Le gène d’ABCG2 possédant une étiquette 6 histidines du coté N-terminal est sous-cloné du plasmide pFastBacDual-H6-ABCG2-NinaA (Trometer and Falson) au plasmide pcDNA5/FRT. Pour cela, une 1ère étape de PCR est réalisée afin d’ajouter un site de clivage par BamH1 en amont du gène de H6-ABCG2. La séquence amplifiée et le plasmide pcDNA5/FRT sont alors digérés par BamH1 et XhoI et une ligature permettra ensuite de générer le plasmide pcDNA5/FRT-H6-ABCG2.
120 1.1. Plasmides utilisés
Les plasmides utilisés pour le sous-clonage sont :
- pFastBacDual-H6-ABCG2-NinaA établi au laboratoire (Trometer and Falson) (Figure 45A),
- pcDNA5/FRT (Invitrogen) : vecteur possédant le site d’insertion FRT (Figure 45B).
pFastBacDual-h6ABCG2-NinaA (corrected)
8119 bp
Gm(R) Amp(R)
H6-ABGC2 PH promoter p10 promoter
pUC origin f1 origin
NinaA
Tn7L
Tn7R
XhoI (4311)
pFastBacDual-H6-ABCG2-NinaA 8119 pb
A
pcDNA5/FRT
5069 bp Amp(R)
Hygro(R) (no ATG) MCS CMV promoter bla promoter
T7 promoter
pUC origin
FRT BamHI (930)
XhoI (986)
pcDNA5/FRT 5069 pb B
Figure 45 : Plasmides utilisés pour le clonage et l’expression d’ABCG2 dans le système Flp-InTM-293.
A : pFastBacDual-H6-ABCG2-NinaA. Il contient (i) le gène d’abcg2 possédant une étiquette 6 histidines du coté N-terminal, (ii) le gène de résistance à l’ampicilline permettant la sélection des bactéries transformées avec
le plasmide, (iii) 1 site de restriction par Xho1 en aval d’abcg2.
B : pCDNA5/FRT permettant l’expression d’ABCG2 en cellules Flp-InTM-293. Il contient (i) un site de clonage T7 contenant les 2 sites de restrictions BamH1 et Xho1, (ii) un site FRT permettant l’intégration du plasmide
dans le génome des cellules Flp-InTM-293 au site FRT, (iii) un gène de résistance à l’hygromycine B sélectionnant ainsi les cellules ayant intégré le plasmide, (iv) un gène de résistance à l’ampicilline permettant la sélection des bactéries transformées par le plasmide, (v) le promoteur du cytomégalovirus (pCMV) qui permet la
surexpression de la protéine d’intérêt.
1.2. Préparation du plasmide pcDNA5/FRT-H6-ABCG2
1.2.1. Polymerase Chain Reaction
Principe : la « Polymerase Chain Reaction » ou PCR permet d’amplifier un ADN spécifique à partir d’un échantillon peu abondant. Pour cela, 3 phases sont réalisées successivement et répétées plusieurs fois : une phase de désappariement des 2 brins d’ADN, une phase d’appariement des brins monocaténaires avec des amorces et une phase de synthèse des nouveaux brins d’ADN. La réaction nécessite donc 2 amorces oligonucléotidiques qui s’apparient spécifiquement à la séquence à amplifier et qui la définissent en la bornant en 5’ et 3’. Le fait d’utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrices des cycles suivants permet à l’amplification d’être géométrique.
121 Protocole : dans le milieu réactionnel de la PCR se trouvent :
- 5 μl de tampon 10¯ de la polymérase utilisée (Invitrogen) - 1 ng de matrice
- 1 μM d’oligonucléotide 5’ (Sigma-Aldrich) - 1 μM d’oligonucléotide 3’ (Sigma-Aldrich) - 0,2 μM d’ATP, TTP, GTP et CTP (Promega)
- 1 U de Taq DNA polymerase High Fidelity AccuprimeTM d’Invitrogen - H2O qsp 50 μl
Après homogénéisation, la réaction de PCR se fait de manière automatique dans un appareil à PCR « DNA thermal cycle » (MWG-BIOTECH). Les cycles de PCR suivent le schéma suivant :
1er cycle : - dénaturation des brins d’ADN : 94°C, 2 min - hybridation des amorces : 50°C, 30 s
- amplification : 68°C, 3 min
25 cycles : - dénaturation des brins d’ADN : 94°C, 30 s - hybridation des amorces : 50°C, 30 s - amplification : 68°C, 4 min
Dernier cycle : - dénaturation des brins d’ADN : 94°C, 30 s - hybridation des amorces : 50°C, 30 s - amplification : 68°C, 15 min
Les produits de PCR peuvent être gardés à 4°C.
