Е.В. Абакумов, В.И. Поляков, А.О. Зверев, А.К. Кимеклис, Е.А. Евдокимова, Е.А. Иванова, Г.В Гладков
Санкт-Петербургский государственный университет, г. Санкт-Петербург, e_abakumov@mail.ru
Исследован микробиом почв восточной Антарктиды в районе станции Прогресс.
Почвенный покров здесь представлен как ненарушенными естественными почвами и почвоподобными телами, так и антропогенно-преобразованным покровом. Состав микробиомов естественных и антропогенных почв имеют значимые различия в альфа и бэта разнообразии. По полученным данным первичные почвы на каменных мостовых отличаются высоким разнообразием, в составе микробиома преобладают представи- тели Proteobacteria. В орнитогенных почвах, формирующихся в районах птичьих база- ров, отмечен средний уровень разнообразия и преобладание Cyanobacteria в составе.
В антропогенно-нарушенных почвах отмечено крайне низкое разнообразие и домини- рование Bacteroidetes.
Ключевые слова: метагеном, Антарктида, многолетнемерзлые породы, первич- ное почвообразование.
Изучение процесса почвообразования является актуальной задачей как с точки зрения эволюции почв, так и в плане разработки методов возобновления почвенных ресурсов (рекультивации). Педогенез является комплексным процес- сом взаимодействия абиотических и биотических факторов, при этом вклад по- следних является более существенным и зависит от функционирования почвен- ного микробиома. Микробиом является мощнейшим средообразующим факто-
ром в почвенных экосистемах как в количественном (количество бактерий в поч- ве может достигать 109–1010 клеток на грамм), так и в качественном отношении (микроорганизмам принадлежит ключевая роль в обеспечении циклов основных биогенных элементов, процессах деструкции органического вещества, а также формировании почвенного органического вещества). Новые возможности для исследования процесса почвообразования открывает использование метагеном- ных подходов, позволяющих анализировать разнообразие в том числе и некуль- тивируемых форм микроорганизмов, которые, согласно последним научным данным, доминируют в составе природных сообществ микроорганизмов. Однако использование метагеномных подходов сопряжено с рядом методологических и смысловых проблем, главной из которых является корректная обработка и био- логическая интерпретация больших массивов метагеномных данных. Эта про- блема усугубляется при анализе почвенных микробиомов, поскольку почва сама по себе является комплексной, крайне гетерогенной системой, испытывающей воздействие множества трудно-учитываемых факторов. Поэтому принципиально при анализе почвы как биологического объекта использовать простые модельные системы, в которых можно максимально дискретно выявить последовательные стадии почвообразования и связанные с ними изменения в составе микробиома.
Выделение ДНК из почв, исследуемых на данном этапе, проводили с исполь- зованием набора реактивов «PowerSoil DNA Isolation kit» (MoBio, США). Очищен- ные препараты ДНК были использованы для создания ампликонных библиотек, со- гласно инструкции к протоколу секвенирования, поставляемой фирмой ILLUMINA.
Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК использовали универсальные прайме- ры к его вариабельному участку V4:F515 (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) и R806 (GGACTACVSGGGTATCTAAT) [1]. Секвенирование и первичную обработку дан- ных осуществляли на приборе ILLUMINA MiSeq.
Обработку секвенированных последовательностей гена 16S рРНК произ- водили с использованием пакетов ПО «Trimmomatic» и «QIIME-2» [2]. Было произведено удаление из библиотек всех служебных последовательностей, осу- ществлена сборка парноконцевых прочтений, проведена проверка качества нук- леотидных последовательностей. Из библиотек исключали все небактериальные и химерные последовательности, производили нормализацию данных. В резуль- тате всех проведенных процедур отобрали 14 312 последовательностей. После проведения процедуры нормализации данных число последовательностей в каж- дой библиотеке составило 4700. Последовательности с долей сходства, превы- шающей 97%, объединяли в филотипы, или операционные таксономические еди- ницы – operational taxonomic units (OTU) с использованием алгоритма closed ref- erence и базы данных «Silva». Из каждой OTU выбирали одну последователь- ность для составления набора репрезентативов. На следующем этапе проводили классификацию репрезентативных последовательностей с использованием про- граммы RDP naïve Bayesian rRNA Classifier и выравнивание по алгоритму PyNast [2]. Выровненные последовательности использовали для построения матрицы дистанций и филогенетического древа.
Для оценки биоразнообразия и проведения сравнительного анализа сооб- ществ рассчитывали параметры α- и β-разнообразия. α-разнообразие оценивали с
использованием индексов видового богатства (число OTU в образце, индекс Cha- oI, показатель филогенетического разнообразия Фейта) и индекса Шеннона. До- стоверность различий по индексам α-разнообразия среди микробиомов оценива- ли с использованием t-теста. Для оценки β-разнообразия использовали метод
«Weighted unifrac», позволяющий оценить процент сходств/различий между все- ми парами сравниваемых микробиомов. Для представления результатов анализа использовали методы многомерной статистики (анализ главных координат) в программе Emperor.
Для оценки достоверности различий в представленности отдельных таксо- нов в анализируемых образцах, в дополнение к ПО «QIIME-2» был использован скрипт с на языке программирования «Python», динамически выбирающий в ка- честве критерия G-тест либо точный критерий Фишера.
Был проведен сравнительный анализ структуры и разнообразия прокари- отного сообщества антропогенно загрязненных и контрольных почв в районе станции «Прогресс» (рис. 1) с целью выявления влияния антропогенного фактора на формирование почвенной микробиоты в районах с экстремальными климати- ческими условиями в условиях и хозяйственного использования (на предыдущем этапе данный анализ проводили с использованием методов классической микро- биологии в сочетании с анализом разнообразия комплекса почвенных грибов мо- лекулярно-биологическими методами).
