujours soutenu et poussé à atteindre mes objectifs malgré les défis auxquels nous avons été confrontés.
R ESUME
A BSTRACT
A BREVIATIONS
I NTRODUCTION
L A RECONNAISSANCE PRECOCE DES MICROORGANISMES PAR LES PLANTES
N ATURE ET ORIGINE DES MAMP S ET SIGNAUX SYMBIOTIQUES
- L ES MAMP S
- L ES SIGNAUX SYMBIOTIQUES
CBM1 (Carbohydrate-Binding Module family 1) est une glycoprotéine MAMP identifiée chez les oomycètes du genre Phytophthora ( Gaulin et al., 2006 ; Khatib et al., 2004 ). La dégradation enzymatique des glucanes de la paroi de Magnaporthe grisea a permis l'identification de penta-glucanes excitateurs (Xie et Lipke, 2010 ; Yamaguchi et al., 2000).
P ERCEPTION DES MAMP S ET SIGNAUX SYMBIOTIQUES
Ainsi, les domaines LysM sont généralement considérés comme capables de se lier aux glycanes contenant du NAG (Figure I.3) (Buist et al., 2008). Binding Protein » (GBP) semble être une glucanase extracellulaire associée à la membrane plasmique (Fliegmann et al., 2004).
T RANSDUCTION DES SIGNAUX
- L ES FLUX IONIQUES
- L A PRODUCTION D ’ ESPECES REACTIVES DE L ’ OXYGENE
- L A PHOSPHORYLATION DES PROTEINES
L'intensité et la cinétique de l'afflux de calcium (signature calcique) contribuent à la spécificité de la réponse des plantes (Lecourieux et al., 2006). Cette cascade de phosphorylation est constituée de « protéines kinases associées aux mitogènes » (MAPK), de MAPKK (MAP2K) et de MAPKKK (MAP3K) (Gustin et al., 1998 ; Kyriakis et Avruch, 1996).
R EPONSES D ’ ACCEPTATION OU DE REJET DU MICROORGANISME
- L A PRODUCTION DE METABOLITES SECONDAIRES
- L A PRODUCTION DE P ATHOGENESIS -R ELATED P ROTEINS
- L ES MODIFICATIONS DE LA PAROI
Les flavonoïdes sont les précurseurs de plusieurs molécules de défense, dont les phytoalexines (Ferrer et al., 2008 ; Winkel-Shirley, 2001). Une hyperlignification est observée chez de nombreux mutants altérés dans la synthèse de cellulose et en réponse à des parasites ( Hématy et al., 2007 ).
R ELATIONS ENTRE LES SIGNALISATIONS SYMBIOTIQUE ET DEFENSIVE
Cette inhibition est nécessaire à la déformation des poils racinaires des plantes, qui est l'une des premières étapes de l'établissement de la symbiose (Lohar et al., 2007). Ils sont à la fois un élément essentiel de défense des plantes (Ahuja et al., 2012), et participent au dialogue moléculaire. Ce dernier résultat n'est pas sans rappeler ce qui a été observé précédemment concernant la perception de la NF comme déclencheur du tabagisme (Baier et al., 1999).
Mais dans le cas des mycorhizes, les mécanismes de contrôle sont encore inconnus (Campos-Soriano et al., 2010).
P RESENTATION DU PATHOSYSTEME A PHANOMYCES EUTEICHES - M EDICAGO TRUNCATULA ET DES OBJECTIFS DE LA THESE
- I NTRODUCTION AUX O OMYCETES
- L A POURRITURE DES RACINES CAUSEE PAR A PHANOMYCES EUTEICHES
- L E PATHOSYSTÈME A PHANOMYCES EUTEICHES -M EDICAGO TRUNCATULA
- D ECOUVERTE DE COMPOSES A NAG DANS LA PAROI D ’A. EUTEICHES
- P ROJET DE RECHERCHE
Le pathosystème entre la légumineuse modèle M. truncatula et l'oomycète pathogène A.euteiches a été développé il y a quelques années (Nyamsuren et al., 2003) et développé en équipe (Djébali et al., 2009). L'interaction entre M. truncatula et A.euteiches constitue un modèle d'étude approprié pour étudier la maladie provoquée par ce micro-organisme et comprendre les moyens de perception des plantes. Les tests d'infection des mutants du récepteur NFP de M. truncatula par A.euteiches ont révélé une tolérance réduite de la plante mutante par rapport à la lignée sauvage ( Rey et al., 2013 ).
Ainsi, dans le cadre de mon projet de thèse, la caractérisation des chitosaccharides d'A.euteiches a été entreprise.