Les amorces utilisées sont :
- oligonucléotide 5’ : 5’ CGGTGCTGGAGGATCCGAATTATTATCAAATCATTTGTATA 3’
Avec GGATCC : site de clivage de BamH1
CGGTGCTGGA : 10 bases en amont du site de clivage facilitant l’action de l’enzyme de restriction
GAATTATTATCAAATCATTTGTATA : séquence complémentaire s’hybridant avec l’ADN - oligonucléotide 3’ : 3’ GGCTAACTGAAACACGGAAG 5’
correspondant à la séquence complémentaire s’hybridant avec l’ADN en amont du site de clivage par XhoI.
1.2.2. Purification des produits de PCR ou des produits de digestion L’ADN amplifié est séparé, à l’aide de silice, des amorces et des réactifs avec le kit Nucleospin Extract de Macherey-Nagel.
122 1.2.3. Restriction des ADN
Chacune des enzymes de restriction utilisée (Promega) est commercialisée avec un tampon qui lui confère une activité optimale. Les tampons des activités des 2 enzymes BamH1 et XhoI n’étant pas compatible, la digestion de l’ADN est réalisée en 3 étapes :
1ère étape : digestion des produits de PCR purifiés et du plasmide pcDNA5/FRT par BamH1. Le milieu réactionnel est :
- 30 μl d’ADN amplifié, purifié (environ 1 μg) ou 2 μg de plasmide - 5 μl de tampon E 10¯
- 10 U de BamH1 - H2O, qsp 50 μl
La réaction est réalisée 2 h à 37°C sous agitation lente.
2ème étape : purification des produits de digestion par le kit Nucleospin Extract de Macherey-Nagel.
3ème étape : digestion des produits de purification par XhoI. Le milieu réactionnel est : - totalité (30 μl) de produits purifiés (ADN amplifié ou plasmide digérés)
- 5 μl de tampon D 10¯ - 10 U de XhoI
- H2O, qsp 50 μl
La réaction est réalisée 2 h à 37°C sous agitation lente.
1.2.4. Ligature
Le plasmide ouvert et les produits de PCR purifiés et digérés sont soumis à l’action de la T4 DNA ligase (Promega). Le rapport molaire produit de PCR / plasmide ouvert doit être de 1/5. L’action de la T4 DNA ligase s’effectue pendant 1 h à température ambiante.
1.3. Amplification du plasmide pcDNA5/FRT-H6-ABCG2
1.3.1. Souche bactérienne
Les bactéries TOP10 de E. coli sont utilisées pour les étapes de clonage. Leur génotype est F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lac74 recA1 araD139 (ara-leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG - (Invitrogen).
1.3.2. Préparation des bactéries compétentes
Principe : On utilise la technique décrite par Cohen et collaborateurs en 1972 (Cohen et al., 1972) selon laquelle la membrane des bactéries est perméabilisée par action de chlorure de calcium.
123 Mode opératoire : Une colonie de bactéries est cultivée une nuit dans 3 ml de LB à 37°C sous agitation. Le lendemain, 1 ml de cette culture est inoculé dans 100 ml de LB toujours à 37°C et sous agitation. Lorsque l’absorbance à 600 nm est comprise entre 0,3 et 0,4, la culture est placée dans la glace pendant 10 min. Les cellules sont centrifugées 7 min à 1600×g à 4°C. Les culots sont alors remis en suspension dans 10 ml de solution A (60 mM CaCl2 (Euromedex), 15% glycérol (Roth), 10 mM de 1,4-pipérazinedianesulfonate (PIPES) (Sigma-Aldrich), pH 7,0) préalablement autoclavée et froide. Le culot, obtenu par centrifugation à 1600×g pendant 5 min est à nouveau remis en suspension et les bactéries sont incubées 30 min dans la glace, puis culotées comme précédemment. Enfin, le culot est repris dans 2 ml de la solution A et aliquoté puis congelé à -80°C.