Рис. 1. Область исследования. Станция «Прогресс»
Характеристика образцов представлена в таблице.
По данным анализа бета-разнообразия, образцы 1 и 2, отобранные с по- верхности каменной мостовой, объединяются в один кластер (рис. 2). Тем не ме- нее, по данным альфа-разнообразия, сообщества образца 2 отличаются очень вы- соким разнообразием (рис. 3, 4). Вероятно, это связано с антропогенными нару- шениями естественного бактериального сообщества. Отмечены существенные
отличия в таксономическом составе данных образцов. В образце 2 преобладают представители Proteobacteria, в то время как в образце 1 присутствуют бактерии пор. Gemmatimonadales, и несколько увеличивается количество представителей филы Verrucomicrobia.
Описание образцов почв в районе российской антарктической станции Прогресс
Индекс Описание точки отбора образца
Antarctica.1 Холмы Ларсеманн, окрестности станции Прогресс, материал на по- верхности – каменная мостовая
Antarctica.2 Окрестности станции Прогресс-1, каменная мостовая на поверхности Antarctica.3 Мохово-лишайниково-водорослевый слой; влажный; переход замет-
ный по изменению окраски
Antarctica.4 Водорослевый поверхностный горизонт Холмы Ларсеманн, влажная долина, орнитогенная почва
Antarctica.5 Антропогенно-нарушенная почва
Antarctica.6 Холмы Ларсеманн, поверхностный горизонт под каменной мостовой, грубый материал
Antarctica.7 Холмы Ларсеманн. Охристо-железистый; влажный; песчаный, вклю- чение каменистого материала
Antarctica.8 Холмы Ларсеманн, срединный оглеенный горизонт, признаки ожелез- нения
Рис. 2. Бета-разнообразие (взвешенный Unifrac)
Образец 3 занимает обособленное положение по данным бета- разнообразия и обладает средним среди рассмотренных образцов уровнем альфа- разнообразия. Интересно отметить высокую долю Chloroflexi и Verrucomicrobia в сообществе.
Рис. 3. Индекс Шеннона
Образец 4 отличается очень высокой (33%) долей представителей Cyano- bacteria. Также для этого образца характерны представители Proteobacteria и Bac- teroidetes – их доля составляет 22 и 21% соответственно. Индексы альфа- разнообразия, тем не менее, свидетельствуют о сравнительно среднем уровне разнообразия.
Образец 5 обладает крайне низкими значениями альфа-разнообразия. Так- сономически большая часть сообщества представлено Proteobacteria (31%), Bac- teroidetes (34%), а также Cyanobacteria (16%), отсутствуют представители Acido- bacteria.
Рис. 4. Количество операционных таксономических единиц (OTU)
Образцы 6, 7 и 8 оказываются схожи по таксономическому составу. Боль- шая часть прочтений относятся к представителям фил Cyanobacteria, Bacteroide-
tes, Proteobacteria и Acidobacteria, причем последняя характерна, главным обра- зом, для образца 6. Цианобактерии занимают существенную долю в составе всех сообществ, доходя до 61% в образце 8. Именно это, по-видимому, снижает зна- чения индексов альфа-разнообразия для образца 8. По данным бета- разнообразия, образцы не формируют одного кластера, хотя и находятся в одной части оси при проведении PCoA. Таксономически и по данным бета- разнообразия, они сходны с образцом 4.
Микробиом исследованных почв можно условно разделить на три группы, относящиеся к различным почвам, имеющим различный уровень разнообразия.
Естественные ненарушенные почвы, формирующиеся на каменных мостовых, отличаются наибольшим уровнем разнообразия с доминированием в составе Pro- teobacteria. В орнитогенных почвах на местах гнездования птиц формируется сообщество со средним уровнем разнообразия и преобладанием Cyanobacteria, в то время как в антропогенно-нарушенных почвах формируется микробиом с низ- ким уровнем разнообразия и преобладанием рода Bacteroidetes. Увеличение доли антропогенно-нарушенных земель может привести к сокращению разнообразия фил в микробиоме и увеличить долю Bacteroidetes в его составе.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 19-54- 18003, 19-05-50107, 18-04-00900.
Литература
1. Bates S.T., Berg-Lyons D., Caporaso J.G., Walters W.A., Knight R., Fierer N. Examining the global distribution of dominant archaeal populations in soil // ISME J. 2010. № 5. Р. 908–917.
2. Caporaso J.G. QIIME 2: Reproducible, interactive, scalable, and extensible microbiome data science // PeerJ Preprints. 2018. № 6. Р. e27295v2.
Microbiome of primary soils of Antarctica on example of Progress station E.V. Abakumov, V.I. Polyakov, A.O. Zverev, A.K. Kimeklis,
E.A. Evdokimova, E.A. Ivanova, G.V. Gladkov
The soil microbiome was studied in eastern Antarctica on the Progress station.
The soil cover is represented by natural soils and soil-like bodies, as well as anthro- pogenic soil. The composition of the microbiomes of natural and anthropogenic soils have significant differences in alpha and beta diversity. According to the ob- tained data, primary soils on stone pavements are highly diverse; representatives of Proteobacteria predominate in the microbiome. In the ornithogenic soils forming in the areas of bird nests, an average level of diversity and prevalence of Cyanobacte- ria in the composition was noted. In anthropogenic soils, extremely low diversity and dominance of Bacteroidetes is noted.
УДК 631,4+528,9