Лабораторні методи дослідження

Із метою дослідження лабораторних показників РР нами здійснювався забір РР в дітей шляхом спльовування в стерильний контейнер або за допомогою стерильної піпетки в пробірку, натщесерце, без стимуляції. Варто відмітити, що фізичні та біохімічні параметри РР вивчено у 120 дітей, а з метою оцінки ефективності впровадженого профілактичного комплексу, біохімічні показники досліджено в 105 дітей.

Отже, нами було визначено:

-водневий показник (рН) визначали за допомогою стрічки індикаторного паперу рН 0-12 (виробництво «Lachema», Чехія). З цією метою індикаторний папір занурювали в зібрану РР в стерильному контейнері або її наносили на смужку з допомогою піпетки після попереднього полоскання РП дистильованою водою. За 2 хвилини визначали рН РР, орієнтуючись на зміну кольору універсального індикаторного паперу;

-в’язкість РР визначали за допомогою віскозиметра Освальда. В’язкість РР оцінювали у відносних одиницях за формулою

, де

Vв - об’єм води, що витікає з мікропіпетки, об’ємом 1мл за 5сек Vс - об’єм РР, що витікає з мікропіпетки, об’ємом 1мл за 5сек ВС - в’язкість РР в відносних одиницях (відн. од.)

Вв - в’язкість води в відносних одиницях (відн. од.);

-рівень неорганічного фосфору в РР визначали з використанням «Набору для визначення неорганічного фосфору (УФ-детекція фосфомолібденового

комплексу)» фірми «СІМКО». До 0,1 мл дослідної проби (РР) додавали 3,0 мл молібденового реактиву. Суміш перемішували. Витримували 20 хв при кімнатній температурі та колориметрували при довжині хвилі 340 нм на спектрофотометрі проти контролю в 1 см кюветі. Аналогічно обробляли і стандартний розчин фосфору. Контроль: до 0,1 мл дистильованої води додавали 3,0 мл реагенту. Зафарбування повинно бути стабільним не менше 60 хв. Вміст неорганічного фосфору розраховували за формулою:

Неорганічний фосфор ммоль/л = , де

Е дослід. і Е стандарт. – поглинання, відповідно, дослідної проби та стандартного взірця з концентрацією 50 ммоль/л [18].

-рівень загального кальцію в РР проводили з використанням «Набору для

визначення кальцію» фірми «SIMKO Ltd». До 4 мл робочого реагенту для визначення кальцію додавали 0,05 мл дослідної проби (РР). Суміш перемішували. Одночасно проводили таку саму калібрувальну пробу (4 мл робочого реагенту + 0,05 мл калібрувального розчину). Витримували 5 – 10 хв при кімнатній температурі та колориметрували при довжині хвилі (590 – 650) нм на спектрофотометрі проти контролю в 1 см кюветі. Контроль: до 4 мл реагенту додавали 0,05 мл дистильованої води. Вміст кальцію розраховували за формулою:

Кальцій (ммоль/л) = , де

Е дослід. і Е стандарт. – поглинання, відповідно з дослідною пробою і стандартним взірцем із концентрацією 2,5 ммоль/л [199, 235].

-рівень магнію в РР визначали за методом Кункеля – Пирсона –

Шгейгерта [99] із використанням «Набору для визначення магнію» фірми

«HUMAN» та виражали в ммоль/л;

-активність лужної фосфатази в РР проводили уніфікованим методом із використанням «НАБОРУ ЛУЖНА ФОСФАТАЗА-02-ВІТАЛ Кат. № В 09.02»

фірми «Вітал Діагностікс Спб». До 2,1 мл субстратно-буферного розчину додавали 0,07 мл РР (дослідна проба №1), у другу пробірку – (0,6 + 0,02) мл РР (дослідна проба №2), у третю пробірку – 2,1 мл субстратно-буферного розчину (проба №1), у четверту пробірку – 0,6 мл субстратно-буферного розчину (проба №2). Інкубували 10 хв при кімнатній температурі. У пробірки №1 і №3 додавали по 2,1 мл окисного розчину, у пробірку №2 і №4 – по 0,6 мл. У пробірки №3 і №4 додавали відповідно 0,07 і 0,02 мл досліджуваної РР.

Витримували 5 хв при кімнатній температурі. Потім вимірювали оптичну щільність дослідної проби проти проби №1 та №2 при довжині хвилі (490 – 650) нм на спектрофотометрі, в 1 см кюветі.

Розрахунок активності лужної фосфатази проводився за калібрувальним графіком (рис. 2.2):

Рис. 2.2 Калібрувальний графік лужної фосфатази

Активність ЛФ визначали за методикою Bessey [185] за формулою:

А = Е  101, де

А – активність ЛФ нмоль/хв в 1 мл РР, Е – оптична щільність, 101 – коефіцієнт перерахунку в мколь/мл.

-активність кислої фосфатази в РР проводили уніфікованим методом за «кінцевою точкою» з використанням «НАБОРУ КИСЛА

ФОСФАТАЗА-01-ВІТАЛ Кат. № В 10.01» фірми «Вітал Діагностікс Спб». У дві пробірки наливали 0,8 мл субстратно-буферного розчину та інкубували 5 хв на водяній бані при 37°С. У першу пробірку додавали 0,1 мл досліджуваної РР, перемішували та інкубували 30 хв на водяній бані при температурі 37°С. В обидві пробірки додавали розчин окисника – по 0,2 мл, у контрольну пробірку – 0,1 мл досліджуваної РР. Потім перемішували і за 5 хв визначали поглинання проби контролю при довжині хвилі 510 нм на спектрофотометрі в 1 см кюветі.

