310 Tableau 39 : Constantes cinétiques d'inhibition de l'efflux de Hoechst 33342 par de fortes concentrations de QZ59-(SSS) 312 Tableau 40 : Constantes cinétiques d'inhibition de l'efflux de Hoechst 33342 par de faibles concentrations de QZ59-(SSS).
L ECANCER
Développementd'uncancer
Cette phase est essentielle et dépend notamment de nos prédispositions génétiques au métabolisme de substances pro-cancérigènes en cancérigènes ou à la réparation plus ou moins efficace des dommages de l'ADN. Phase de stimulation ou d'accélération : de nombreux cofacteurs peuvent intervenir, agissant de manière prolongée ou répétitive, avec des effets cumulatifs en stimulant les cellules déclenchées.
Traitements
- Chirurgie
- Radiothérapie
- Chimiothérapie
- Principegénéral
- Lesdifférentesclassesd'agentsanticancéreux
La chimiothérapie consiste à administrer une substance chimique pour tuer les cellules cancéreuses. Ces molécules thérapeutiques, également appelées cytotoxiques, ciblent les cellules en division rapide en arrêtant leur division cellulaire et en provoquant leur mort.
Mécanismesderésistance
- Mécanismesnoncellulairesderésistance
- Mécanismescellulairesderésistance
- Mécanismedépendantdelacible
- Modificationdeladisponibilitéintratumoraledumédicament
- Mécanismeindépendantdelacibleoudeladrogue
Dans ce cas, la concentration du médicament anticancéreux diminue dans les cellules ou dans la circulation plasmatique. L'expression de ces enzymes résulte de l'induction génique ou de la variabilité génétique des cellules cancéreuses et est indépendante du type de tumeur (Zhang et al., 2006).
L ESTRANSPORTEURS ABC
ClassificationdestransporteursABC
La classe 2, qui regroupe tous les systèmes non impliqués dans un phénomène de transport, est constituée uniquement de domaines nucléotidiques. Enfin, la classe 3, qui correspond principalement aux systèmes d'import impliquant le BPD (« Binding Proteindependent »), comprend les domaines nucléotidiques qui ne sont pas liés de manière covalente aux domaines transmembranaires ( Dassa et Bouige, 2001 ).
TopologiegénéraledestransporteursABC
- Lesdomainestransmembranaires
- Les«NucleotideBindingDomain»
- Donnéesstructurales
- Lesmotifsconservés
- Lefonctionnementd’unNBD
Figure 9 : Interaction de l'ATP avec Walker A et la signature S de 2 NDB adjacents de MJ0796. La caractérisation du site de liaison de l'ATP sur le NBD a été réalisée grâce à la résolution de la structure de la protéine MJ0796 (Smith et al., 2002).
StructuredesexportateursABC
Ces co-cristaux indiquent que la forme ouverte est compatible avec la liaison du médicament aux domaines transmembranaires. La figure 12C montre la forme de la protéine après liaison du nucléotide aux NBD.
MécanismedestransporteursABC
Le cycle de transport est divisé en 7 étapes consécutives : (1) Fixation du substrat aux TMD e. Il semble que la libération de substrat induit un changement conformationnel des NBD qui sont alors capables d'hydrolyser l'ATP (Higgins et Linton, 2004).
LestransporteursABChumains
- Lesdifférentesclasses
- ABCA
- ABCB
- ABCC
- ABCD
- ABCEetABCF
- ABCG
- RégulationtranscriptionelledestransporteursABC
- LerôlephysiologiqueetlalocalisationtissulairedestransporteursABC
- LestransporteursABCdanslesmaladies
- Lesmaladiescauséesparl’inactivationd’untransporteur
- Lesmaladiescauséesparlasurexpressiond’untransporteur
Cela pourrait être une explication possible de la surexpression de ABCB1 dans de nombreux cancers colorectaux (Yamada et al., 2000). Il a été démontré in vitro que la surexpression de 12 transporteurs ABC est impliquée dans la résistance cellulaire aux médicaments (Szakacs et al., 2006).
