Racém aminok enzimkatalizált kinetikus rezolválása szakaszos üzemben

Az enantiomer szelektív N-acilezésekhez referenciaként elsőként racém acetamidokat (rac-3a, c, e, g) állítottunk elő hagyományos, nem szelektív módszerekkel. A megfelelő amint (rac-2a, c, e, g) acetil-kloriddal reagáltattuk trietilamin jelenlétében diklórmetánban 0°C-on (28. ábra).

28. ábra Racém aminok (rac-2a, c, e, g) kémiai N-acilzeése acetil-kloriddal

A racém aminok (rac-2a, c, e, g) biotranszformációinak vizsgálata során kereskedelemben kapható és a kutatócsoport saját készítésű enzimkészítményeit^138–140 is teszteltük (összesen 23 biokatalizátor), többféle oldószerben, különböző acilezőszerekkel. Elsőként a megfelelő enzim kiválasztása volt a cél. A reakciókat 30°C-on termosztált, rázatott lombikban végeztük el, etil-acetát acilezőszerrel, toluolban (29. ábra). A reakcióelegyekből 1, 2, 4, 8 és 24 óra

Eredmények és értékelésük 32

elteltével mintákat vettünk, és az enantiomer összetételt királis állófázisú gázkromatográfiás módszerrel határoztuk meg.

29. ábra Racém aminok (rac-2a, c, e, g) enzimkatalizált N-acilezése

A heptán-2-amin (2a) esetében azt tapasztaltuk, hogy a kutatócsoport saját készítésű BUTE 3 (T-2) és SSF9 enzimpreparátumai az N-acilezést ugyan katalizálják, viszont a reakció nagyon lassú, még 24 óra után sem haladta meg a konverzió az 5%-ot, és az enantiomer tisztaság is csak 75-85% közötti érték volt. Ezzel szemben a CaLB N435 és a CaLB T2-150 használatakor az ee értékek mindkét esetben 98% felettiek voltak, egyedül a reakciósebesség tekintetében mutatkozott jelentősebb különbség, itt ugyanis a CaLB T2-150 enzimmel elért konverzió értékek a CaLB N435-höz képest fele-harmad akkorák voltak. Az összes többi enzim esetében a konverzió még 24 óra után is 1-2% alatt maradt. Az elvégzett enzim nélküli vaktesztek alapján ezeknek a konverzióknak egy része az ilyen körülmények között végbemenő kémiai N-acilezésnek köszönhető.

Az (1-metil-3-fenilpropil)-amin (2c) N-acilezése során a heptán-2-aminhoz (2a) hasonló tendenciát figyelhettünk meg. A BUTE 3 (T-2) enzimmel valamivel magasabb konverziót és enantiomer tisztaságot értünk el, mint az előző esetben. A BUTE 3 (F-4) enzim, ezzel szemben jelentősen jobban működött, mint az előző szubsztrátum esetében, hiszen itt 24 óra után is 98% feletti ee értéket mértünk majdnem 30%-os konverzió mellett. A két, különbözőféleképpen rögzített CaLB kicsit gyengébb, 96-98% körüli ee értékeket produkált.

A CaLB T2-150 enzim alkalmazásakor 8 óra után volt a legmagasabb az enantiomer tisztaság (98,7%), de még 24 óra után is 96% feletti ee-t mértünk. A reakció sebessége azonban itt is elmaradt a CaLB N435 enzimnél mérttől, nagyjából annak 2/3-a volt. A többi enzimnél jellemzően 1-5% konverziót tapasztaltunk, enantiomer tisztaságuk egyetlen esetben sem haladta meg az 50%-ot.

