Comparaisonde2lignéscellulaires

L’utilisation de ce système pour l’expression d’ABCG2 et l’étude des mutants a été validée par Tamura et collaborateurs en 2006 (Tamura et al., 2006). Cependant, nous avons souhaité comparer l’expression et l’activité d’ABCG2 dans ce système avec le modèle d’expression utilisé habituellement dans notre laboratoire : les cellules HEK-293 transfectées avec le plasmide pcDNA3.1 ABCG2.

2.1. Expression d’ABCG2

2.1.1. Taux d’expression d’ABCG2

Le premier contrôle effectué a été la quantification et la comparaison de l’expression d’ABCG2 dans les 2 systèmes. Pour cela, un western blot est réalisé sur un extrait cellulaire de protéines et les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 59.

Ainsi, les cellules Flp-In^TM-293 ABCG2 expriment environ 5 fois moins la protéine que les cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 (22% versus 100%). La diminution d’expression était attendue puisqu’une copie seulement du gène d’ABCG2 est insérée dans le génome des cellules Flp-In^TM-293 contre un nombre variable de copies dans celui des cellules HEK-293.

2.1.2. Adressage d’ABCG2 à la membrane plasmique

L’expression d’ABCG2 à la membrane plasmique a été quantifiée par l’utilisation de l’anticorps 5D3, couplé à la phycoérythrine et dirigé spécifiquement contre la 3^ème boucle extracellulaire d’ABCG2. La quantification de la fluorescence, proportionnelle au taux de protéines ABCG2 exprimées à la membrane plasmique, a été réalisée par cytométrie en flux comme décrit dans la partie Matériels et méthodes. Les mesures effectuées sont présentées dans l’histogramme de la Figure 60.

De la même façon que pour le taux d’expression d’ABCG2, l’adressage à la membrane plasmique de la protéine est plus faible dans les cellules Flp-In^TM-293 : ABCG2 est environ 8 fois moins abondant à la membrane de ces cellules comparé aux cellules HEK-293.

Cependant, on observe une différence qualitative notable dans l’adressage d’ABCG2 dans ces 2 systèmes : les cellules Flp-In^TM-293 ABCG2 ont un adressage plus homogène que les cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2. En effet, le pic de fluorescence de ces dernières

160

HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 Flp-In-293 ABCG2

Accumulation de mitoxantrone, %

0 20 40 60 80 100

C

Figure 61 : Quantification de l’efflux de mitoxantrone par ABCG2 dans 2 systèmes d’expression.

Histogramme représentant la fluorescence résiduelle de mitoxantrone dans les cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 (A) et Flp-In^TM-293 ABCG2 (B). La mesure du transport par ABCG2 est réalisée comme décrit dans la

partie Matériels et méthodes. La mitoxantrone est excitée à 488 nm par le laser argon du cytomètre et son émission est mesurée à 650 nm. Les valeurs sont en unité arbitraire (a.u.).

C : La quantification est réalisée en prenant comme 100% d’accumulation les cellules n’exprimant pas ABCG2.

Les valeurs correspondent à des duplicats indépendants.

161 est étalé, trainant particulièrement dans les valeurs basses. Ceci reflète l’hétérogénéité des cellules : certaines expriment plus de protéine ABCG2 à la membrane plasmique que d’autres.

En ce qui concerne les cellules Flp-In^TM-293 ABCG2, le pic de fluorescence est symétrique, les cellules apparaissent donc relativement homogènes.

En conclusion, même si les cellules Flp-In^TM-293 ABCG2 expriment moins de protéine, l’expression semble plus homogène que pour les cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2.

2.2. Transport de substrats

L’étape suivante a été de contrôler la capacité de transport d’ABCG2 dans les cellules Flp-In^TM-293. Nous avons souhaité connaître l’impact de la diminution d’expression et d’adressage d’ABCG2 sur cette activité de transport. Nous avons pour cela quantifié par cytométrie en flux l’efflux de mitoxantrone, substrat fluorescent d’ABCG2, dans les 2 systèmes d’expression. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 61.

