II. B IOLOGIECELLULAIRE
5. Cytométrieenflux
5.1. Principe
La cytométrie en flux permet l’analyse de cellules entraînées dans un flux liquide en utilisant leurs propriétés optiques. Les cellules, alignées les unes derrière les autres et séparées d’au moins 1 mm, défilent individuellement à grande vitesse (environ 10 m/s) devant un laser.
Les cellules sont triées selon 3 paramètres (Figure 50) :
- la taille (paramètre FSC) : la diffraction de la lumière mesurée dans l’axe du laser,
- la granulosité (paramètre SSC) : la diffraction de la lumière mesurée avec un angle de 90°
par rapport à l’axe du laser,
- l’intensité de fluorescence émise (paramètre FL).
SSC:réfraction,texture cellulaire,granulosité Fluorescences
FSC:réflexiondiffraction ombrecellulaire,taille, airedesélection Unecellule
Laser
Figure 50 : Paramètres mesurés par le cytomètre en flux.
On trouve ainsi la taille des cellules (FSC), leur granulosité (SSC) et leur fluorescence.
132 5.2. Appareillage
Un cytomètre en flux est composé de plusieurs parties (Figure 51) :
Figure 51 : cytomètre en flux.
- un système fluidique : flux laminaire qui permet aux cellules en suspension de passer une à une devant le laser.
- un système optique : composé du rayon laser et des filtres permettant de sélectionner les longueurs d’ondes appropriées. Les cytomètres peuvent être équipés d’un ou de plusieurs lasers. Nous trouvons très fréquemment des lasers argon excitant les cellules à 488 nm ; d’autres, tels que le LSRII 4 lasers contiennent des lasers excitant à 488 nm, 633 nm, 355 nm et 561 nm.
- un système électronique : il est composé de photomultiplicateurs (PMT) qui captent la lumière émise, d’un digitaliseur qui la transforme en signal électrique puis en signal numérique et enfin d’un ordinateur qui permet de traiter et stocker les données.
Pour nos analyses, 2 cytomètres seront utilisés : le Facscan et le LSR II 4 lasers.
5.3. Les paramètres étudiés
Les paramètres mesurés sont donc transformés en signal électrique et présentés sous forme de cytogramme. Cela permet de sélectionner les populations à étudier, notées en rose dans l’exemple ci-dessous. Chaque population est la population fille de la précédente.
Les 2 premiers paramètres étudiés sont la taille des cellules (FSC) et leur granulosité (SSC). Ils permettent de sélectionner une population viable (Figure 52).
133 Figure 52 : cytogramme représentant la granulosité des cellules en fonction de leur taille.
L’étape suivante consiste à éliminer les doublets. En effet, lorsque 2 cellules passent en même temps devant le laser, la hauteur de l’impulsion électrique de leur taille (FSC-H) ou de leur granulosité (SSC-H) sera la même mais la largeur de cette impulsion (FSC-W ou SSC- W) sera doublée. Nous éliminons environ 90% des doublets par le 1er cytogramme (Figure 53A) et le 2ème nous permet d’éliminer environ 5% de doublets restants (Figure 53B).
Figure 53 : Elimination des doublets.
Une fois ces doublets éliminés, la fluorescence intracellulaire n’est mesurée que sur cette dernière population sélectionnée, P3. La fluorescence est présentée par la Figure 54.
Figure 54 : Mesure de la fluorescence intracellulaire dans le canal le plus approprié.
La cytométrie en flux est utilisée pour 3 types d’expérimentations détaillées ci-dessous.
134 5.4. Etude de l’adressage des protéines
L’utilisation d’un anticorps spécifique d’ABCG2 couplé à un fluorochrome permet de visualiser et de quantifier l’adressage de la protéine à la membrane plasmique. L’anticorps utilisé ici est le 5D3 (e-bioscience), anticorps de souris reconnaissant spécifiquement la 3ème boucle extracellulaire d’ABCG2, ECL3, couplé à phycoérythrine (PE). Une excitation de cet anticorps couplé à 488 nm permet de mesurer une émission à 520 nm. Les cellules n’étant pas perméabilisées, la fluorescence observée correspond à l’anticorps fixé sur la membrane plasmique donc à l’adressage d’ABCG2 à cette membrane.
Les cellules sont ensemencées à 105 cellules dans une plaque 96 puits et centrifugées à 350×g pendant 5 min. Après lavage au PBS, l’anticorps préparé au 1/10ème dans de la
« Bovine Serum Albumine » (BSA) 2% est ajouté au culot de cellules. Elles sont incubées 30 min à l’obscurité et à température ambiante. Une centrifugation à 350×g permet de retirer l’anticorps et de laver les cellules au PBS. Les cellules sont par la suite récupérées dans du PBS et conservées dans de la glace, à 4°C, dans l’obscurité jusqu’à analyse au cytomètre.
