Cette thèse s'intéresse principalement à la régulation de la respiration mitochondriale in situ dans les cellules musculaires cardiaques et squelettiques. Une étude in situ et in silico de l'hétérogénéité de la diffusion et de la respiration de l'ADP.
Participation à des conférences
Modifications de la respiration mitochondriale des muscles squelettiques chez les receveurs de transplantation pulmonaire : effets de la rééducation. Les connaissances actuelles sur la synthèse de l'ATP dans les mitochondries reposent sur la théorie chimiosmotique de Peter Mitchell (1961), qui met en lumière le mécanisme de la phosphorylation oxydative.
INTRODUCTION : Etat actuel des
Organisation des cellules musculaires striées
- Production de l’ATP dans la mitochondrie
- Description générale de la mitochondrie
- La consommation d’ATP
- Appareil contractile - cycle contractile
- Cycle du Ca 2+ cytoplasmique
- Transfert d’énergie par la navette de la créatine kinase et les problèmes de sa régulation
- Les Créatine kinases
- Phénomène de couplage fonctionnel
- Conséquences métaboliques du couplage fonctionnel des créatine kinases
- Régulation de la respiration in situ
- Régulation de la respiration par l’ADP : fibres perméabilisées
- Cinétique de la régulation de la respiration par l’ADP in situ
- Traitement protéolytique et contrôle respiratoire
- ICEUs et communication intracellulaire
- Notion d’unités énergétiques intracellulaires : ICEUs
- Canalisation métabolique de l’ADP exogène et compartimentation intracellulaire Ces complexes jouent un rôle important dans la canalisation métabolique de l’ADP
- Le cytosquelette
- Le cytosquelette dans les cellules musculaires
- Les phénomènes de fission et fusion des mitochondries
L'ATP synthase, située dans la membrane mitochondriale interne, est responsable de la phosphorylation de l'ADP en ATP. L'isoforme mitochondriale de CK (MiCK) est localisée dans l'espace intermembranaire mitochondrial (Wyss et al., 1992 ; Scholte, 1973). L'effet de la créatine était partiellement absent dans les cœurs de grenouilles (Kuznetsov et al., 1996).
Fonction mitochondriale musculaire du sujet transplanté pulmonaire (TP) et réhabilitation
- La transplantation pulmonaire
- Histoire de greffes d’organe
- La transplantation pulmonaire
- Le handicap physique du Transplanté pulmonaire (TP)
- Altérations centrales
- Altérations périphériques : le muscle squelettique du TP
- Adaptation de la fonction mitochondriale du muscle squelettique à un programme de réhabilitation physique
- Contrôle et adaptation du phénotype musculaire
- Modifications induites sur le phénotype musculaire par l’entraînement
- Modifications du phénotype musculaire après l’entraînement
De plus, il faut souligner la participation de l'atrophie musculaire et de la fatigue, qui sont des déterminants particulièrement importants pour mesurer la capacité d'exercice de ces sujets. L'apparition de fibres hybrides, dont certaines contiennent plus de 2 isoformes du CMH, a contribué à la combinaison du marquage de la myosine ATPase et de l'électrophorèse du CMH pour le typage (Gorza, 1990). A cela s’ajoutent les différentes familles de protéines qui entrent dans la composition de la fibre.
La question qui se pose est de savoir si une augmentation de l’Hb lors d’un exercice intense peut entraîner une augmentation de la VO2max. Plus précisément, il a été montré que la taille de la connexion entre le capillaire et la fibre est d'une importance primordiale lorsqu'on considère la capacité structurelle de flux d'oxygène (Mathieu-Costello et al., 1992). Le nombre de capillaires par la fibre musculaire est liée au profil métabolique et à la taille de la fibre.
Le passage de l'O2 entre le globule rouge et le sarcolemme représente le principal site de résistance à la diffusion de l'O2, du fait de la baisse importante de la pO2. Ainsi, il a été proposé que l’augmentation des capacités oxydatives permette une augmentation des performances d’endurance plutôt qu’une amélioration du VO2max.
