Chapitre III: Le facteur d’élongation TFIIS
III.2 Structure et mode d’action de TFIIS
Le facteur d’élongation TFIIS est composé de trois domaines structuraux conservés au cours de l’évolution dont le repliement est indépendant (Figure 11 A). La structure des trois domaines a été obtenue par RMN chez S. cerevisiae (Booth et al., 2000; Olmsted et al., 1998) (Figure 11 B) et chez l’Homme pour le domaine III (Qian et al., 1993). Le domaine I adopte une forme globulaire avec plusieurs hélices !. Le domaine II est très organisé autour de six hélices !. Un linker sépare les domaines II et III, il se structure sous la forme d’une grande hélice. Enfin, le domaine III est composé de trois feuillets " antiparallèles formant un motif en ruban à zinc et contient un motif RSADE sur une boucle. Ce motif est essentiel pour l’activité de stimulation de clivage de Pol II par TFIIS.
Un modèle cristallographique des domaines II et III complexés à Pol II a été obtenu par diffraction des rayons X à la résolution de 3,8 Å chez S. cerevisiae (Kettenberger et al., 2003) (Figure 11 C). Ce modèle a permis de comprendre les mécanismes mis en jeu par TFIIS pour stimuler le clivage de l’ARN dans le complexe ternaire. Le domaine II du facteur interagit avec la sous-unité Rpb1 de Pol II, puis TFIIS pénètre dans le cœur de l'ARN polymérase grâce à son linker allongé. Le domaine III se trouve alors au niveau du site actif de Pol II et présente le motif RSADE.
La fonction du domaine I reste encore inconnue. Le domaine fusionné à la GST permet néanmoins de purifier Pol II associée aux facteurs généraux et à Cdk8, une sous-unité du Médiateur (Pan et al., 1997). Ce mélange est capable d’activer la transcription en présence des activateurs spécifiques in vitro Gal4-VP16 et Gal4-SP1 (Pan et al., 1997). De plus, un crible double-hybride réalisé chez la levure et des expériences de coimmunoprécipitation de protéines révèlent que le domaine I interagit avec la sous-unité Med13 du Médiateur et avec la sous-unité Spt8 du complexe SAGA (Wery et al., 2004). L’ensemble de ces données suggérent un rôle du Médiateur et de SAGA au cours de l’élongation ou alors un rôle de TFIIS au cours de l’initiation.
Le domaine I n’est pas essentiel à l’activité de clivage (Awrey et al., 1998). Les domaines II et III qui apparaissent dans le modèle de cristallographie avec Pol II sont suffisants pour l’activité de clivage de TFIIS, in vitro (Nakanishi et al., 1995). Le domaine II interagit avec la sous-unité Rpb1 de Pol II. Isolé, ce domaine a une affinité pour la polymérase comparable à celle de TFIIS entier (Awrey et al., 1998). Des mutations de l’hélice !3 dans les résidus K196, R198, R200 et K209 qui sont en contact avec Pol II dans le
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Figure 11: Architecture de TFIIS associée à l’ARN polymérase II de S. cerevisiae.
(A) Structure primaire et organisation en domaine de TFIIS. Le diagramme montre la répartition des trois domaines de TFIIS le long de la structure primaire de la séquence de la protéine. Les domaines I, II et III sont respectivement représentés en bleu, vert et orange. Le linker entre les domaines II et III est en jaune. Les limites des domaines sont indiquées au- dessus de la figure en numérotant à partir du premier acide aminé N-terminal.
(B) Panneau de gauche : Structure du domaine I isolé obtenu en RMN. D’après Booth et al., (2000). Panneau de droite : Structure des domaines II et III obtenu par diffraction au rayon X du complexe TFIIS/Pol II. Les résidus basiques nécessaires à la liaison de TFIIS à la Pol II et le motif RSADE essentiel à l’activité de clivage sont indiqués en rouge.
(C) Structure des résidus 148 à 309 de TFIIS liés à l’ARN polymérase II. D’après Kettenberger et al., (2004).
CHAPITRE III : LE FACTEUR D’ELONGATION TFIIS modèle structural (Kettenberger et al., 2004), suffisent à abolir l’interaction entre TFIIS et Pol II in vitro (Awrey et al., 1998). Le domaine II joue donc un rôle clef au sein de TFIIS puisqu’il est responsable de son association avec Pol II.
Le linker pénètre dans le cœur de l'ARN polymérase et y projete le domaine III au niveau du site actif de l’enzyme (Kettenberger et al., 2004). Le linker est essentiel et ne peut pas être supprimé pour l’activité de stimulation de clivage de TFIIS, cependant les mutations des résidus conservés du linker n’affectent que modérément le rôle du facteur (Awrey et al., 1998).
Enfin, le domaine III est essentiel à l’activité de TFIIS (Olmsted et al., 1998). Ce domaine porte le motif RSADE qui est extrêmement conservé au cours de l’évolution et chez tous les paralogues de TFIIS. Dans le modèle structural, le motif RSADE se trouve au niveau d’un magnésium clef du site catalytique de l'ARN polymérase (Kettenberger et al., 2004).
Cette position semble lui permettre de favoriser l’activité de clivage intrinsèque de Pol II. La simple mutation de l’acide glutamique à la fin du motif ne diminue que partialement l’activité de TFIIS, par contre, son association avec la mutation de l’arginine abolit complètement l’activité de stimulation de clivage du facteur, sans pour autant diminuer son association avec Pol II (Awrey et al., 1998).
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CHAPITRE IV : LE MEDIATEUR DE LA TRANSCRIPTION PAR L’ARN POL II