CHITINE DE DEGRE DE POLYMERISATION ELEVE ET AUTRES ELICITEURS MICROBIENS
R ESULTATS PRELIMINAIRES CONCERNANT LA MISE AU POINT DU BIOESSAI
Ces observations indiquent que la production de H2O2 en réponse aux CO de chitine est terminée après 15 minutes dans tous les cas. Cela nous a permis d'obtenir une courbe dose-réponse pour la culture cellulaire, les graines germées et les jeunes plants de M. truncatula (Figure 1.2). Des tests d'élicitation sur des cultures cellulaires de M. truncatula ont été réalisés sur des cultures âgées de 15 jours, temps correspondant à la fin de la phase de croissance.
Les graines germées ont une production basale de H2O2 d’environ 6 pmol.mg-1, soit trois fois supérieure à celle de la culture cellulaire et des jeunes plantes.
P UBLICATION DECRIVANT LE SYSTEME EXPERIMENTAL
Abstract
I NTRODUCTION
Since the first chitin receptors, CEBiP and CERK1, were characterized in rice and Arabidopsis thaliana, respectively (Kaku, et al. 2006; Miya, et al. 2007; Wan, et al. 2008), great advances have been made in the understanding of chitin perception and transduction mechanisms in these plants. The solubility and biological properties of COs depend on their degree of polymerization (DP) and degree of acetylation (Aam, et al. 2010).
Alternative methods for chemical or enzymatic synthesis of CO2 are available, but these methods are complex and yields are generally low (Aam et al. 2010).
M ATERIALS AND METHODS
- Chitin oligomer preparation
- NMR characterization of chitin oligomers
- Preparation and characterization of A. euteiches culture filtrates filtrates
- Plant biological material
- Elicitation assays and ROS measurement
- Measurement of gene expression by qRT-PCR
The baseline was corrected using the Polynomial Fit routine of MestReNova software (Version 6, Mestrelab Research S.L.). Quantitative analysis was done by integrating the respective signals using the same NMR software. The cDNAs were then used for qPCR using the BioMarkTM HD System (Fluidigm): first, 1.3 μl of a 1:40 dilution of the synthesized cDNA was submitted to specific target amplification (STA) by PCR amplification in a 5 μl reaction containing A .
The average DPs of the CO fractions are calculated from the integration of these signals.
R ESULTS
- Preparation and characterization of CO fractions from crab shell chitin shell chitin
- CERK1-dependent responses to COs in A.thaliana
- M. truncatula elicitation assay
- Activity of COs on M. truncatula roots
- Detection of elicitors in Aphanomyces euteiches culture filtrates filtrates
The assignment of the various proton resonances (chemical shifts) are as follows, according to Samain et al. These signals correspond to C1- and C1- of the COs reducing ends, respectively (Samain, et al. 1997). However, at the sensitivity of the experiment (estimated at a few percent), the only organic compounds present appeared to be CO.
Roots were incubated in the presence of the samples for 20 min before collecting the extracellular medium and fluorimetric measurement of H 2 O 2 in the presence of amplex red and HRP.
D ISCUSSION
Furthermore, our experimental setup allowed non-destructive measurement of early extracellular ROS production by analyzing small amounts of the extracellular medium, until harvest of the root system for the destructive measurement of gene expression. Taking into account the yield of the COs DP7 preparation and the sensitivity of our assay, it can be calculated that 1 g of chitin from crab shells allows the preparation of COs in quantities sufficient to elicit 2160 seedlings with 20 µg.ml 1 elicitor. Our biological assay will prove useful whenever there is a need for roots to be easily accessible for treatment or for measuring physiological responses, for example for deciphering the perception mechanisms and signaling pathways involved in responses of M.
The induction of H2O2 production strongly indicates the presence of elicitor-active compounds in the culture filtrate released into the medium by the growing oomycete (Figure 6).
A CKNOWLEDGEMENTS
R EFERENCES
Miya A, Albert P, Shinya T, Desaki Y, Ichimura K, Shirasu K, Narusaka Y, Kawakami N, Kaku H, Shibuya N (2007) Ti CERK1, ti maysa a LysM a reseptor kinase, ket nasken para iti chitin elicitor a panagsenyas iti Arabidopsis. Petutschnig EK, Jones AM, Serazetdinova L, Lipka U, Lipka V (2010) Ti kasla lisin a motibo a reseptor a kinase (LysM-RLK) a CERK1 ket maysa a nangruna a chitin-a mangisilpo a protina iti Arabidopsis thaliana ken maipaulog iti chitin-a naiduron a poporilasion. Ramonell KM, Zhang B, Ewing RM, Chen Y, Xu D, Stacey G, Somerville S (2002) Panagsukima ti mikroarray ti panagpataud ti chitin iti Arabidopsis thaliana.
Wan J, Zhang XC, Neece D, Ramonell KM, Clough S, Kim SY, Stacey MG, Stacey G (2008) A LysM receptor-like kinase plays a critical role in chitin signaling and fungal resistance in Arabidopsis.