OBJECTIFS
SCIENTIFIQUES
Description des expérimentations
- Animaux
- Technique des fibres perméabilisées
- Isolement des cardiomyocytes
- Isolement des mitochondries de cœur
- Extraits musculaires de rat
- Sujets humains
- Protocole clinique
Ces souris STOP +/- et STOP -/- sont des souris de la génération issue de croisements entre les premiers hétérozygotes (50% 129SvPas et 50% BALBc) pour la mutation STOP. Le cœur est retiré puis placé dans un récipient contenant une solution mère réfrigérée. Le cœur est ensuite canulé à travers l'aorte et perfusé avec une solution basique à 37 °C et perfusé pendant 4 minutes à un débit de 6 ml/min (environ).
Perfuser ensuite pendant 50 min à 4 ml/min avec la solution B, [Ca2+]= 20-25 µM (voir état de perfusion cardiaque, ce temps peut être augmenté). Une anesthésie locale de la peau et de l'aponévrose est réalisée quelques minutes avant la biopsie. Ensuite, ils sont placés dans la solution A contenant de la saponine à une concentration de 50 µg/mL.
Ces lavages permettent l'élimination des nucléotides saponine, phosphocréatine et adényle présents dans la solution de conservation. En effet, cela permet de préserver l'environnement intracellulaire et donc d'étudier la fonction mitochondriale « in situ ».
Techniques d’étude de la fonction mitochondriale
- Principe général du fonctionnement du polarographe à oxygène ou électrode à oxygène
L'équation de la phosphorylation oxydative indique que le phosphate et l'ADP sont nécessaires au transport des électrons du NADH vers l'oxygène. Sans l'accepteur (ADP), l'intensité de la respiration est très faible et ne s'accompagne d'aucune phosphorylation du fait de l'absence de l'accepteur de phosphate. Cet état connu sous le nom de respiration de stade 2 représente l’état de repos de la respiration, la membrane interne est alors polarisée au maximum.
Le rapport de contrôle accepteur est le rapport entre l'intensité de la respiration des mitochondries en présence d'un excès d'ADP et l'intensité de la respiration en l'absence d'ADP. . Expérimentalement, cela consiste à ajouter à la préparation à étudier la concentration maximale d'ADP responsable de la Vmax (soit 2 mM). La créatine kinase mitochondriale est située dans l'espace intermembranaire, adjacent à l'extérieur de la membrane interne de la mitochondrie.
Dans les fibres perméabilisées intactes, l'ajout de créatine en présence de 0,1 mM d'ADP stimule la respiration par activation de miCK qui régénère l'ADP localement dans l'espace intermembranaire à partir de la créatine et de l'ATP nouvellement synthétisé à partir des mitochondries. Cette double représentation inverse permet de calculer la différence entre mitochondries isolées et in situ.
25 ng atome O
Le principe de ce test est de déterminer des paramètres cinétiques tels que le Km pour l'ADP (affinité apparente pour l'ADP) et la Vmax (fréquence respiratoire maximale). L'intersection de l'abscisse avec la droite donne la valeur négative de l'inverse de Km (-1/Km), tandis que l'intersection de l'ordonnée avec la droite correspond à l'inverse de Vmax . Seul Km est modifié selon que l'on étudie les mitochondries in situ ou isolément.
2 min ADP 4µM
ADP 0.1 mM
ADP 0.75mM
Techniques d’imagerie intracellulaire
- Etude de l’organisation intracellulaire des mitochondries par imagerie confocale : approche qualitative et quantitative
- Etude in situ et in silico de l’hétérogénéité de diffusion de l’ADP et de la respiration mitochondriale dans les cellules perméabilisées
Lors de la comparaison avec les données expérimentales, une moyenne de la vitesse respiratoire a été utilisée. Ces résultats mettent en évidence l’importance de la canalisation locale et de la compartimentation de l’énergie dans les cellules musculaires. Etude in situ et in silico de l'hétérogénéité de la diffusion de l'ADP et de la respiration mitochondriale dans les cellules perméabilisées.
La régulation de la respiration mitochondriale dans le cœur intact diffère de celle des mitochondries isolées. L'hétérogénéité de la diffusion de l'ADP et la régulation de la respiration ont été étudiées in situ et in silico dans des cardiomyocytes et des fibres cardiaques perméabilisés. L'inhibition de la respiration par le système PEP-PK a augmenté 2 à 3 fois après la désorganisation des mitochondries dans les cellules.
Dans les études in silico, nous montrons à travers le modèle mathématique que les résultats peuvent s'expliquer par la diffusion hétérogène de l'ADP due aux limitations de diffusion au niveau. Cela se produit en plus de limiter la perméabilité du MME à l’ADP au sein de la cellule in vivo.
