O último isolado de B cenocepacia a ser recolhido afeta mais a viabilidade

De acordo com MacDonald e Speert (2008) as DCs expostas a B. cenocepacia permanecem viáveis, na sua grande maioria, durante as primeiras 6 horas. Contudo, a viabilidade é perdida entre as 12 e as 24 horas 73. Assim, para comparar a perda de viabilidade das DCs induzida por cada um dos isolados, foram realizadas incubações de DCs com os isolados de B. cenocepacia e E. coli (viáveis) durante 12 horas.

Alguns patogénios melhoram a sua capacidade de persistir no hospedeiro ao induzirem a morte celular das células hospedeiras. Esta morte celular pode ocorrer através de mecanismos complexos distintos, podendo ter consequências significativas em termos da resposta subsequente para a célula morta, modulando ou influenciando a resposta imune. A morte celular ocorre tipicamente por apoptose (ou morte celular programada, que é um processo ativo de autodestruição da célula, evitando induzir a inflamação) ou necrose (morte acidental das células, resultante de perturbações do meio ambiente, com libertação descontrolada do conteúdo celular inflamatório) 121.

Estudos realizados por MacDonald e Speert em DCs verificaram, após um período de incubação com B. cenocepacia de 24 horas, a ocorrência de necrose. A incubação foi efetuada com bactérias viáveis, e ao fim das 24 horas as bactérias foram encontradas associadas a células vivas e mortas. A incubação com bactérias mortas, sobrenadante do meio de crescimento das bactérias ou a espécie B. multivorans não provocou necrose 73. Já havia sido comprovada necrose em neutrófilos, causada por B. cenocepacia viável e independente da ativação de radicais de oxigénio para a sua destruição 122.

No entanto, os nossos resultados mostraram que ao fim de 12 horas na presença dos isolados de B. cenocepacia, ocorria morte celular essencialmente por apoptose, encontrando-se as DCs infetadas maioritariamente na fase tardia da apoptose. Os nossos resultados também mostraram diferenças significativas entre os isolados, nomeadamente que o isolado IV se distingue dos restantes por provocar maior perda de viabilidade nas DCs (Fig. 3.9).

A indução de morte celular por apoptose já havia sido descrito para B. cenocepacia em macrófagos 123 e células epiteliais, sendo que neste último caso, o fator de virulência bacteriano responsável por essa morte celular seria o pilus de B. cenocepacia 124. Segundo MacDonald e Speert, parece que o mecanismo causador de morte celular não

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passará por proteínas excretadas, visto que as incubações com apenas o sobrenadante do meio de crescimento das bactérias não resultaram em morte, levantando a hipótese de que talvez os fatores usados para causar a morte (por exemplo, enzimas proteolíticas) sejam produzidos no microambiente do fagossoma e injetados no citoplasma das células hospedeiras 73. No entanto, recentemente, também foi observado em B. cenocepacia um novo sistema de secreção que é necessário, pelo menos em parte para induzir morte celular em macrófagos infetados 13.

Apesar da apoptose ser um processo que pode ocorrer espontaneamente nas DCs infetadas com bactérias após a sua completa maturação e apresentação dos antigénios às células T, este processo todo demoraria mais do que as 12 horas de incubação (ao fim das quais as células foram recolhidas para análise). Assim, parece que a apoptose observada nestes ensaios se deve de facto a fatores bacterianos de B. cenocepacia (especialmente do isolado IV, o último a ser recolhido do doente J), que poderão ser semelhantes aos anteriormente descritos.

A indução de apoptose poderá ser uma das formas de B. cenocepacia escapar ao sistema imunológico, já que DCs apoptóticas não são efetivas a promover a resposta adaptativa, e por outro lado, uma forma de se propagar e persistir no organismo hospedeiro.

4.4. Apesar dos isolados de B. cenocepacia inibirem a maturação das DCs, conseguem induzir alguma ativação dos linfócitos T

Por fim, foi avaliada a consequência imunológica, em termos de ativação de células T, da interação das DCs com os vários isolados de B. cenocepacia. Para tal, as DCs foram incubadas durante 6 horas com os isolados de B. cenocepacia ou E. coli (novamente usada como controlo) e colocadas posteriormente em co-cultura com células T autólogas durante 3 dias, após os quais se procedeu à análise genética da expressão de duas moléculas produzidas pelos linfócitos T, nomeadamente dos genes que codificam para o IFN-γ e o FOXP3.