LaglycoprotéineP
- Découverte
- Localisationtissulaireetcellulaire
- Rolesphysiologiques
- BarrièresHématotissulaire
- Transportd’hormones
- Letransportdelipides
- Intestinsfoiereins
- Polymorphisme
- Topologieetstructured’ABCB1
- Topologied’ABCB1
- Structurechezl’hommeeouchezlasouris
- Substrats/allocrites
- Lespectredessubstratstransportés
- Lescaractéristiquesdessubstrats
Cette augmentation rapide suggère une induction de l'expression de ABCB1 par des facteurs tumoraux, plutôt qu'une sélection de cellules tumorales surexprimant ABCB1 (Abolhoda et al., 1999). Il a également été démontré que ABCB1 catalyse l'efflux de lipides tels que les analogues de la phosphatidylcholine (PC) (van Helvoort et al., 1996) et le cholestérol (Liscovitch et Lavie, 2000). Ceci permet d'identifier les acides aminés pouvant être impliqués dans la liaison des substrats de ces deux formes d'ABCB1 (Figure 19).
La figure 20 illustre la cavité et les poches de liaison dans le modèle ABCB1 établi par Pajeva (Pajeva et al., 2009).
LaBreastCancerResistanceProtein
- Découverte
- Localisationtissulaireetcellulaire
- Rôlesphysiologiques
- Barrièreshématotissulaire
- Intestinscolonfoiereins
- Glandesmammaires
- Cellulessouches
- Polymorphisme
- LamutationR482T/G
- Mécanismetopologie
- Topologie
- Dimérisation
- Donnéesstructurales
- Substratstransportés
- Lespectredessubstrats
- Lesdifférentssitesdefixations
L'expression de ABCG2 dans les glandes mammaires est considérablement augmentée pendant la lactation (Jonker et al., 2005). La même année, il a été démontré que ABCG2 protège les cellules SP en cas de stress oxydatif (Martin et al., 2008). La dimérisation de ABCG2 se produit au début de la biosynthèse dans le réticulum endoplasmique (Polgar et al., 2010).
Par la suite, le rôle de ABCG2 dans le maintien de cette homéostasie a été suggéré (Krishnamurthy et al., 2004).
L ESINHIBITEURSDESTRANSPORTEURS ABC
Anticancéreuxnontransportés
Inhibiteurs
- Lesinhibiteursd’ABCB1
- Premièregénérationd’inhibiteurs
- Secondegénérationd’inhibiteurs
- Troisièmegénérationd’inhibiteurs
- Inhibiteurscompétitifsounoncompétitifs
- Lesinhibiteursd’ABCG2
- Lesinhibiteursspécifiques
- Lesinhibiteursnonspécifiques
- Lesflavonoïdesetleursdérivés
- Autrestypesd’inhibiteurs
- Lecasparticulierducurcumin
- Leséchecsdesessaiscliniques
74 de la membrane plasmique ou localisées dans les domaines intracellulaires et/ou les NBD ne sont pas exclus (Smriti et al., 2009). Cependant, Pajeva et ses collègues suggèrent que les substrats restent liés aux mêmes résidus sous forme ouverte ou fermée (Pajeva et al., 2009). 87 Cette cystéine 603 n'est pas la seule responsable de la dimérisation du transporteur dans les cellules intactes (Ni et al., 2010).
Ces substrats peuvent être spécifiques à un transporteur ou peuvent être 2 ou 3 en commun (Figure 29) (Litman et al., 2000). Ce groupe a montré plus tard que cet inhibiteur bloque directement ABCG2 (Rabindran et al., 2000). La curcumine contient 3 curcuminoïdes principaux : la curcumine (curcumine I), la déméthoxycurcumine (curcumine II) et la bisdéméthoxycurcumine (curcumine III) (Chearwae et al., 2006) (Figure 43).
Combinaisond’inhibiteurs
Même si les essais cliniques se sont jusqu’à présent soldés par des échecs, les inhibiteurs actuels sont plus prometteurs que les précédents. Les résultats des essais cliniques en cours seront déterminants pour le développement de ces inhibiteurs.
Formulationdesanticancéreuxoudesinhibiteurs
Lespeptidesspécifiquesetlesanticorps
Inhibitiondel’expressiondestransporteursABC
- InhibitiondelatranscriptiondestransporteursABC
- InhibitiondelatraductiondestransporteursABC
- Oligonucléotidesantisensciblantl’ARNm
- LessiRNA
- Les“shorthairpinRNA”(shRNA)
K2-5F : une construction contenant des domaines de liaison à l'ADN qui reconnaissent le promoteur ABCB1 (Xu et al., 2002). Cependant, son efficacité a été démontrée pour inhiber l’expression du VEGF (facteur de croissance endothélial vasculaire) (Tafech et al., 2006). La transcription peut alors augmenter et les protéines reviennent à leur niveau d'origine 7 jours après l'administration du siRNA (Wu et al., 2008).
Les « vecteurs basés sur les transposons » ont démontré leur efficacité pour inhiber ABCB1 dans les cellules de leucémie myéloïde chronique, augmentant ainsi la concentration intracellulaire d'imatinib (Widmer et al., 2007).