Az (1-feniletil)-amin (2g) esetében az előzőekhez képest változást jelentett, hogy a BUTE 3 (T-2) és (F-4) valamint az SSF9 és SSF23 enzimek egyikével sem tapasztaltunk 1-2%-os konverziónál magasabb értéket. Az előző két szubsztrátum molekulával (2a, 2c) jól működő CaLB T2-150 enzimmel (2a esetében 20% körüli, 2c esetében pedig 40% körüli konverzió 24 óra után) egy sokkal lassabb reakciót figyelhettünk meg, továbbá az enantiomer tisztaság sem érte el a 88,5%-ot. A CaLB N435 enzim tekintetében ugyan megmaradt a magas szelektivitás,

Eredmények és értékelésük 33 viszont a kívánt N-acetamid (3g) itt is lassabban keletkezett. Az eddig gyakorlatilag semmilyen aktivitást nem mutató CaLA T2-150 enzimmel fordított enantiomer szelektivitást tapasztaltunk. Ugyan a reakció alacsony konverzióval (4% 24 óra után) és nem túl magas ee értékkel megy (44% az (S)-acetamidra (S)-3g vonatoztatva), de a reakció további optimálásával ezek az értékek növelhetőek lennének, ám ezen optimálási folyamat ennek a dolgozatnak nem része.

Az 1,2,3,4-tetrahidronaftalin-1-amin (2e) tulajdonképpen az (1-feniletil)-amin (2g) merev vázas formája, hiszen az (1-feniletil)-amin (2g) esetében a csatlakozó oldallánc kötésében a rotáció megengedett, míg az 1,2,3,4-tetrahidronaftalin-1-amin (2e) esetében ez gátolt. Ezért érdemes az N-acilezési eredményeket az (1-feniletil)-aminhoz (2g) hasonlítani.

A várakozásoknak megfelelően csak a két, különbözőféleképpen rögzített CaLB mutatott aktivitást, a többi enzimmel végzett kísérlet egyikében sem mértünk 5%-nál magasabb konverziót. A CaLA T2-150 fordított szelektivitását sem tapasztaltuk. A CaLB T2-150 enzimmel végzett N-acilezésnél, a (1-feniletil)-aminhoz (2g) képest, hasonlóan alacsony konverziót tapasztaltunk (8 óra után 3,3%, 24 óra után 9,1%), magasabb ee értékek mellett (8 óra után 94,3%, 24 óra után 92,2%). A CaLB N435 enzimmel végzett kísérletek során viszont sikerült az (1-feniletil)-aminnál (2g) elért konverziót meghaladni (8 óra után 16,4%, 24 óra után 32,1%), úgy, hogy az enantiomer tisztaság sem lett alacsonyabb (8 óra után 96,4%, 24 óra után 95,0%). A szakaszos üzemű eredményeket az 5. táblázat tartalmazza.

Eredmények és értékelésük 34

5. táblázat Racém aminok (rac-2a, c, e, g) etil-acetáttal történő enzimkatalizált kinetikus rezolválása szakaszos üzemben

Amin Enzim t

[h]

c [%]^a

ee_(R)-3 [%]^a

E [-]^b

r_flow [µmol/(min×g)]