O tipo de resposta gerada pelas células T depende de vários fatores, tais como o estado de maturação das DCs e o tipo de citocinas produzidas pelas DCs no microambiente local 125.

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A estimulação de células T pelas DCs, pode desencadear diferentes tipos de resposta, nomeadamente respostas do tipo T helper (Th1/Th2 e Th17), T citotóxicas ou T

reguladoras, resultando na ativação de diferentes componentes da imunidade celular e humoral 126. Deste modo, respostas do tipo Th1 são induzidas pela produção de citocinas

IL-12 e levando à produção de grandes quantidades de IFN-γ por parte das células Th1 e

T citotóxicas, enquanto respostas do tipo Th2 se devem à expressão de citocinas como

IL-4, IL-5 e IL-13, contudo estas células Th2 não expressam IFN-γ. Já respostas do tipo

Th17, são induzidas pela expressão de citocinas IL-17 51, 127. Por outro lado, as células

Treg ativas expressam FOXP3 e inibem a expressão de IL-12 produzidas pelas DCs, e estão relacionadas com a secreção de IL-10 e TGF-β, favorecendo uma resposta adaptativa mais do tipo humoral. As Treg são então capazes de suprimir as respostas Th1, explicando assim a imunossupressão que é induzida 52.

No caso do IFN-γ verificou-se, neste trabalho, que a sua expressão na co-cultura de células T e DCs previamente incubadas com as várias bactérias é muito superior à sua expressão na amostra calibradora (DCs incubadas na ausência de bactérias), sendo que esta diferença é estatisticamente significativa em todos os casos (Fig. 3.11 (a)). Especificamente, a expressão deste gene foi maior nas células T estimuladas com as DCs incubadas com os isolados III e IV.

Tendo em conta os resultados anteriores, nomeadamente os referentes à maturação das DCs, este resultado foi um pouco surpreendente. De facto, tendo verificado que os isolados de B. cenocepacia, especialmente o isolado IV, inibiam, pelo menos em parte, a maturação das DCs, como se viu pela baixa expressão das moléculas HLA-DR, CD80 e CD86, previa-se que estas DCs incubadas com os isolados (principalmente com o IV) fossem pouco eficazes a estimular as células T efetoras, logo a induzir a expressão de IFN-γ.

Também os resultados dos ensaios de avaliação da morte celular sugeriam que o isolado IV, por causar uma apoptose mais acentuada nas DCs, não permitisse a ativação das células T.

Relativamente ao FOXP3, verificou-se que a sua expressão na co-cultura de células T e DCs previamente incubadas com as várias bactérias foi igualmente superior à sua expressão na amostra calibradora, ainda que numa escala muito inferior à expressão de IFN-γ. As diferenças encontradas foram estatisticamente significativas no ensaio com o

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isolado III e com E. coli (Fig. 3.11 (b)). Na linha do raciocínio anterior, seria de esperar que neste caso, a maior população de células T a expressar o fator de transcrição FOXP3 (Treg) estivesse presente na co-cultura em que as células T foram incubadas com as DCs infetadas com o isolado IV, as quais tinham apresentado menor expressão de HLA-DR e moléculas co-estimulatórias. Portanto, os resultados aqui obtidos também não foram de encontro ao esperado. No entanto há que ter em conta que o tipo de resposta imunológica das células T depende também do tipo e do nível de citocinas expressas pelas DCs quando incubadas com determinado tipo de bactérias. Curiosamente, resultados anteriormente obtidos sobre a expressão de citocinas pelas DCs quando incubadas com os isolados de B. cenocepacia mostraram que as DCs incubadas com os isolados II e IV apresentavam uma elevada expressão de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-12 (Fig. 2 do anexo III) e que as DCs incubadas com os isolados II e III expressam mais citocinas anti-inflamatórias tais como IL-10 e TGF-β (Fig. 1 do anexo III) (Lopes A, Tese de mestrado).

