Contexte du travail

L’ARN polymérase II est incapable d’initier seule la transcription. Elle nécessite la présence des facteurs généraux. L’initiation de la transcription commence par la mise en place du complexe de préinitiation (PIC), qui apparaît comme une étape séquentielle in vitro.

Cependant, la présence de complexes coactivateurs pourrait influencer l’assemblage du PIC in vivo.

Le Médiateur qui a été initialement purifié chez S. cerevisiae, permet de moduler le niveau de transcription en réponse aux signaux de régulation positif ou négatif. In vitro, il est nécessaire à l’activation de la transcription en réponse aux activateurs spécifiques, il augmente le niveau de la transcription basale et stimule l’activité kinase de TFIIH (Kim et al., 1994). In vivo, le Médiateur est requis pour la transcription de la quasi totalité des gènes de S.

cerevisiae (Holstege et al., 1998). Les analyses temporelles de mise en place du PIC montrent qu’il lie le promoteur des gènes avant les facteurs généraux (Bryant and Ptashne, 2003; Park et al., 2001). De plus, l’altération de son recrutement ou une mutation affectant son intégrité empêche la formation du PIC, suggérant ainsi un rôle essentiel du Médiateur dans la mise en place du complexe de préinitiation. Enfin, une étude à grande échelle d’interaction génétique montre des liens du module de Tête du Médiateur avec Pol II, TFIIF et TFIIH (Collins et al., 2007).

Afin de découvrir comment le Médiateur peut augmenter le niveau de la transcription basale, stimuler la transcription et la phosphorylation du CTD par TFIIH, et comment il peut influencer la mise en place du PIC, nous avons étudié le rôle d’une sous-unité essentielle et conservée du module de Tête du Médiateur : Med11. Nous avons identifié par double-hybride une interaction entre Med11 et un domaine conservé de Rad3, une hélicase du complexe TFIIH. Nous avons ensuite confirmé cette interaction par co-immunoprécipitation de protéine (CoIP) sur les protéines entières.

Pour étudier le rôle de cette interaction et la fonction de Med11, nous avons réalisé une mutagénèse aléatoire de la protéine suivie d'un crible de thermosensibilité. Elle nous a permis d’obtenir huit mutants ponctuels, répartis sur l’ensemble de la protéine. Nous avons alors caractérisé ces mutants par double-hybride entre Med11 et ses partenaires : Med17, Med22 et Rad3. Nous avons ainsi identifié trois mutants particulièrement intéressants pour la

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spécifiquement affecté pour l’interaction avec Rad3 (TFIIH), le mutant med11-G108S qui est spécifiquement affecté pour l’interaction avec Med17 (Médiateur) et le mutant med11-L82P qui est affecté pour toutes les interactions testées (Rad3, Med17 et Med22). Après avoir confirmé le défaut d’interaction entre Med11-T47A et Rad3 par CoIP, nous avons vérifié dans les trois mutants (med11-T47A, -L82P et -G108S), l’intégrité du Médiateur et la capacité du complexe à interagir avec Pol II. Nous avons observé que seul le mutant présentant un défaut pour toutes les interactions connues de Med11 (med11-L82P), affecte l’intégrité du module. Ceci est en accord avec le rôle central de Med11 dans la structure du module Tête (Takagi et al., 2006). Par contre les trois mutants sont toujours capables d’interagir avec l’ARN polymérase II. Néanmoins, une analyse des effets de ces mutations sur la transcription par RT-PCR (« Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ») montre qu’à 37°C, ces trois mutants sont affectés dans la quantité des ARN messagers testés.

Ces trois mutants nous ont ensuite permis d’étudier le rôle du Médiateur dans la mise en place du PIC. Après nous êtres assurés qu’ils n’affectent pas le niveau d’expression de protéines clefs de la transcription, nous avons étudié par ChIP l’assemblage du PIC. La protéine TBP et le Médiateur se fixent normalement sur le promoteur des gènes étudiés. Par contre, les trois mutants réduisent l’occupation des derniers intervenants du PIC : Pol II, TFIIE et TFIIH. De façon surprenante, contrairement à la séquence d'assemblage établie in vitro, le mutant med11-G107S qui est spécifiquement affecté dans l’interaction entre Med11 et Med17, présente un défaut d’occupation de Pol II sans affecter ceux de TFIIE et TFIIH.

Ceci suggère un recrutement indépendant de ces trois facteurs. Le mutant med11-T47A qui est affecté dans l’interaction avec Rad3, réduit spécifiquement le niveau d’occupation du module TFIIK. Ceci suggère que l’interaction entre le Médiateur et Rad3 est importante pour la stabilisation et l’association des sous-complexes de TFIIH. Enfin, le mutant med11-L82P qui est affecté pour toutes les interactions testées, réduit l’occupation de Pol II, TFIIE et de l’ensemble du complexe TFIIH sur la chromatine. Ces trois mutants indiquent que le Médiateur influence la mise en place du PIC en favorisant indépendamment l’occupation de Pol II et de TFIIH/TFIIE et en stabilisant l’association entre TFIIK et le cœur de TFIIH.

Enfin, TFIIH phosphoryle le CTD de Pol II par l’intermédiaire de son module TFIIK.

Cette étape est essentielle dans la transition entre l’initiation et l’élongation de la transcription. Nous avons donc analysé l'effets des mutants de Med11 sur la phosphorylation du CTD, in vivo. Nous avons ainsi pu remarquer, en accord avec la baisse du niveau d’occupation du module TFIIK sur le promoteur du gène ADH1, que le niveau de phosphorylation du CTD diminuait dans le mutant med11-T47A. Une des propriétés du

ROLE DU MEDIATEUR DANS LA MISE EN PLACE DU PIC IN VIVO Médiateur est de stimuler indépendamment de Rad3, l’activité kinase de TFIIK in vitro (Guidi et al., 2004; Nair et al., 2005). Nous nous sommes alors assurés que le mutant Med11- T47A, n’était pas affecté dans cette activité.

L’ensemble de ces résultats indiquent que le Médiateur influence l’assemblage du PIC en favorisant l’occupation de Pol II indépendamment de TFIIH et TFIIE, et en stabilisant le complexe TFIIH. Il permettrait ainsi de stimuler la transcription et la phosphorylation du CTD in vivo.

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