rac-2a CaLB N435 8 25,4 98,0 ›100 4,6

rac-2a CaLB T2-150 8 11,5 97,9 ›100 2,1

rac-2c CaLB N435 8 39,8 97,4 ›100 5,6

rac-2c CaLB T2-150 8 28,9 98,7 ›200 4,1

rac-2c BUTE 3 (F-4) 8 18,7 97,7 ›100 2,6

rac-2e CaLB N435 8 16,4 96,4 66 2,3

rac-2e CaLB T2-150 8 3,3 94,3 35 0,5

rac-2g CaLB N435 8 12,0 95,5 49 2,1

rac-2g CaLB T2-150 8 3,2 85,3 13 0,6

rac-2a CaLB N435 24 37,0 96,0 86 2,2

rac-2a CaLB T2-150 24 19,7 97,1 85 1,2

rac-2a SSF9 24 4,2 86,9 14 0,3

rac-2a BUTE 3 (T-2) 24 1,3 75,7 7 0,1

rac-2c CaLB N435 24 52,7 96,4 - 2,5

rac-2c CaLB T2-150 24 43,5 96,8 ›100 2,0

rac-2c BUTE 3 (F-4) 24 28,0 98,4 ›100 1,3

rac-2c BUTE 3 (T-2) 24 6,5 88,0 17 0,3

rac-2e CaLB N435 24 32,1 95,0 61 1,5

rac-2e CaLB T2-150 24 9,1 92,2 27 0,4

rac-2g CaLB N435 24 25,5 94,2 46 1,5

rac-2g CaLB T2-150 24 8,1 88,3 17 0,5

rac-2g CaLA T2-150 24 4,4 44,4^c 3 0,3

a A konverziót (c) és a termék enantiomer tisztaságát (ee(R)-3) királis állófázisú gázkromatográfon határoztuk meg. ^b Az enantiomer szelektivitást a konverzió és a termék enantiomer tisztasága (ee_(R)-3) alapján számoltuk.²¹ A 100-200 tartományba eső értékeket ›100, a 200-500 tartományba eső értékeket ›200 és az ›500 értékeket »200 értékekként tüntettük fel. ^c (S)-3g-re vonatkoztatva az ee érték.

A biokatalizátorokkal megvalósított reakciók többségénél a biokatalizátor környezete hatással van magára a reakcióra, a termékek képződésére és időbeli lefutására. A vizsgált racém aminok (rac-2a, c, e, g) enzimkatalizált N-acilezése során először optimális oldószert, majd acilezőszert igyekeztünk találni, melyekkel a produktivitás és/vagy az enantiomer tisztaság növelhető. Az enzimek vizsgálata során toluolt használtunk, mivel a kutatócsoportunkban végzett korábbi kísérletek alapján ebben a közegben az alkalmazott lipázok megfelelően működnek. Azonban ezeket a szubsztrátum molekulákat (rac-2a, c, e, g) átfogóan még nem tesztelte a kutatócsoportunk, ezért elengedhetetlen volt több különböző oldószer tesztelése. Az enzimaktivitás befolyásolása tekintetében toluol mellett a következő

Eredmények és értékelésük 35 oldószerek reakcióra gyakorolt hatását vizsgáltuk: trifluortoluol, terc-butil-metil-éter, diizopropiléter, etil-acetát, hexán, tetrahidrofurán (THF) és hexán-THF 2/1 arányú elegye.

Az acilezőszer minőségét illetően sem történtek még részletes vizsgálatok – habár ennek is jelentős hatása lehet a biokatalizátorra –, ezért az előzőekben használt etil-acetát mellett az izopropenil-acetátot és az etilénglikol-diacetátot is teszteltük.

A kísérletekhez, összhangban az enzimek tesztelése során elért eredményekkel, biokatalizátorként a CaLB N435, a CaLB T2-150, a BUTE 3 (T-2) és a BUTE 3 (F-4) enzimkészítményeket használtuk. A reakciók kivitelezéséhez az enzimek tesztelésénél már alkalmazott módszerrel dolgoztunk: 30°C-on termosztált rázatott lombikban a megfelelő oldószerben feloldottuk a racém amint (rac-2a, c, e, g), majd hozzáadtuk a megfelelő acilezőszert. A reakcióelegyekből 1, 2, 4, 8 és 24 óra elteltével vettünk mintákat, melyeket gázkromatográfiásan analizáltuk. Az eredmények kiértékelése után az alábbi következtetésekre jutottunk

Bármelyik szubsztrátum-enzim-acilezőszer rendszerre igaz, hogy az oldószer minősége jelentősen befolyásolja a konverziót. Erre egy szemléletes példa, hogy míg az (1-metil-3- fenilpropil)-amint (rac-2c) a BUTE 3 (F-4) enzim jelenlétében etil-acetátban acilezve 60%

körüli konverziót érhetünk el 24 óra alatt, addig trifluortoluolban ez az arány csak 30% körül van, hexánban pedig a 20%-ot sem éri el. Az is jól látható, hogy egy adott szubsztrátummal jól működő rendszer nem feltétlenül produkál hasonlóan jó eredményeket egy másik szubsztrátummal: az (1-metil-3-fenilpropil)-amin (2c) BUTE 3 (F-4) enzimmel hexán-THF 2/1 arányú elegyében 24 óra után is 98,5% feletti enantiomer tisztasággal, majdnem 40%

konverzió mellett adta a megfelelő N-acetamidot (R)-3c, viszont ugyanezen körülmények között a heptán-2-amin (rac-2a) 60%-nál is magasabb konverzió mellett a várt (R)-N- acetamidhoz (R)-3a képest az ellenkező konfigurációjú N-acetamidban (S)-3a) dúsabb terméket adta.