Mortsélectivedescellulesmultiresistantes
A : Activité d'hydrolyse de l'ATP mesurée après stimulation (barres grises) ou non (barres noires) avec 10 µM de sulfasalazine. Nous avons ensuite mesuré l'activité d'hydrolyse de l'ATP de la protéine native ou mutée après stimulation par un substrat. Il en résulte une activité d’hydrolyse de l’ATP 4 fois supérieure à celle des protéines naturelles.
Il serait alors intéressant de mesurer si l’activité d’hydrolyse de l’ATP est stimulée par différents substrats.
Clonaged’ABCG2danslevecteurpcDNA5/FRT
- Plasmidesutilisés
- PréparationduplasmidepcDNA5/FRTH6ABCG2
- PolymeraseChainReaction
- PurificationdesproduitsdePCRoudesproduitsdedigestion
- RestrictiondesADN
- Ligature
- AmplificationduplasmidepcDNA5/FRTH6ABCG2
- Souchebactérienne
- Préparationdesbactériescompétentes
- Transformationdesbactériescompétentes
- Préparationanalytiqued’ADN
- Préparationquantitatived’ADN
- Analyseduplasmideobtenu
- Pargeld’électrophorèse
- Parséquençage
Les tampons pour les activités des deux enzymes BamH1 et XhoI ne étant pas compatibles, la digestion de l'ADN s'effectue en 3 étapes. L'ADN chromosomique est précipité et éliminé par centrifugation tandis que l'ADN plasmidique est retenu sur une colonne de silice avant d'être élué. La solution est refroidie à environ 50°C avant d'ajouter 1 g/ml de GelRed (Interchim), utilisé pour détecter l'ADN sous lumière ultraviolette (UV254 nm).
Les fragments d'ADN sont ensuite visualisés et le gel est photographié sous une lumière UV254 nm.
RéalisationdemutantsdepcDNA5/FRTH6ABCG2parmutagenèsedirigée
- Amorcesutilisées
- IntroductiondelamutationparPCR
- Digestiondubrinparental
La construction d’amorces est une étape importante de la mutagenèse dirigée dont dépend le succès de la mutagenèse. Après homogénéisation, la réaction PCR est réalisée automatiquement dans un appareil PCR « DNA thermal cycler » (MWG-BIOTECH). Les produits PCR sont ensuite placés sur de la glace pendant 2 min pour stopper la réaction.
Une unité DpnI est ajoutée au milieu réactionnel PCR et le tout est incubé à 37°C pendant 2 heures.
Transfectioncellulaire
- Principe
- Protocole
Ils se complexent avec l'ADN plasmidique et favorisent ainsi son entrée dans les cellules de mammifères. Un jour avant la transfection, les cellules sont ensemencées dans une plaque 6 puits à raison de 5 105 cellules/puits sans agents de sélection. Ensuite, 500 µl du mélange sont ajoutés goutte à goutte dans les puits contenant les cellules dans leur milieu de culture.
Ce milieu est changé 4 à 6 heures après la transfection et les cellules sont cultivées dans des conditions normales de culture.
B IOLOGIECELLULAIRE
- Leslignéescellulaires
- NIH3T3etNIH3T3MDRG185
- HEK293pcDNA3.1etHEK293pcDNA3.1ABCG2R482
- LesFlpIn TM 293
- Culturecellulaire
- Stockagedescellules
- Décongélation
- Congélation
- Numérationcellulaire
- Cytométrieenflux
- Principe
- Appareillage
- Lesparamètresétudiés
- Etudedel’adressagedesprotéines
- Mesuredel’activitédetransportdesmutants
- Mesuredel’activitéinhibitricedescomposéstestés
- TestdecroissancecellulaireparletestauMTT
- Principe
- Protocole
- Testsdechimiosensibilisation
- Immunofluorescence
Les cellules sont remises en suspension dans un milieu de culture et incubées à 37°C sous 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée. Les cellules sont ensuite collectées dans du PBS et conservées sur de la glace, à 4°C, dans l'obscurité jusqu'à analyse avec un cytomètre. J0, h+90 min : les cellules sont lavées, détachées et conservées dans du PBS, à 4°C sur glace jusqu'à analyse par cytomètre.
Où FLA est la fluorescence mesurée dans les cellules exprimant la protéine et incubées avec le substrat.