Pode-se então pensar que o maior ou menor aumento da expressão genética das moléculas IFN-γ e/ou FOXP3 na população de células T, quando em co-cultura com as DCs infetadas com as diferentes bactérias resultará não só do efeito destas bactérias sobre a expressão dos marcadores de maturação nas DCs, mas também da quantidade de citocinas de cada tipo que induzem. Para além disso, também deverá ser contabilizado o efeito que as diferentes bactérias têm na viabilidade das células que as internalizaram.

Assim o isolado IV induz maior expressão de IFN-γ, apesar de inibir a expressão de HLA-DR e das moléculas co-estimulatórias, como resultado do balanço entre este efeito, a sua elevada capacidade para induzir as citocinas pró-inflamatórias já referidas e ainda no seu elevado potencial para induzir apoptose.

Já a estirpe de E. coli não patogénica (usada neste trabalho como controlo), apesar de induzir o aumento da expressão de HLA-DR e das moléculas co-estimulatórias e de afetar apenas ligeiramente a viabilidade celular, originou uma elevada expressão de FOXP3 na população linfocitária e menor expressão de IFN-γ, comparativamente aos isolados de B. cenocepacia, provavelmente porque, para além de citocinas pró- inflamatórias também promove nas DCs infetadas uma elevada expressão da citocina anti-inflamatória IL-10 77.

Apesar de alguns mecanismos de escape imunológico de bactérias do Bcc terem já sido reportados, tem também sido descrito que a imunidade adaptativa não é completamente comprometida nos doentes com FQ infetados com estas bactérias. Pelo

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menos, tem-se verificado que estes doentes produzem anticorpos específicos contra bactérias do Bcc 128, o que sugere alguma apresentação antigénica e desenvolvimento de respostas do tipo Th2. Contudo, a presença de anticorpos não parece ter um papel muito

preponderante na defesa do hospedeiro contra as bactérias do Bcc, como esperado no caso de um grupo de microrganismos que parece adotar um estilo de vida intracelular, sendo que uma resposta do tipo Th1 robusta é essencial para combater este tipo de

patogénios 129.

Os nossos resultados permitem concluir que a deficiente maturação das DCs e a indução da apoptose promovida pelos isolados de B. cenocepacia testados, especialmente pelo isolado IV, não serão o suficiente para impedir que as DCs infetadas com esta bactéria ativem uma resposta efetora do tipo Th1, com produção significativa

de IFN-γ e baixa expressão do fator de transcrição FOXP3, com funções imunorreguladoras.

No entanto, não é de descartar a ideia de que a modulação das funções das DCs pelos isolados de B. cenocepacia não seja um importante contributo para restringir esta resposta. A inclusão neste estudo de outros controlos, como o LPS (que promoveu um considerável aumento na expressão dos marcadores de maturação das DCs), poderiam ajudar a esclarecer melhor até que ponto o nível de expressão genética de IFN-γ obtido nas várias situações é suficiente para definir uma resposta adaptativa Th1 eficaz.

Há ainda que considerar que a resposta imunológica adaptativa foi aqui avaliada apenas com base no nível de expressão genética de IFN-γ e FOXP3, mas que há outros métodos de determinar esta resposta que deverão ser empregues para confirmar/complementar estes resultados, nomeadamente a determinação da expressão destas moléculas, mas ao nível da proteína e a avaliação da proliferação linfocitária (ver a secção das perspectivas futuras).

69 PERSPECTIVASFUTURAS

Vários estudos têm sido realizados para tentar perceber a infeção e a resposta imunitária ao Complexo B. cepacia, mas pouco ainda se sabe. A maioria dos estudos envolve macrófagos, neutrófilos e as células epiteliais dos pulmões.

Os ensaios realizados no decorrer desta tese permitiram tirar algumas conclusões elucidativas sobre a modulação das funções das DCs pelos isolados de B. cenocepacia, para que num futuro próximo, possam ser realizados outros estudos mais complexos, de modo a comprovar as hipóteses que foram levantadas ao longo desta dissertação, e que carecem ainda, em alguns casos, de estudos adicionais para comprová-las.