1.3.3. Transformation des bactéries compétentes
L’ADN à incorporer, environ 50 ng/2 l, est ajouté à 50 l de bactéries compétentes.
Après 20 min dans la glace, un choc thermique est réalisé pendant 2 min à 42°C. Ensuite 250 l de milieu de culture S.O.C (Invitrogen) sont ajoutés et l’ensemble est incubé pendant 1 h à 37°C sous agitation constante. Les bactéries sont alors étalées sur du milieu LB + agar (15 g/l) et 100 g/ml d’ampicilline et sont placées à l’étuve à 37°C pendant 14 à 16 h. Les bactéries ayant incorporé le plasmide se développeront sur milieu sélectif.
1.3.4. Préparation analytique d’ADN
Principe : Après lyse des bactéries par traitement au SDS et au lysozyme, l’ADN chromosomique est précipité par addition de sels de potassium. Le précipité de SDS- protéines-ADN chromosomique est éliminé par centrifugation. Le surnageant contient l’ADN plasmidique et l’ARN (Ish-Horowicz and Burke, 1981).
Protocole : L’ADN a été préparé par l’utilisation du kit Nucleospin Plasmid de Macherey-Nagel. Une colonie de bactéries est mise en culture une nuit à 37°C sous agitation dans 3 ml de milieu LB (25 g/l) contenant 100 Pg/ml d’ampicilline. Les bactéries sont culotées et lysées. L’ADN chromosomique est précipité et éliminé par centrifugation tandis que l’ADN plasmidique est retenu sur une colonne de silice avant d’être élué. L’ajout d’isopropanol permet la précipitation de l’ADN plasmidique qui est alors récupéré par une centrifugation à 15000×g pendant 30 min. L’ADN est lavé par de l’éthanol 70% v/v, séché et repris dans du tampon approprié.
124 1.3.5. Préparation quantitative d’ADN
Le principe est le même que précédemment. Toutes les solutions nécessaires à l'extraction sont fournies par le kit Nucleospin Xtra maxi de Macherey-nagel. Le volume de culture est de 200 ml.
1.4. Analyse du plasmide obtenu
1.4.1. Par gel d’électrophorèse
Les plasmides à analyser sont tout d’abord linéarisés avant d’être déposés. Ici, nous utilisons l’enzyme SpeI (Promega), optimale dans le tampon B. Elle digère pcDNA5/FRT-H6- ABCG2 en 3 fragments et pcDNA5/FRT en 2 fragments. Ceci permet de visualiser facilement l’intégration du gène dans le vecteur.
Les gels d’agarose sont utilisés à une concentration de 0,8% (m/v), soit 0,48 g d’agarose (Sigma-Aldrich) mélangés à 60 ml de tampon TBE 0,5× (Euromedex) (50 mM Tris-borate, pH 8,0, 1 mM EDTA) puis chauffés à 100°C pour dissoudre l’agarose. La solution est refroidie à 50°C environ avant l’ajout de 1 g/ml de GelRed (Interchim), utilisé pour détecter l’ADN sous lumière ultraviolette (UV254 nm). Le gel est ensuite coulé sur un support horizontal. Les échantillons sont additionnés d’une solution de dépôt 6× (Promega) (0,1%
bleu de bromophénol, 10% glycérol, eau milliQ). Un marqueur d’ADN (Promega) est également déposé sur le gel, servant de repère de masses moléculaires, la taille des bandes allant de 80 à 10000 paires de bases. La migration s’effectue sous une tension de 120 à 140 V à température ambiante. Les fragments d’ADN sont ensuite visualisés et le gel est photographié sous lumière UV254 nm.
1.4.2. Par séquençage
Le séquençage des plasmides est réalisé par la société GATC à partir de 30 ng/30 l de plasmide. Les amorces utilisées pour le séquençage sont conçues pour une séquence de 600 à 700 paires de bases, les faisant débuter 50 bases en amont de la partie à séquencer. Le contrôle de la séquence se fait alors par un alignement de séquence avec celle que l’on doit obtenir. Les séquences modèles sont données par le logiciel vecteur NTI. L’alignement de séquence est réalisé par le logiciel ClustalW.
125 2. Réalisation de mutants de pcDNA5/FRT-H6-ABCG2 par