R ESULTATS COMPLEMENTAIRES CONCERNANT L ’ EXPLOITATION DU BIOESSAI
D EVELOPPEMENT DE CONSTRUCTIONS RAPPORTRICES DE LA DEFENSE
La sonde 16kOliPlus MT015362 a été construite sur MTGI9-TC123318 à partir de la version 9 de l'expérience d'assemblage M. truncatula EST. La transformation racinaire de la lignée R108 de M. truncatula nous a permis d'obtenir deux lignées transgéniques de cultures de racines, dont l'une exprime la luciférase sous le contrôle de la région promotrice du gène PI, et l'autre sous le contrôle du promoteur régional du gène PI. Gène PR10.2. . Dans les deux constructions, on observe l'induction de la luminescence émise après traitement au DP 7 CO.
Nous constatons que le niveau d'expression basal de la construction promPI-luc est élevé par rapport à celui de la construction promPR10.2-luc, qui est pratiquement indétectable.
D ISCUSSION
Nos oligomères ont été préparés à partir de curdlan, qui est décrit comme un polymère linéaire de glucose lié uniquement par des liaisons β-1,3 ( Manjanna et al., 2009 ). Les résultats des travaux de Valdés-López et al. 2011) montrent que les lignées de soja (Glycine max) dont la production de ROS et l'induction de gènes liés à la défense sont les plus intenses en réponse au peptide flg22 et à la chitine sont également les lignées dont le niveau de résistance à l'infection par Sclerotinia sclerotiorum est adulte. . Sans remettre en cause cette hypothèse, les travaux de (Kröner et al., 2011) apportent une dimension supplémentaire.
Les auteurs expliquent cela par le mode de vie de P.infestans, dont la croissance peut entraîner une fuite du micro-organisme hors des tissus végétaux où la défense est activée (Vleeshouwers et al., 2000 ; Wang et al., 2008).
STRUCTURALE ET ACTIVITE BIOLOGIQUE DES CHITOSACCHARIDES D ’A. EUTEICHES
C ARACTERISATION STRUCTURALE
- P REPARATION ET CARACTERISATION DES PAROIS MYCELIENNES
- Culture d’Aphanomyces euteiches en milieu synthétique
- Extraction et purification de la paroi
- Caractérisation de la paroi
Un suivi de la consommation de glucose du milieu de culture et de la biomasse sèche créée est réalisé pendant 24 jours de culture (Figure 2.1). Lors d'une étude précédente de la paroi d'Aphanomyces (Badreddine et al., 2008), les parois non traitées d'A. euteiches ont été déprotéinisées par traitement avec une solution de méthanol et d'hydroxyde de potassium sous chauffage, 10 min à 80 °C. Des travaux antérieurs sur des parois entières suggéraient la présence de chitosaccharides dans la paroi d'A.euteiches sous une forme non cristalline, excluant leur organisation sous forme de chitine (Badreddine et al., 2008).
Pour faire progresser la compréhension de ces parois, nous avons effectué une analyse RMN bidimensionnelle de parois de PAW non hydrolysées.
Bglucosamine
Approche par hydrolyse enzymatique
Les chitosaccharides sont quantifiés par mesure du NAG total dans le surnageant et dans le culot par HPAEC-PAD (High-Performance Anion-Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection). On voit que l'action de l'endochitinase entraîne en moyenne la libération de seulement 6,7 % des hexosamines par la paroi, tandis que l'exochitinase libère en moyenne des hexosamines. Les chitinases peuvent dégrader ou libérer plus de 22 % des chitosaccharides de la paroi d'A.euteiches, indiquant qu'une fraction significative des liaisons β-1,4-NAG est présente ou accessible.
Il est intéressant de noter que l’hydrolyse de la paroi à l’aide de la β-1,6-endoglucanase a libéré en moyenne 96,2 % des hexosamines.
P REPARATION ET CARACTERISATION DES CHITOSACCHARIDES
- Extraction et purification
L'hydrolyse a été réalisée séparément sur deux des trois groupes de parois obtenus précédemment. La β-1,4-endoglucanase a libéré en moyenne 8 % des hexoamines dans le surnageant, ce qui indique que 8 % des chitosaccharides étaient liés à des polymères de glucose contenant des liaisons β-1,4. De même, la β-1,3-endoglucanase a libéré en moyenne 12,2 % des hexoamines, ce qui indique que 12,2 % des chitosaccharides étaient liés à des polymères de glucose contenant des liaisons β-1,3.
Ce dernier résultat signifie que les chitosaccharides sont principalement impliqués dans les liaisons covalentes avec les polymères de glucose contenant des liaisons β-1,6-glucane dans la paroi d'A.euteiches.