Em primeiro lugar, uma das prioridades para a continuação deste trabalho é completar a investigação das consequências imunológicas, em termos de resposta de células T, da interação das DCs com cada variante clonal, analisando o nível de expressão de CD69 (um marcador precoce de ativação de células T) através da citometria de fluxo, determinando a expressão de IFN-γ e FOXP3, mas ao nível da proteína, também por citometria de fluxo, e/ou no caso do IFN-γ por ELISA, usando os sobrenadantes da co-cultura. Para além disso, também seria interessante avaliar a proliferação linfocitária através de um ensaio com o corante fluorescente CFSE que se vai diluindo nas células à medida que ocorre proliferação celular, podendo-se determinar o número de gerações dos linfócitos por citometria de fluxo.

Outro parâmetro que carece de investigação é o destino de cada variante clonal dentro das DCs, nomeadamente a sua capacidade de sobreviver e replicar-se intracelularmente, no sentido de perceber como estas bactérias contornam a degradação lisossomal, evitam o processamento dos antigénios e a apresentação por DCs às células T. Estes ensaios poderão ser avaliados por microscopia confocal e/ou citometria de fluxo.

É também de realçar que o proteoma destes isolados encontra-se em estudo pelo grupo da Professora Isabel Sá-Correia do Instituto Superior Técnico e, portanto algumas das hipóteses levantadas sobre fatores de virulência que os isolados viáveis possuem e que lhes permitem modular a função das DCs podem vir a ser identificados.

Assim, prevê-se que os resultados dos parâmetros anteriormente mencionados, tal como os obtidos por este trabalho, contribuam para elucidar a capacidade dos isolados de B. cenocepacia se adaptarem e persistirem no ambiente do hospedeiro.

71 CONCLUSÃO

Tem sido sugerido que parte do sucesso da adaptação do Complexo Burkholderia

cepacia, e nomeadamente de B. cenocepacia, ao ambiente pulmonar dos doentes com

FQ e a infeção dos mesmos, passe pela evolução nos mecanismos de escape imunológico desta bactéria mas tanto quanto sabemos, o nosso grupo é o primeiro a dedicar-se às questões imunológicas com isolados clonais desta bactéria de um mesmo indivíduo.

A célula dendrítica adquire aqui, especial importância, pois o seu papel no âmbito da infeção por B. cenocepacia está ainda pouco estudado. Os resultados obtidos ao longo deste trabalho permitem concluir que os isolados viáveis interagem melhor com as DCs e têm capacidade para modular as suas funções, em especial os isolados considerados mais virulentos (isolado II e IV). De facto, estes isolados são mais internalizados, não induzem a maturação das DCs, e originam maior morte celular por apoptose (essencialmente o IV). Contrariamente ao esperado, os nossos resultados mostraram ainda que a deficiente maturação das DCs e a indução da apoptose promovida pelos isolados de B. cenocepacia testados, especialmente pelo isolado IV, não são o suficiente para impedir que as DCs infetadas com esta bactéria ativem uma resposta efetora do tipo Th1 (com produção significativa de IFN-γ e baixa expressão do

fator de transcrição FOXP3 com funções imunorreguladoras). No entanto, só com estes dados não podemos descartar a ideia de que a modulação das funções das DCs pelos isolados de B. cenocepacia não seja um importante contributo para restringir a resposta efetora das células T, pois, sem este mecanismo a resposta anti-bacteriana específica poderia ser ainda muito mais robusta.

Em suma, no seu conjunto os mecanismos de evasão imunitária mencionados ao longo desta tese, poderão contribuir para uma melhor instalação da infeção por B.

cenocepacia e para a sua persistência no organismo do indivíduo suscetível. Embora

mais estudos sejam necessários para compreender especificamente a relevância da interação das DCs com a B. cenocepacia, o trabalho desenvolvido no âmbito desta dissertação contribui certamente para reforçar a ideia de que esta bactéria é capaz de alterar a função normal das DCs, provavelmente com o objetivo de evitar uma resposta imunológica adaptativa eficiente, capaz de a eliminar do organismo hospedeiro e/ou aproveitar as propriedades migratórias das DCs para se disseminar e causar uma infeção sistémica (síndrome da cepacia).

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