A különböző acilezőszerek között is óriási eltérést figyeltünk meg. Az izopropenil-acetáttal végrehajtott acilezési reakciók bizonyos esetekben akár több nagyságrenddel is gyorsabbak voltak, mint az etil-acetáttal vagy az etilénglikol-diacetáttal elvégzett reakciók. Több esetben ugyanis már egy óra után is jelentős mennyiségű N-acetamidot találtunk, közepes vagy moderált enantiomer tisztasággal, 24 óra után pedig sok esetben teljesen végbe is ment a reakció, tehát elreagált az összes (S)- és (R)-amin is, termékként pedig a racém N-acetamidot kaptuk. Mivel célunk az enantiomertiszta (R)-N-acetamidok előállítása volt, ezért az izopropenil-acetáttal végzett reakciók eredményeinek részletesebb elemzésével a továbbiakban nem foglalkozom. Az etilénglikol-diacetáttal végrehajtott reakciókkal is

Eredmények és értékelésük 36

rövidebb idő alatt értünk el adott konverziót, mint az etil-acetáttal végzett reakciók esetében, azonban az ee értékek sokszor még a 70%-ot sem érték el. A három általunk vizsgált acilezőszer közül egyértelműen az etil-acetát bizonyult a legmegfelelőbbnek ezekben a rendszerekben.

A különböző oldószerekkel végrehajtott kísérletek eredményei alapján általánosan elmondható, hogy az enantiomertiszta N-acetamidok keletkezésének a toluol mellett az éter típusú oldószerek is kedveznek. A terc-butil-metil-éterben és a diizopropiléterben elvégzett reakciók mindegyike 95%-nál magasabb ee értéket mutatott 8 óra után, de még 24 óra után sem adódott 90%-nál alacsonyabbnak.

A trifluortoluol az (1-metil-3-fenilpropil)-amin (rac-2c) esetében működött kimagaslóan.

Itt a BUTE 3 (T-2) enzim kivételével mindegyik enzimmel magas, a toluollal és a terc-butil- metil-éterrel összemérhető konverzióval és 98% feletti enantiomer tisztasággal kaptuk a kívánt (R)-N-acetamidot (R)-3c. Viszont egy háromszorosan halogénezett oldószerről van szó, viszonylag magas az ára és vízi élővilágra is ártalmas, használata inkább kerülendő.

Az oldószer, az acilezőszer és az enzim minőségén túl nagy hatással van a produktivitásra és a szelektivitásra is az acilezőszer és a szubsztrátum reakcióelegybeli koncentrációja is.

Ismert, hogy – a Michaelis-Menten kinetikának megfelelően – ha nő az acilezőszer rendszerbeli koncentrációja, akkor ezzel nő a produktivitás, illetve ha nő a szubsztrátum koncentrációja, akkor csökken a produktivitás.¹⁴¹ Ennek megfelelően további kísérleteket végeztünk az acilezőszer és a szubsztrátum optimális koncentrációjára vonatkozóan, melynek eredményeképpen arra jutottunk, hogy az acilezőszer mennyiségét a kétszeresére emeljük, és a szubsztrátum koncentrációt pedig a felére csökkentjük. Így a továbbiakban kísérleteink során 10 mg/ml szubsztrátum koncentráció mellett 100 µl/ml acilezőszert alkalmaztunk.

3.2.3. A különböző CaLB enzimekkel végzett szakaszos és folyamatos üzemű kinetikus rezolválások produktivitásának és szelektivitásának összehasonlítása

A két, különbözőféleképpen rögzített CaLB enzimmel (CaLB N435 és CaLB T2-150) az előzőekben optimált körülmények között szakaszos és folyamatos üzemben is elvégeztük a négy racém amin (rac-2a, c, e, g) kinetikus rezolválását, hogy összehasonlíthassuk a kétféle működési mód közötti különbségeket. A méréseket 30°C-on, és szakaszos üzemben a folytonos üzemben mért konverzió eléréséig végeztük, hogy a produktivitás értékek összehasonlíthatóak legyenek (6. táblázat, 30. ábra).⁹¹