B IOCHIMIE
- Extractiondesprotéines
- Extractiondesprotéinestotalesdecellulesdemammifères
- Extractiondesprotéinesmembranaires
- Extractiondesprotéinesdetumeurs
- Dosagedesprotéines
- DosageparBradford(Bradford, 1976)
- DosageparBCA(Smith et al., 1985)
- Electrophorèsesurgeldepolyacrylamide
- Séparationdesprotéines
- Colorationaubleudecoomassie
- Colorationaunitrated’argent
- Analyseparimmunodetection:lewesternblot
- ActivitéATPasique
- ActivitéATPasiquebasale
- ActivitéATPasiquestimuléepositivementounégativement
- Mesuredel’hèmeparHPLC
- Préparationdescellules
- MesureparHPLC
- Purification
Les protéines sont fixées sur le gel par incubation pendant 1 heure avec une solution à 50% de méthanol, 12% d'acide acétique et 0,02% de formaldéhyde. La réaction primaire des anticorps est réalisée par incubation pendant une nuit à 4°C en présence d'anticorps monoclonal de souris BXP21 contre ABCG2 dilué 250 fois. Elle est réalisée en mélangeant à 37°C pendant 30 min et stoppée en ajoutant 30 µl de SDS dans chaque puits, suivi d'une incubation de 10 min à 4°C.
Un dosage est effectué par la méthode BCA et l'imidazole est éliminé par dialyse pendant une nuit à 4°C dans 2 bains consécutifs.
T ESTINVIVO
- Lessouris
- Lesmoléculestestées
- Testsdetoxicitéaigüe
- Testsdechimioréversion
- Lessouris
- Protocole
- Implantationdestumeurs
- Déroulementdutest
- Sacrificedessouris
- Testsdepharmacocinétique
- Dosagedel’irinotécanetduSN38
- Extractioninvitro
- Extractioninvivo
- DosageparHPLC
Chaque groupe est constitué de 6 souris, xénogreffes sous-cutanées en double, dont 3 avec des cellules HEK-293 pcDNA3.1 (témoin) et 3 avec des cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 R482 (test). L'expérience a été réalisée avec 4 groupes de 3 souris auxquelles ont été injectés des cellules HEK-293 pcDNA3.1 (2 groupes) ou des cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 R482 (2 groupes) dans le péritoine. Il s'agit de HEK-293 pcDNA3.1 et HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 R482, cultivés dans des conditions standards (Partie Matériels et méthodes II.2. Culture cellulaire).
En effet, les tumeurs HEK-293 pcDNA3.1 traitées à l'irinotécan ne grossissent pas, tandis que les tumeurs exprimant ABCG2 croissent plus rapidement, obligeant à sacrifier prématurément les souris.
B IO INFORMATIQUE
Docking
L'activité d'hydrolyse de l'ATP est mesurée sur des membranes cellulaires préparées comme décrit dans la section Matériels et méthodes. A l’inverse, on peut également noter qu’une augmentation de l’activité d’hydrolyse de l’ATP entraîne un efflux de substrat plus actif. B : L'activité d'hydrolyse de l'ATP est mesurée sur la protéine native et sur 2 mutants après stimulation par des concentrations croissantes de prazosine.
Ce composé est utilisé pour stimuler l'activité d'hydrolyse de l'ATP de ABCG2, 2 à 4 fois selon Solvobiotech.
E TUDED ’ABCG2 PARMUTAGENESEDIRIGEE
LalignéeFlpIn TM 293
Pour insérer le gène ABCG2 dans le génome des cellules hôtes, ce système nécessite 3 éléments essentiels. Il contient le même site FRT que les cellules hôtes Flp-InTM, permettant son insertion dans le génome des cellules. Le gène de la protéine d'intérêt ne sera ainsi intégré qu'une seule fois dans le génome et dans une région connue et identique pour chaque cellule.
B : Quantification, réalisée par le logiciel Quantum One, du niveau d'expression de ABCG2 par rapport au niveau d'expression de la tubuline dans les cellules.
Comparaisonde2lignéscellulaires
- Expressiond’ABCG2
- Tauxd’expressiond’ABCG2
- Adressaged’ABCG2àlamembraneplasmique
- Transportdesubstrats
- Activitéd’hydrolysed’ATP
Histogramme montrant la fluorescence résiduelle de la mitoxantrone dans les cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 (A) et Flp-InTM-293 ABCG2 (B). En conclusion, même si les cellules Flp-InTM-293 ABCG2 expriment moins de protéines, l'expression apparaît plus homogène que pour les cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2. L'étape suivante consistait à vérifier la capacité de transport d'ABCG2 dans les cellules Flp-InTM-293.
