Szekunder alkoholok (rac-5a-c) enzimkatalizált kinetikus rezolválása

A kiindulási indolszármazékokat (rac-5a-c) a ciklohexén-oxid gyűrűnyitási reakciójával állítottuk elő NaH jelenlétében dimetilformamid (DMF) oldószerben (37. ábra). Az epoxidok gyűrűnyitása indolszármazékokkal lúgos vagy semleges pH tartományban SN2 mechanizmusú, mely transz-1,2-diszubsztituált terméket eredményez.¹⁵⁹ Esetünkben transz vegyületek racém keveréke keletkezett kiváló termeléssel (92–98%).

Eredmények és értékelésük 45

37. ábra Szekunder alkoholok előállítása a ciklohexén-oxid gyűrűnyitási reakciójával

A három szekunder alkoholt ezután szakaszos üzemű kinetikus rezolválásnak vetettük alá.

Összesen 23 különböző lipázt vizsgáltunk a vinil-acetáttal végrehajtott O-acilezési reakciókban. Oldószerként hexán:terc-butil-metil-éter 2:1 arányú elegyét használtuk, a reakciók 30°C-on termosztált rázógépben mentek (38. ábra, 8. táblázat). A vizsgált enzimek között volt liofilizált por, felületmódosított szilika-gélre, akrilgyöngyökre vagy ioncserélő gyantára adszorbeált, illetve akrilgyöngyökhöz kovalensen rögzített enzim is.

38. ábra Szekunder alkoholok (rac-5a-c) enzimkatalizált kinetikus rezolválása szakaszos üzemben

Az indolból képzett szekunder alkohol (rac-5a) kinetikus rezolválása során kiváló enantiomer szelektivitást tapasztaltunk a biokatalizátorok nagy részénél (8. táblázat, A blokk).

Az enantiomer tisztaságok sok esetben ›99,9%-nak adódtak úgy, hogy eközben a konverzió is legalább 37% volt. A CaLB N435 és a Lipobond PS enzimekkel végzett kinetikus rezolválások során pedig majdnem el is érte az 50%-ot. Habár a CaLA és a CaLB enzimeknél kutatócsoportunk jelentős különbségeket talált a szelektivitást és az aktivitást illetően a különböző hidrofobicitású felületmódosított szilika-gélekre történő enzimrögzítések esetében,¹⁶⁰ az MpL használatakor mégsem mutatkozott jelentős különbség a fenil- és az oktil-módosított szilika-gélekre rögzített enzimek használatakor (8. táblázat, 8. és 9. sor).

Eredmények és értékelésük 46

8. táblázat Szekunder alkoholok (rac-5a-c) enzimkatalizált kinetikus rezolválása vinil-acetáttal szakaszos üzemben, 30°C-on

Sorszám Alkohol Enzim Hordozó^a c [%]^b ee(R,R)-6 [%]^b E [-]^c rbatch [µmol/g×h]

A blokk^d

1 rac-5a CaLB N435 Ac 49,9 ›99,9 »200 32,6

2 rac-5a Lipobond PS Ac/PS 47,2 ›99,9 »200 30,8

3 rac-5a Lipozyme TLIM ICs 40,2 ›99,9 »200 26,2

4 rac-5a Lipozyme MmL ICs 38,7 ›99,9 »200 25,3

5 rac-5a Amano AK - 37,0 ›99,9 »200 24,1

6 rac-5a CaLA Dv250P PhSi 25,1 99,8 »200 16,4

7 rac-5a CaLA T2-150 Ac 14,7 99,6 »200 9,6

8 rac-5a MpL Dv250P PhSi 13,9 99,9 »200 9,0

9 rac-5a MpL Dv250O OcSi 11,1 99,9 »200 7,2

10 rac-5a CaLB Dv250P PhSi 9,4 99,9 »200 6,2

11 rac-5a PaL Dv250P PhSi 8,6 99,8 »200 5,6

B blokk^e

12 rac-5b CaLB N435 Ac 41,2 ›99,9 »200 37,6

13 rac-5b Lipobond PS Ac/PS 27,7 ›99,9 »200 25,0

14 rac-5b Lipozyme TLIM ICs 27,4 ›99,9 »200 25,0

15 rac-5b Lipozyme MmL ICs 24,1 ›99,9 »200 21,7

16 rac-5b CaLB Dv250P PhSi 12,9 99,9 »200 11,9

17 rac-5b Amano AK - 9,0 99,9 »200 8,1

18 rac-5b Amano M - 6,5 99,9 »200 5,9

19 rac-5b Amano PS - 5,5 99,8 »200 5,0

C blokk^e

20 rac-5c Lipozyme TLIM ICs 44,9 ›99,9 »200 38,6

21 rac-5c CaLB N435 Ac 38,7 ›99,9 »200 33,0

22 rac-5c Lipozyme MmL ICs 34,4 ›99,9 »200 29,1

23 rac-5c Lipobond PS Ac/PS 33,5 ›99,9 »200 28,5

24 rac-5c Amano AK - 27,0 99,9 »200 22,8

25 rac-5c CaLB Dv250P PhSi 13,7 99,9 »200 11,7

26 rac-5c CaLA Dv250P PhSi 10,6 99,9 »200 9,0

27 rac-5c CrL - 7,3 99,9 »200 6,2

28 rac-5c Amano PS - 7,2 99,8 »200 6,1

29 rac-5c CaLA T2-150 Ac 6,9 99,8 »200 5,9

a Az immobilizáláshoz használt hordozók: Ac: akrilgyöngy, Ac/PS: akril/polisztirolgyöngy, ICs: ioncserélő gyanta, OcSi: oktil-csoporttal módosított szilika-gél, PhSi: fenil-csoporttal módosított szilika-gél, -: liofilizált por. ^b A konverziót (c) és a termék enantiomer tisztaságát (ee(R,R)-6) királis állófázisú gázkromatográfon határoztuk meg. ^c Az enantiomer szelektivitást a konverzió és a termék enantiomer tisztasága (ee_(R,R)-6) alapján számoltuk.²¹ Az 500 feletti értékeket »200 értékekként tüntettük fel. ^d Reakcióidő: 72 h. ^e Reakcióidő: 48 h.

