2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. A Espectrometria de Massa Aplicada à Microbiologia Clínica
2.1.2. A Espectrometria de Massa na Identificação de Micro-organismos
Há exatamente cinco anos, foi publicado o primeiro estudo que avaliou a acurácia da espectrometria de massa pela técnica de MALDI-TOF MS com a finalidade de identificação de isolados bacterianos, aeróbios e anaeróbios, provenientes de amostras clínicas (Seng et al., 2009). Neste estudo, dos 1.660 isolados bacterianos, 95,4% foram identificados corretamente pelo MALDI-TOF MS e demonstraram que a acurácia na identificação bacteriana pela
espectrometria de massa se correlacionou diretamente ao número de espectros de massas daquela espécie incluído no banco de dados.
Diversos estudos se seguiram, demonstrando a utilidade desta metodologia na prática diária dos laboratórios de microbiologia. Entretanto, algumas espécies são muito relacionadas entre si e apresentam um pequeno número de picos que podem ser utilizados para distinguí-las,
como Streptococcus pneumoniae do grupo Streptococcus mitis. Neste caso, o sistema VITEK
MS (IVD) demonstrou superioridade, pois pelo sistema Biotyper apesar dos isolados de S.
pneumoniae serem identificados corretamente, os isolados de S. mitis/oralis podem ser
erroneamente identificados como S. pneumoniae (Martiny et al., 2012). Entretanto, alguns
micro-organismos são extremamente relacionados e nenhum dos algoritmos propostos, até o
momento, é capaz de diferenciá-los, como E. coli e Shigella spp. (Patel, 2014). Porém, ambos os
sistemas apresentam uma nota referente a esta limitação quando estas bactérias são identificadas.
O procedimento para a identificação requer apenas que se transfira a colônia bacteriana, após crescimento em placa de ágar, para o spot da placa de MALDI-TOF MS com a ajuda de um palito ou alça bacteriológica. Adiciona-se 1 µL da matriz, para a identificação bacteriana, utiliza-se, preferencialmente, o ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA) dissolvido em 50% de acetonitrila e 2,5% de ácido trifluoroacético. Em seguida o material é deixado à temperatura ambiente até que o material fique completamente seco. A placa deve ser inserida no equipamento para análise. Com o objetivo de se melhorar a qualidade do espectro obtido, a extração de proteínas pode ser realizada através de um procedimento utilizando-se ácido fórmico e acetonitrila, ou apenas com a adição de 1 µL de ácido fórmico a 70% sobre a colônia do micro-organismo na placa de MALDI-TOF MS, auxiliando a ruptura celular. Entretanto, na rotina laboratorial, este procedimento torna-se trabalhoso. Recomenda-se, então, que para facilitar o fluxo de trabalho, a análise inicial de bactérias e leveduras seja realizada diretamente
da colônia do micro-organismo, com ou sem adição do ácido fórmico e, para aquelas nas quais o resultado obtido não for satisfatório, a extração proteica poderá ser realizada (Patel, 2014).
2.1.2.1. Identificação de Bactérias Aeróbicas
O sistema de MALDI-TOF MS apresenta um excelente desempenho para a identificação
de bactérias aeróbicas (Figura 2). Utilizando o sistema da Bruker, Patel (2013) observou 93% e
82% de identificações corretas em gênero e espécie, respectivamente, quando avaliou 440 isolados bacterianos de bacilos Gram-negativos usuais e não-usuais. Estas taxas foram superiores àquelas observadas para os métodos de identificação convencionais (Patel, 2013). No mesmo estudo, Patel avaliou 217 isolados de cocos Gram positivos encontrando 98% de identificação correta para o gênero e 79% para espécie. As maiores dificuldades relatadas estão
na diferenciação de espécies de Streptococcus, especialmente S. pneumoniae, grupo S. mitis e
grupo S. viridans, como dito anteriormente(Martiny et al., 2012; McElvania Tekippe et al., 2013). Lau e colaboradores (2014) obtiveram 75% de identificação correta em gênero para 67
micro-organismos de difícil identificação, como Granulicatella adiacens, Micrococcus luteus,
Nocardia spp., Pantoea dispersa, Actinomyces spp., entre outros (Lau et al., 2014). Alatoom e colaboradores (2012) mostraram que os bacilos Gram positivos também poderiam ser identifcados por esta metodologia, já que observaram 85% de concordância em gênero ao avaliarem 190 isolados (Alatoom et al., 2012). Entretanto, a identificação de bacilos Gram positivos, geralmente, apresenta taxas de concordância inferiores àquelas apresentadas para cocos Gram positivos e bacilos Gram-negativos. Bizzini e colaboradores (2010) observaram uma concordância de 88,6% para os 1 371 micro-organismos testados, sendo que quando estratificados mostrou 92,2% de resultados corretos para bacilos Gram-negativos, 99,2% para
Figura 2. Espectro de massa gerado pelo MALDI-TOF MS para as diferentes espécies bacterianas. Adapatado de Liu e colaboradores (2007).