Le deuxième point à noter est que les cellules Flp-InTM-293 ABCG2 semblent en réalité plus homogènes que les cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2.
Lesmutants
- Lechoixdesmutants
- Tauxd’expressiond’ABCG2mutédanslescellulesFlpIn TM 293
- Tauxd’expressiontotal
- Tauxd’expressionàlamembraneplasmique
- Caractérisationsdesmutants
- Transportdesubstrats
- Activitéd’hydrolysed’ATP
- Essaisdepurification
Les valeurs KM et Vmax' permettent d'estimer l'activité d'hydrolyse de l'ATP de chaque mutant (rapport Vmax'/KM). Ainsi, ce rapport est divisé par deux pour le mutant H350A, reflétant une activité d'hydrolyse de l'ATP moins efficace que la protéine native. Ainsi, un transport plus actif du substrat (dû, par exemple, à une meilleure reconnaissance) peut conduire à une augmentation de l’hydrolyse de l’ATP.
Il sera donc intéressant de mesurer l'activité d'hydrolyse de l'ATP en présence de substrats pour lesquels une augmentation du transport a été observée (comme la mitoxantrone).
D EVELOPPEMENTD ’ INHIBITEURSD ’ABCG2 ET ABCB1
Lesinhibiteurstestésetleurseffets
- Lesclassesd’inhibiteurs
- Lespeptidomimétiques
- Lesazapeptides
- Efficacitéd’inhibitionsurABCB1
- Lespeptidomimétiques
- Lesazapeptides
- Efficacitéd’inhibitiond’ABCG2
- Lespeptidomimétiques
- Lesazapeptides
- Testsd’efficacitéd’inhibitiond’ABCC1
- Comparaisondesefficacitésd’inhibitionsur3transporteursABC
Les composés testés ici sont des dérivés de dipeptides analogues, à base de réversine 121 (Sharom et al., 1999). Dans cette série, la reversine 121 (Figure 76) présente une bonne affinité et spécificité pour ABCB1 (Sharom et al., 1999). Tenant compte du fait que ABCB1 et ABCG2 partagent plusieurs substrats et inhibiteurs (Figure 85), nous avons émis l'hypothèse que la modification de ces réversions pourrait modifier leur spectre d'action.
Nous avons donc choisi 3 types de modifications pour générer une nouvelle série de composés : modification des groupes protecteurs, modification de la liaison peptidique, ou modification de la chaîne latérale d'un ou des deux résidus d'acides aminés (Figure 77).
Caractérisationdesinhibiteursd’ABCB1
- Demiconcentrationinhibitricedesréversines
- Chimiosensibilisation
- Cytotoxicité
- Mécanismed’inhibition
- LaréversineCT1321
- LaréversineCT1336
- LaréversineCT1347
- Simulationdedocking
Caractérisationsdesinhibiteursd’ABCG2
- ConcentrationsdedemiinhibitiondesmeilleuresréversinespourABCG2
- Chimiosensibilisation
- Cytotoxicitédesréversines
- CaractérisationdelaréversineCT1364
- Mécanismed’inhibition
- LaréversineCT1364nesefixepassurECL3
- Diminutiondel’activitéd’hydrolysedel’ATP
- Efficacitéd’inhibitiondel’effluxdesubstratsparlemutantABCG2 R482T
- Diminutiondel’expressiond’ABCG2
- Testsinvivo
Etudededockingpréliminaire
Concentrationdedemiefficacitéd’inhibition
CytotoxicitédesinhibiteursQZ59
Additivitédesefficacitésd’inhibition
- Hoechst33342
- Ladaunorubicine
Typed’inhibition
- L’inhibiteurQZ59(RRR)
- Mécanismed’inhibitiondel’effluxdedaunorubicine
- Mécanismed’inhibitiondel’effluxdeHoechst33342
- L’inhibiteurQZ59(SSS)
- Mécanismed’inhibitiondel’effluxdedaunorubicine
- Mécanismed’inhibitiondel’effluxdeHoechst33342
- Mécanismed’inhibitiondel’effluxdeprazosine
A UTRESTESTS
Testsinvivodel’inhibiteurMBLI87
- Rappels(publiés dans Boumendjel et al., 2007)
- Testsinvitrosupplémentaires
- Modulationdel’effluxdel’irinotécanparABCG2
- Cytotoxicitédelaformulation
- Testsinvivo
- Toxicité
- Pharmacocinétique
- RéversionduphénotypeMDR
- Tauxd’expressiond’ABCG2danslesxénogreffes
Activitéd’ABCG2purifiée