Néhány lipáz esetében azonban, melyek különbözőféleképpen voltak rögzítve, figyelemreméltó különbségeket tapasztaltunk. A CaLA enzim fenil-módosított szilika-gélre adszorbeálva majdnem kétszer akkora produktivitást és valamivel magasabb szelektivitást

Eredmények és értékelésük 47 mutatott, mint ugyanennek az enzimnek az akrilgyöngyökhöz kovalensen rögzített változata (8. táblázat, 6. és 7. sor). A CaLB enzim akrilgyöngyökre adszorbeálva több mint 5-ször olyan nagy produktivitást mutatott magasabb enantiomer tisztaság mellett, mint a fenil-módosított szilika-gélre adszorbeált CaLB (8. táblázat, 1. és 10. sor). A CaLA enzimek magas enantiomer szelektivitás értékei (E: »200) szintén figyelemreméltóak, hiszen egyéb szekunder alkoholok kinetikus rezolválásakor nem voltak kimondottan szelektívek.135,160,161

Érdemes megjegyezni, hogy a Burkholderia cepaciából nyert lipáz nem mutatott semmilyen aktivitást sem liofilizált porként (Amano PS), sem pedig oktil-módosított szilika-gélhez adszorbeálva (az adatok nem szerepelnek a 8. táblázatban), ugyanakkor kiváló enantiomer tisztasággal (›99.9%) és konverzióval (47,2%) ment a reakció, amikor akril/polisztirol gyöngyökhöz kovalensen volt rögzítve (8. táblázat, 2. sor).

A 3-metilindollal nyitott ciklohexén-oxid (rac-5b) kinetikus rezolválása hasonló eredményt mutatott, mint a rac-5a (8. táblázat, B blokk). A legjobb szelektivitást és aktivitást ugyanazzal a négy enzimmel értük el (CaLB N435, Lipobond PS, Lipozyme TLIM, Lipozyme MmL), mint korábban. Valamivel ugyan alacsonyabb aktivitás volt tapasztalható, de az enantiomer szelektivitás így is kiváló maradt (E: »200, 8. táblázat, 12–15. sor). Az Amano AK ebben az esetben sokkal kevésbé bizonyult aktívnak, mint a rac-5a kinetikus rezolválása során (c: 37,0% és 9,0%, 8. táblázat, 5. és 17. sor), de a magas szelektivitás továbbra is megmaradt (E: »200 és ee: 99,9%). Az előző szubsztrátummal ellentétben sem a CaLA sem az MpL enzim semmilyen formája nem mutatott semmilyen értékelhető aktivitást a rac-5b kinetikus rezolválásakor. Ezzel szemben az Amano M és az Amano PS, ha nem is nagy produktivitással, de magas enantiomer tisztasággal katalizálta a reakciót (8. táblázat, 18.

és 19. sor). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az indolgyűrűn hármas helyzetben lévő szubsztituens ugyan az enzimek enantiomer felismerését nem befolyásolja, de az enzimhez való kötődését, és így az enzim aktivitását csökkenti.

Az 5-metoxiindollal végzett gyűrűnyitási reakcióban kapott szekunder alkohol (rac-5c) kinetikus rezolválásakor ismét kiváló szelektivitás értékeket tapasztaltunk (8. táblázat, C blokk). Az a tény, hogy a Lipozyme TLIM jelentősen aktívabb volt, mint a CaLB N453 azt mutatja, hogy a rac-5c az indolgyűrűn lévő 5-MeO-szubsztitens miatt egészen más sztérikus környezetet igényel az aktív helyen, mint amilyen az előző két szekunder alkoholnak (rac-2a, b) szükséges volt (8. táblázat, 20. és 21. sor). A CrL esetében is hasonlót tapasztaltunk (8.

táblázat, 27. sor). Alacsonyabb produktivitással, de kiváló szelektivitással ment végbe a reakció, miközben az előző két szubsztrátummal semmilyen említésre méltó aktivitást nem mutatott. Ugyan nem a CaLB enzimekkel értük el a legmagasabb produktivitást, de mindkét

Eredmények és értékelésük 48

rögzítési móddal (adszorpció akrilgyöngyökre, illetve fenil-módosított szilika-gélre) kiváló enantiomer tisztaságot és enantiomer szelektivitást értünk el (8. táblázat, 21. és 25. sor).

Valamivel alacsonyabb produktivitás mellett kiváló enantiomer tisztaságot tapasztaltunk a Lipozyme MmL, a Lipobond PS és az Amano AK enzimekkel végzett kinetikus rezolválások során is (8. táblázat, 22–24. sor).

3.3.3. Szekunder alkoholok (rac-5a-c) enzimkatalizált kinetikus rezolválása folytonos,