Un contrôle négatif, fourni avec l’anticorps 5D3 permet d’éliminer le bruit de fond lors de l’analyse. Des cellules n’exprimant pas ABCG2 sont analysées de la même façon afin de s’affranchir de la fixation non spécifique de l’anticorps lors de l’analyse.
5.5. Mesure de l’activité de transport des mutants
La cytométrie en flux peut être utilisée pour mesurer une activité de transport. Pour cela, le substrat doit être fluorescent après excitation. Le cytomètre mesure la fluorescence intracellulaire, ainsi, si le substrat est expulsé, la fluorescence intracellulaire sera faible, à la différence du cas où le substrat est peu ou pas expulsé.
Le protocole suivi est résumé sur la Figure 55.
135 Figure 55 : Protocole de cytométrie en flux pour la mesure de transport de substrats ou pour la mesure de
l’activité inhibitrice d’un composé.
J-1 : les cellules sont ensemencées dans une plaque 24 puits à 105 cellules par puits (pour les cellules HEK-293 pcDNA3.1 et HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 R482) ou à 5×104 cellules par puits (pour les cellules NIH3T3 et NIH3T3-MDR G185) et incubées 24 h sous atmosphère humide à 37°C sous 5% de CO2.
J0, h0 : Après avoir lavé les cellules, 100 μl de substrat à la concentration souhaitée leur sont ajoutés avec 100 μl de DMEM. Les cellules sont alors incubées 30 min à 37°C, c’est la phase d’accumulation.
J0, h+30 min : le milieu + substrat est retiré et du DMEM seul est ajouté aux cellules.
Elles sont incubées 1 h à 37°C, permettant à la protéine étudiée d’expulser le substrat.
J0, h+90 min : les cellules sont lavées, décollées et conservées dans du PBS, à 4°C dans de la glace jusqu’à analyse au cytomètre.
En pratique, chaque série d’essais contient (i) un témoin d’accumulation maximum correspondant à des cellules n’exprimant pas le transporteur et accumulant donc un maximum de substrat (100% du test), (ii) un bruit de fond correspondant à des cellules exprimant le transporteur ou non, sans substrat, (iii), l’essai proprement dit où les cellules exprimant le transporteurs sont incubées avec le substrat.
La fluorescence mesurée dans les cellules correspond aux substrats non transportés.
Ainsi, le pourcentage d’accumulation est calculé de la manière suivante :
136 Ψ ൌ െ
െ ൈ ͳͲͲ
Où FLA est la fluorescence mesurée dans les cellules exprimant la protéine et incubées avec le substrat ;
FLB est l’autofluorescence des cellules; elle est mesurée dans les cellules sans substrat ; FLC est la fluorescence maximum dans les cellules ; elle est mesurée dans les cellules n’exprimant pas la protéine et incubées avec le substrat ;
.
5.6. Mesure de l’activité inhibitrice des composés testés
Ce test est quasiment identique à la mesure de l’activité d’efflux. Nous mesurerons l’activité d’efflux de la protéine testée en présence de substrat mais également de composé potentiellement inhibiteur.
Le protocole est présenté en Figure 55. La différence est l’ajout, en plus du substrat, du composé à tester dans les 2 phases d’accumulation et d’efflux.
Les contrôles sont effectués comme précédemment à la différence que l’autofluorescence des cellules est mesurée en présence de l’inhibiteur, ceci dans le but de s’affranchir de la fluorescence potentielle du composé testé.
Afin de calculer l’efficacité du composé, nous mesurons la concentration intracellulaire du substrat. Lorsque l’on ajoute des concentrations croissantes d’un inhibiteur, la fluorescence intracellulaire augmentera avec ces concentrations comme on peut l’observer sur la Figure 56.
NIH3T3MDRG185+substrat NIH3T3+substrat
NIH3T3MDRG185+substrat+0,05μMinhibiteur NIH3T3MDRG185+substrat+0,3μMinhibiteur NIH3T3MDRG185+substrat+0,5μMinhibiteur NIH3T3MDRG185+substrat+0,8μMinhibiteur NIH3T3MDRG185+substrat+1μMinhibiteur
Figure 56 : Exemple de l’augmentation de la fluorescence intracellulaire lorsque l’on ajoute des concentrations croissantes d’un inhibiteur.
L’efficacité du composé testé est alors calculée comme suit :
137
A
0 50 100 150 200 250 300
0,05 0,1 0,3
intracellularfluorescence
[15
"NIH3T3G185+mi toxantrone"
NIH3T3G185+mi toxantrone+i nhi bi teur NIH3T3+mi toxantrone+i nhi bi teur
[inhibiteur],μM
Fluorescenceintracellulaire,a.u.
NIH3T3MDR G185+substrat (FLB) NIH3T3MDR G185+substrat +inhibiteur(FLA) NIH3T3+substrat +inhibiteur(FLC)
Avec ሺΨሻ ൌ െ
െ ൈ ͳͲͲ
Figure 57 : Mesures effectuées pour déterminer l’efficacité d’inhibition d’un composé testé et calcul de son efficacité.
Exemple d’un inhibiteur.