Os isolados clonais de B cenocepacia mais virulentos são mais

A maioria dos estudos sobre o escape imunológico de bactérias do Bcc envolve macrófagos e neutrófilos, e as bactérias utilizadas estão normalmente viáveis. Contudo, nesta dissertação foi realizado o estudo da interação de B. cenocepacia, viável ou inativada por calor, com DCs. Esta interação das DCs com as bactérias foi avaliada após 6 horas de incubação.

Em todos os ensaios, praticamente todas as DCs da população internalizaram bactérias, embora a quantidade de bactérias internalizadas tenha sido distinta (diferentes intensidades de fluorescência), dependendo dos isolados e das suas características.

A estirpe não patogénica de E. coli, foi internalizada consideravelmente, principalmente quando viável, tendo sido usada como controlo do ensaio, pois já tinha sido demonstrado pelo grupo a sua elevada capacidade para interagir com as DCs 77.

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No caso dos isolados B. cenocepacia viáveis, os isolados II e IV foram os mais internalizados e o isolado I o menos internalizado (Fig. 3.1). Curiosamente, os isolados mais internalizados, são também considerados os mais virulentos para o hospedeiro (com base nos perfis de resistência a antibióticos, características fenotípicas, análise proteómica quantitativa e ensaios de virulência, utilizando um modelo nematóide e células epiteliais brônquicas), sendo que esta comparação foi especialmente efetuada relativamente ao isolado I 5, 32.

Estudos recentes do grupo do IST, sobre a proteómica quantitativa destes isolados revelaram que as alterações no teor de diferentes proteínas são uma das principais modificações da expressão genómica dos isolados II e IV, quando comparado com o isolado I, no entanto, a análise comparativa das sequências de todo o genoma para estes 4 isolados, ainda contínua em estudo 32-34. Curiosamente, também se verificou que os isolados II e IV têm maior capacidade de invadir células epiteliais [Madeira et al., submetido], fator corroborado também por Mullen e colaboradores para bactérias do Bcc, uma vez que, a invasão em células epiteliais do pulmão está correlacionada com a virulência 27, 105.

De uma maneira geral, a associação dos isolados de B. cenocepacia inativados com as DCs foi menor (valores de MFI a 37º foram mais baixos comparando com os originados pelos isolados viáveis), o que pode ser explicado pela forma de interação das bactérias com o hospedeiro, pois as bactérias viáveis interagem de forma mais dinâmica com o hospedeiro (tanto na superfície da célula como no fagossoma), podendo ativamente modular os processos da DC 73. Por outro lado, também tem sido descrito que a associação entre as bactérias e os fagócitos é feita através da interação com componentes termolábeis da parede celular bacteriana, cuja organização pode ser modificada pelo calor 106, 107, o que pode justificar esta diferença.

Especificamente a internalização, foi menos distinta entre cada tipo bactérias (intensidades de fluorescência mais semelhantes) e, em particular, o isolado III foi mais internalizado quando comparado com os restantes (I, II e IV) (Fig. 3.2). Nesta situação, com as bactérias inativadas, espera-se que a internalização se deva apenas à capacidade fagocítica das DCs e não à capacidade invasiva das bactérias. Assim, não é de estranhar que o isolado III (baixa virulência, características semelhantes ao isolado I) tenha sido melhor internalizado quando os isolados foram tornados inviáveis, pois o nível de internalização tornou-se independente da virulência do isolado.

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De facto, as bactérias gram-negativas patogénicas desenvolvem sistemas de secreção para exportar fatores de virulência através das membranas bacterianas para as células hospedeiras, que incluem moléculas que medeiam captação bacteriana (invasão), processadores de efeitos que reprogramam o transporte vesicular para melhorar o parasitismo intracelular, moléculas de recetores para que as bactérias adiram, e outros fatores que alteram as funções imunológicas para melhorar a evasão à resposta imune

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, que provavelmente são inativados quando a bactéria é sujeita ao tratamento por calor.

Embora B. cenocepacia possa, tal como P. aeruginosa (mais bem estudada) desenvolver mecanismos para evitar a fagocitose, como por exemplo, a superprodução de exopolissacárido, que lhe confere um fenótipo mucóide e a perda de mobilidade do flagelo levando a uma perda da ativação imune por parte de alguns TLRs 109 ou a modificação de determinados PAMPs como estratégia para sequestrar genes envolvidos na resposta imune inata 110, parece que ao nível da interação com as DCs, quanto mais virulento o isolado mais internalizado (desde que viável). De facto, o grande desafio destas bactérias pode não ser evitar a internalização pelas DCs, mas sim, uma vez internalizadas, conseguir contornar a via endocítica, escapando ao processamento no fagossoma, eventualmente replicando-se no citoplasma e ainda evitando que os seus antigénios sejam apresentados às células T.

O mecanismo de escape à acidificação do fagossoma de B. cenocepacia é bem conhecido nos macrófagos 29. De facto, após a fagocitose de uma bactéria, normalmente forma-se um vacúolo (fagossoma) maduro, altamente acídico (pH ~4,5-5) e degradativo, mas foi demonstrado que o vacúolo que contém a B. cenocepacia internalizada é bastante mais alcalino, e a aquisição de marcadores característicos do fagossoma maduro, tais como as proteínas associadas à membrana do lisossoma 1 e 2 (LAMP-1 e LAMP-2) ou a proteína RAb7 pertencente à família das GTPases, é retardada ou inexistente 29, 111.

Ao serem internalizadas, mas não destruídas, as bactérias podem ficar protegidas da terapia antimicrobiana e continuar a colonizar os pulmões dos doentes, levando inevitavelmente a uma maior e persistente inflamação dos tecidos com posterior destruição dos mesmos 11, 13, 112.

O facto de as DCs migrarem dos locais da infeção para os órgãos linfáticos secundários para apresentar antigénios poderia ser uma vantagem adicional destas

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bactérias serem internalizadas e sobreviverem nas DCs pois assim estas células serviriam de vetores sistémicos 113, ajudando à disseminação e persistência da B.

cenocepacia.

Apesar de algumas conclusões sugeridas por estes dados, estudos mais aprofundados têm de ser realizados para avaliar a aquisição (do isolado I de B.

cenocepacia, para o II e para o IV) de maior capacidade para escapar à acidificação

lisossomal, sobreviver e replicar-se dentro das DCs (ver perspectivas futuras), evitando que os seus antigénios sejam apresentados às células T.

4.2. Os isolados clonais de B. cenocepacia inibem a expressão de alguns