Розрахунок активності лужної фосфатази проведено за калібрувальним графіком (рис. 2.3).

Рис. 2.3 Калібрувальний графік кислої фосфатази.

Активність КФ визначали за формулою:

^A  ^C ^a

30 , де

А – активність КФ, нмоль/хв на 1 мл, С – концентрація паранітрофенола, 30 – час інкубації в хвилинах, а – кількість білка в мг проби, що відповідає 0,4 мл ЯР [185].

Для вивчення імунологічних властивостей РР нами було відібрано групу з 83 дітей, а для оцінки ефективності профілактичних заходів – групу з 41 дитини.

Досліджено рівень секреторного імуноглобуліну класу А (sIgA) та лізоциму в РР. Визначення концентрації секреторного імуноглобуліну класу А в

РР проводили методом радіальної імунодифузії в агаровому гелі за методом Манчіні [216], з використанням сухої моноспецифічної сироватки проти імуноглобуліну А людини виробництва «НДІ епідеміології та мікробіології ім.

І.М. Мечнікова» (Росія). Концентрацію sIgA виражали в г/л. Вміст лізоциму в РР визначали з застосуванням набору реагентів фірми «Вектор-Бест» (Росія) із використанням мікропроцесорного фотометра «BioChem SA» фірми «High Technology Inc.» (США) [47, 192, 197]. Вміст лізоциму виражали у мкг/мл.

Усі біохімічні дослідження РР здійснювали в клініко-діагностичній лабораторії Івано-Франківської центральної міської клінічної лікарні №1 (завідувач лабораторією Марків Г.Д.).

Концентрацію Lactobacillі fermentum (КУО/мл) у РР визначали методом занурених предметних скелець, покритих селективним середовищем Сабуро («Sabouraud Dextrose Agar», «MICROMETER», Індія). Отримані результати оцінювались по фотографії-шаблону (рис. 2.4).

Рис. 2.4 Фотографія-шаблон.

Дослідження щодо концентрації Lactobacillі fermentum у РР проводили у 83 дітей. Мікробіологічні дослідження РР проводили в бактеріологічній

лабораторії Івано-Франківської центральної міської клінічної лікарні №1 (завідувач лабораторією Ярич Л.Б.).

Мінералізувальні властивості РР оцінювали за показниками мікрокристалізації (МКС) та мінералізувального потенціалу (МПС) за методикою П.А. Леуса [77]. Забір РР проводили стерильною піпеткою з дна ротової порожнини мінімум за 2 години після прийому їжі та її полоскання дистильованою водою. На оброблене етиловим спиртом та висушене при кімнатній температурі предметне скло наносили три краплі РР. Далі після висихання краплі її досліджували під мікроскопом «Біолам Ломо Р14» при збільшені 2х6 у відбитому світлі. Мінералізувальний потенціал РР визначали середнім балом, у залежності від виявлених типів МКС (табл. 2.1), з урахуванням вивчення усієї площі крапель на предметному склі.

Таблиця 2.1 Оцінка мікрокристалізації ротової рідини

Тип МКС

Картина мікрокристалізації

Картина у мікроскопі

Оцінка МКС у балах

Автори, що вперше описали

1 2 3 4 5

І

Чіткий рисунок великих кристалопризматичних

структур, що з’єднані між собою та мають папоротеподібну форму.

Розміщені по краплі рівномірно

5 П.А. Леус

ІІ

Окремі деревоподібні кристали невеликих розмірів. По периферії краплі велика кількість кристалопризматичних структур неправильної

форми

3

Л.А. Дубровина, включає елементи

І та ІІ типу

Продовження таблиці 2.1

1 2 3 4 5

ІІ

Поодинокі кристали різної форми, розміщені

у вигляді сітки рівномірно по усій площині або можливе

їхнє групування по периферії краплі. Велика

кількість органічної речовини

2 П.А. Леус

ІІІ

Велика кількість ізометрично розміщених

структур неправильної форми

1 Л.А. Дубровина

ІІІ Повна відсутність

кристалів 0

Е.Н. Дичко, Е.В. Шпилевська

Мінералізувальний потенціал РР, що виражений у балах, визначали за формулою :

МПС = , ^де

МПС – мінералізувальний потенціал РР

ΣМКС – сума типів мікрокристалізації ротової рідин

Рівень мінералізувального потенціалу РР оцінювали за наступної шкалою:

- 0,1 – 1 (Дуже низький рівень);

- 1,1 – 2 (Низький рівень);

- 2,1 – 3 (Задовільний рівень);

- 3,1 – 4 (Високий рівень);

- 4,1 – 5 (Дуже високий рівень).

Визначення рівня мінералізувального потенціалу РР проводили у 120 дітей. Дослідження морфологічних показників РР проводили в лабораторії університетської клініки ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет» (завідувач лабораторією Яцишин Н.М.).

2.4. Варіаційно-статистичні методи опрацювання результатів