L’accumulation de mitoxantrone dans les cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 est plus faible que dans les cellules Flp-In^TM-293 ABCG2, ce qui traduit un efflux moins important de ce substrat dans ces dernières. Cependant, malgré le taux d’expression à la membrane plasmique 8 fois plus faible, l’efflux de mitoxantrone n’est que légèrement diminué : 32% de transport pour HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 contre 22% de transport dans les cellules Flp- In^TM-293 ABCG2. Les protéines adressées à la membrane plasmique, dans le 1^er système, ne sont donc, très certainement, pas toutes fonctionnelles.

Le 2^ème point à noter est que les cellules Flp-In^TM-293 ABCG2 semblent effectivement plus homogènes que les cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2. En effet, sur la Figure 61 le pic de fluorescence est plus fin pour la Figure 61B (56 ± 28 a.u) que pour la Figure 61A (33 ± 44 a.u.). Enfin, la quantification de l’efflux de mitoxantrone étant plus reproductible dans les cellules Flp-In^TM-293 ABCG2 que dans les cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2, on peut supposer que le système Flp-In^TM-293 est moins variable dans le temps (Figure 61C).

En conclusion, même si les cellules Flp-In^TM-293 expriment 8 fois moins ABCG2 à la membrane plasmique, le transport de substrats est quasiment équivalent dans les 2 systèmes.

De plus, ce système présente l’avantage d’être plus homogène et plus reproductible.

162

HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 Flp-In-293 ABCG2

Activité d'hydrolyse de l'ATP, nmol/min/mg de protéines membranaires

0 2 4 6 8 10 12 14

Figure 62 : Comparaison de l’activité d’hydrolyse d’ATP vanadate-sensible sur un extrait total de protéines membranaires des 2 systèmes étudiés.

L’activité d’hydrolyse de l’ATP est mesurée sur des membranes de cellules préparées comme décrit dans la partie Matériels et méthodes. L’activité mesurée est vanadate sensible.

163 2.3. Activité d’hydrolyse d’ATP

Afin de comparer l’efficacité d’ABCG2 exprimée dans le système Flp-In^TM-293 et dans les cellules HEK-293, nous mesurons l’activité d’hydrolyse d’ATP d’un extrait de protéines membranaires. La mesure est réalisée en présence de vanadate, un inhibiteur spécifique de l’activité d’hydrolyse d’ATP des transporteurs ABC, permettant de quantifier l’activité spécifique du transporteur. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure ci-contre.

Ainsi, de la même façon que pour le transport de substrat, malgré le taux plus faible de protéines exprimées, l’activité d’hydrolyse d’ATP est quasiment équivalente dans les 2 types cellulaires. On peut donc supposer que les protéines exprimées dans les cellules Flp-In^TM-293 soient plus actives ou bien que les protéines exprimées par les cellules HEK-293 ne soient pas toutes fonctionnelles. Cette 2^ème hypothèse semble plus plausible ; si le taux de production des protéines est trop important, il est possible que certaines ne soient pas repliées correctement et ne soient donc pas fonctionnelles.

164 Figure 63 : Modèle topologique en 2D d’ABCG2. Les résidus mutés sont encerclés en rouge.

Ce modèle a été établi par alignement de séquence avec 3 transporteurs ABC bactériens, BmrA, Sav1866 et MsbA (P.Falson, non publié).

Les résidus sélectionnés, dans ICL0 (H350, H375 et W379) et dans ICL1 (H457), sont mutés en alanine.

FlpInTM293ABCG2H457A FlpInTM293ABCG2W379A FlpInTM293ABCG2H375A FlpInTM293ABCG2H350A FlpInTM293pcDNA5FRT FlpInTM293ABCG2

ABCG2

Tubuline A

ABC G2

ABC G2 H

350A ABC

G2 H 375A

ABC G2 W3

79A

ABC G2 H457A

Taux d'expression d'ABCG2 / taux d'expression de la tubuline, %

0 20 40 60 80 100 120

B

Figure 64 : Quantification du taux d’expression d’ABCG2 muté.

A : Western-blot réalisé sur un extrait de protéines totales. Les anticorps dirigés respectivement contre ABCG2 et la tubuline sont BXP21 et l’anti tubuline D.

B : Quantification, par le logiciel Quantity One, du taux d’expression d’ABCG2 rapporté à l’expression de la tubuline. Le 100% d’expression correspond au taux d’expression de la protéine naturelle ABCG2.

165