Dans un deuxième travail, nous analysons les données existantes sur les mécanismes cellulaires du
Par conséquent, l’activation parallèle de la contraction et de la respiration mitochondriales par les ions calcium pourrait jouer un rôle mineur dans la régulation de la respiration cellulaire. La régulation efficace de la respiration sous l'effet de la loi de Frank-Starling et la stabilité métabolique du cœur s'expliquent par des mécanismes de couplage fonctionnel au sein de complexes « supramoléculaires » dans les mitochondries et au niveau subcellulaire au sein des unités d'énergie intracellulaires (ICEU).
L'origine des différences significatives dans la cinétique de régulation de la respiration mitochondriale dans les cellules cardiaques in vivo et in vitro est analysée. Le réseau cytosquelettique est important pour l'arrangement mitochondrial et la régulation de la phosphorylation oxydative des cellules musculaires in situ. Nos études précédentes (Kuznetsov, 1996; Voloshchuk, 1998) ont montré une faible affinité de la respiration mitochondriale pour l'ADP exogène dans les muscles oxydatifs (myocarde, soléaire) par rapport aux muscles glycolytiques (long extenseur des orteils, EDL, vaste latéral, VE).
Dans le gastrocnémien blanc, un marquage complètement différent de la tubuline a été observé dans deux fibres adjacentes. Cela reflète donc la spécificité de la répartition de cette protéine dans les cellules musculaires. Ainsi, nous avons montré que l'organisation de la tubuline dépend du type de fibre musculaire.
Dans les cellules musculaires oxydatives, cette augmentation de l'affinité apparente des mitochondries pour l'ADP exogène peut être corrélée à la désorganisation de la tubuline qui va réduire les limitations de diffusion de l'ADP au voisinage des mitochondries. La tubuline mitochondriale est probablement organisée en hétérodimères α/β qui représentent environ 2 % de la tubuline cellulaire.
Étude des changements dans la respiration mitochondriale des muscles squelettiques chez les receveurs de transplantation pulmonaire avant et après la rééducation. Les mécanismes responsables de la limitation de la capacité d'exercice des greffés pulmonaires et les bénéfices de l'entraînement physique ont été étudiés. Cette observation est cohérente avec ce que Zoll a rapporté sur l'activité physique et l'augmentation de l'affinité mitochondriale pour l'ADP spécifiquement chez les receveurs de transplantation cardiaque (Zoll et al b).
Ainsi, l’étude de la respiration mitochondriale in situ dans les fibres musculaires squelettiques perméabilisées permet un diagnostic efficace du métabolisme énergétique intracellulaire sur de petits échantillons de tissus humains. Le thème principal de ce travail est la régulation de la phosphorylation oxydative in vivo dans les cellules musculaires cardiaques et squelettiques. Les mitochondries sont organisées de manière très précise au niveau des bandes A des sarcomères.
Il existe deux niveaux de régulation de la sensibilité des mitochondries à l'ADP : la perméabilité du MME, au niveau du VDAC, et les limitations de diffusion, dans l'environnement des mitochondries à l'intérieur de l'ICEUS des cellules cardiaques. Enfin, nous avons étudié les modifications de la respiration mitochondriale dans les muscles squelettiques de receveurs de transplantation pulmonaire avant et après un programme de réadaptation.
BIBLIOGRAPHIE
Muscle-type creatine kinase interacts with the central domains of M-band proteins, myomesin, and protein M. Isolation of the ryanodine receptor from cardiac sarcoplasmic reticulum and identification with leg structures. Ca, Mg-ATPase activity of permeabilized rat heart cells and its functional coupling to cellular oxidative phosphorylation.
Beta-NADH reduces the permeability of the mitochondrial outer membrane to ADP by a factor of 6. Regulation of mitochondrial respiration by controlling the permeability of the outer membrane through the mitochondrial channel, VDAC. Early ischemia-induced changes of the outer mitochondrial membrane and intermembrane space: a possible cause for altered energy transfer in cardiac muscle.
A comparative study of the role of creatine phosphokinase isoenzymes in energy metabolism of skeletal and cardiac muscle. Function of M-line-bound creatine kinase as an intramyofibrillar ATP regenerator at the receiving end of the phosphorylcreatine shuttle in muscle.