Eredmények és értékelésük 37

6. táblázat Racém aminok (rac-2a, c, e, g) kinetikus rezolválása etil-acetáttal, különböző módon rögzített CaLB enzimek jelenlétében, 30°C-on szakaszos és folyamatos üzemben

Sorszám Amin Enzim c [%]^a/t [h] ee_(R)-3 [%]^a E [-]^b r_batch [µmol/min×g]

A blokk^c

1 rac-2a CaLB N435 10,8/2 97,5 88 7,9

2 rac-2c CaLB N435 25,3/1 99,0 ›200 14,1

3 rac-2e CaLB N435 9,5/2 99,5 ›200 2,7

4 rac-2g CaLB N435 20,7/2 99,4 ›200 7,1

5 rac-2a CaLB T2-150 7,6/7 97,2 76 1,5

6 rac-2c CaLB T2-150 12,5/4 99,3 ›200 1,7

7 rac-2e CaLB T2-150 2,1/6 94,8 38 0,2

8 rac-2g CaLB T2-150 8,1/6 98,5 ›100 0,9

Sorszám Amin Enzim c [%]^a ee_(R)-3 [%]^a E [-]^b r_flow [µmol/min×g]

B blokk^d

9 rac-2a CaLB N435 11,0 97,9 ›100 8,1

10 rac-2c CaLB N435 28,7 99,1 ›200 14,3

11 rac-2e CaLB N435 8,4 99,6 ›200 4,3

12 rac-2g CaLB N435 18,4 ›99,9 »200 11,3

13 rac-2a CaLB T2-150 7,2 97,1 72 5,3

14 rac-2c CaLB T2-150 13,5 99,5 ›200 7,2

15 rac-2e CaLB T2-150 2,2 99,4 ›200 1,1

16 rac-2g CaLB T2-150 7,4 ›99,9 »200 4,8

a A konverziót (c) és a termék enantiomer tisztaságát (ee(R)-3) királis állófázisú gázkromatográfon határoztuk meg. ^b Az enantiomer szelektivitást a konverzió és a termék enantiomer tisztasága (ee_(R)-3) alapján számoltuk.²¹ A 100-200 tartományba eső értékeket ›100, a 200-500 tartományba eső értékeket ›200 és az 500 feletti értékeket

»200 értékekként tüntettük fel. ^c Szakaszos üzemű reakciók. ^d Folyamatos üzemű reakciók.

Az összehasonlító tesztek rávilágítottak, hogy függetlenül a szubsztrátum természetétől vagy az enzimrögzítési módtól a folyamatos üzemben mért produktivitás minden esetben magasabb volt a szakaszos üzemben tapasztaltnál. Ezek az eredmények összhangban vannak kutatócsoportunk korábbi eredményeivel, ahol szekunder alkoholok kinetikus rezolválását valósították meg folytonos, átfolyásos rendszerekben.91,92,142,143

Az egy adott enzimmel folytonos, átfolyásos üzemben elért magasabb produktivitás értékek az ilyen rendszerekre jellemző sokkal kisebb holttérfogattal magyarázható. Míg folyamatos üzemben az enzimmel töltött oszlopban 30-35% holttérfogat tapasztalható, addig a szakaszos üzemű rázatott lombikban ez az érték 90% felett van.^91,144 A produktivitás növekedés (rflow/rbatch) sokkal inkább függött az enzim rögzítési módjától, mint magától a szubsztrátumtól (1,1–1,6-szoros a CaLB N435 esetében, és 3,5–5,5-szörös a CaLB T2-150 esetében). Az a tény, hogy a

Eredmények és értékelésük 38

enantiomer szelektivitás (E) folytonos, átfolyásos rendszerben változatlan vagy valamivel magasabb lett, mint szakaszos üzemben, ugyancsak összhangban van korábbi, szekunder alkoholokkal elért eredményeinkkel.91,92,142,143

30. ábra Racém aminok (rac-2a, c, e, g) enzimkatalizált kinetikus rezolválása folytonos, átfolyásos rendszerben

3.2.4. A produktivitás és a szelektivitás hőmérsékletfüggése racém aminok (rac-2a, c, e, g)