Identification des régions chromosomiques conférant le phénotype

Dans la plupart des cas, la région physique co-ségrégeant avec le QTL est de grande taille (plusieurs dizaine de cM) et contient donc de nombreux gènes. Par exemple, Chez A. thaliana, la région chromosomique identifiée lors de la recherche de QTL impliqués dans le contrôle de la date de floraison contient jusqu’à 38 gènes (Werner et al., 2005). Des gènes co-localisant avec le QTL d’intérêt peuvent être sélectionnés sur la base de leur fonction prédite. Néanmoins, les progrès techniques les plus récents dans le secteur de la biologie moléculaire et de la génomique, ont désormais rendu possible le clonage positionnel (identification sur la base de sa position sur le chromosome) des QTL. Une alternative néanmoins moins longue et fastidieuse consiste à coupler chez un ensemble d’individus une analyse de leur transcriptome ou de leur protéome avec une analyse de leur phénotype. Elle permet alors de détecter des gènes ou des protéines candidats (Fig. 15 ; Tuberosa and Salvi, 2006).

3.3.1. Le clonage positionnel

Quand la position approximative du locus est établie, le clonage positionnel permet d’assigner à un QTL un intervalle génétique le plus court possible, en obtenant grâce à la cartographie fine un marqueur moléculaire de chaque côté du locus et le plus proche possible de celui-ci (« QTL fine genetic mapping »). La population utilisée est issue du croisement de lignées quasi-isogéniques (« nearly isogenic lines », NILs) qui ne diffèrent que pour la région du QTL (habituellement entre 10 et 30 cM). Elle peut être produite selon différentes méthodes : (i) introgression à l’aide de croisements assistés par marqueurs d’un allèle du QTL dans un ou deux fonds génétiques parentaux, (ii) identification des individus hétérozygotes dans la région du QTL ; (iii) croisements avancés de l’analyse de QTL (« advanced backcross QTL analysis », ABQA) qui permet une combinaison de l’introgression de segments chromosomiques d’une accession sauvage dans une lignée élite et de la sélection par marquage moléculaire et phénotypage. Lorsque la résolution génétique s’approche du niveau du cM, les marqueurs les plus proches du QTL permettent un encrage de la carte génétique sur la carte physique, c’est-à-dire une séquence génomique ou un BAC couvrant la région du QTL. Ce transfert sur la carte physique

A B

Figure 16. La démarche gène et protéine candidats (d’après de Vienne et al., 1999). Deux cas de figure peuvent apparaître : (A) le QTL et le PQL co-localisent avec le gène codant la protéine candidate. Le gène est donc lui-même le candidat ; (B) le QTL et le PQL ne co-localisent pas avec le gène codant la protéine. Dans ce cas, le PQL n'est pas identifié. Il peut s'agir de tout gène dont le polymorphisme a une influence sur l'accumulation de la protéine, tel qu'un facteur de transcription ou un partenaire protéique. Ne pouvant pas exclure que la co-localisation soit due à l'effet du hasard, ne sont considérées comme candidates que les protéines pour lesquelles plusieurs co-localisations PQL/QTL sont observées.

INTRODUCTION

27 permet l’identification de nouveaux marqueurs qui servent à affiner encore plus la cartographie génétique de la région du QTL et dans la recherche de gènes candidats. Dans cette phase, la bioinformatique fournit une contribution importante en termes de prédiction de gènes et d’annotation et d’exploitation des relations synténiques entre différents génomes. Après l’identification d’un ou plusieurs gènes ou séquences candidats, il reste à établir l’étape ultime qui est la démonstration que le gène identifié est bien le QTL recherché. Cette démonstration peut être réalisée par génétique d’association (recherche de corrélations entre des marqueurs moléculaires et le caractère d’intérêt dans une large collection de plantes représentant au mieux la diversité existant dans l’espèce), par complémentation fonctionnelle si l’on dispose d’un mutant ou par sur-expression ou sous- expression du gène identifié via la transgénèse.

3.3.2. La stratégie gènes et protéines candidats

Le clonage positionnel est une méthode longue et fastidieuse. L’utilisation de la génomique fonctionnelle a donc permis des avancés nombreuses pour l’analyse et l’identification des QTL. En effet, l’analyse du transcriptome ou du protéome d’une population cartographiée peut permettre de considérer le niveau d’expression d’un seul gène comme un caractère quantitatif et de disséquer son contrôle génétique selon les méthodes classiques de la cartographie de QTL (Salvi and Tuberosa, 2005). Lorsque c’est la quantité de transcrit qui diffère on parle de eQTL pour « expression QTL » (Rockman and Kruglyak, 2006), alors que quand c’est la quantité de la protéine qui varie on parle de PQL pour « protein quantity locus » (Damerval et al., 1994).

Le laboratoire de Génétique Quantitative Moléculaire et Protéomique (GQMP), dans lequel j’ai effectué ma thèse, a mis en œuvre une stratégie « protéine candidate » combinant deux cribles : le premier, physiologique, consiste à retenir uniquement les protéines dont l’expression est modifiée en réponse au déficit hydrique, alors que le second, génétique, consiste à rechercher parmi ces dernières celles, dont les PQL sont co- localisés avec des QTL de réponse physiologique, morphologique ou agronomique de la plante au déficit hydrique. Deux cas de figures peuvent se présenter (Fig. 16) :

(1) Le PQL et le QTL sont co-localisés avec le gène codant la protéine en question.

Le plus probable dans ce cas est qu'il existe un polymorphisme dans le gène (éventuellement dans le promoteur) qui influe sur le niveau d'expression de la protéine et en conséquence sur le caractère étudié. Le gène est donc lui-même le QTL candidat (Fig.

16A).

INTRODUCTION

28 (2) Le QTL et le PQL ne sont pas co-localisés avec le gène codant la protéine (Fig.

16B). Dans ce cas, le PQL n’est pas identifié. Il peut s’agir d’un gène dont le polymorphisme a une influence sur l’accumulation de la protéine, tel qu’un facteur de transcription, mais aussi d’un gène impliqué dans le turnover ou les modifications post- traductionnelles de la protéine.

L’hypothèse du lien de cause à effet entre la variation d’expression de la protéine et celle du caractère étudié peut être faite, mais on ne peut pas exclure que la co-localisation soit l’effet du hasard. Les « protéines candidates » sont régulées en réponse au déficit, et leur variation d'expression pourrait être la cause de celle de caractères phénotypiques. La preuve finale de cette liaison de cause à effet doit être apportée par transgenèse ou par génétique d’association.