Os estudos que avaliaram o sistema VITEK MS obtiveram resultados semelhantes, incluindo bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e fastidiosas (91-97% de identificação em gênero e 78% a 96% em espécie). No estudo de Richter e colaboradores (2013), este sistema identificou corretamente 97% e 84% das enterobactérias testadas em gênero e espécie,
respectivamente (Richter et al., 2013). Martiny e colaboradores (2012) avaliaram o desempenho
dos dois sistemas e respectivos bancos de dados. Estes apresentaram resultados bastante similares (93%) para a identificação de bactérias usualmente encontradas na rotina laboratorial,
exceto quando o banco de dados Saramis foi utilizado (83,8%) (Martiny et al., 2012). Em nossa
espécies, quando 119 isolados bacterianos comumente encontrados no laboratório de microbiologia foram avaliados, diretamente da colônica bacteriana. Dentre estes a concordância em gênero e espécie foi de 97% e 86% para os 59 cocos Gram positivos, e de 100% e 98%, respectivamente, para 60 bacilos Gram-negativos (dados não publicados).
2.1.2.2. Identificação de Bactérias Anaeróbicas
A espectrometria de massa tornou-se o método de escolha para a identificação de bactérias anaeróbicas. Barreau e colaboradores (2013) avaliaram uma coleção de 1 325 bactérias anaeróbicas e alcançaram 100% e 93% de correta identificação direto da colônia em
gênero e espécie, respectivamente, utilizando o sistema Biotyper (v. 3.0) (Barreau et al., 2013).
Jamal e colaboradores (2013b) reportaram 89% e 100% de identificação entre 274 bactérias
anaeróbicas usando os sistemas Biotyper e VITEK MS, respectivamente (Jamal et al., 2013b).
2.1.2.3. Identificação de Micobactérias
A identificação de micobactéria é um grande desafio para o laboratório de microbiologia, e apesar de algumas limitações, o MALDI-TOF MS é uma técnica mais rápida, de menor custo, e mais fácil que as técnicas atualmente empregadas (testes bioquímicos e moleculares). As espécies de micobactérias exigem, além da inativação prévia, um procedimento de extração mais elaborado. A inativação pode ser realizada com o calor ou com exposição ao etanol, seguida de um processo de ruptura mecânica, com auxílio de pérolas de vidro, e extração proteica com ácido fórmico e acetonitrila, uma vez que sua parede é constituida por uma camada
de ácidos graxos que impede sua ruptura apenas com a incidência do laser (Balada-Llasat et al.,
2013; Dunne et al., 2014). Em seu estudo, Balada-Llasat e colaboradores (2013) testaram 178
isolados de micobactérias, cultivados em meios sólido e líquido, utilizando-se o calor para inativação, seguido de tratamento com etanol e lise mecânica, como recomendado pela Bruker.
Os autores observaram 98% e 94% de correta identificação em gênero e espécie,
respectivamente (Balada-Llasat et al., 2013). Dunne e colaboradores (2014) demonstraram boa
efetividade na inativação de isolados de Mycobacterium spp. utilizando a lise mecânica por cinco minutos na presença de etanol 70%, seguida de um período adicional de inativação por
dez minutos (Dunne et al., 2014). Da mesma forma, Mather e colaboradores (2014) avaliaram
198 isolados clínicos utilizaram a lise mecânica com auxílio do vórtex e pérolas de silica na presença de etanol para inativação das amostras. Com o aprimoramento do banco de dados do
sistema Biotyper (v. 2.0) com 123 espectros de cepas clínicas, foi observada uma concordância
de 95% das espécies de Mycobacterium por este sistema e 94% utilizando-se o sistema VITEK
MS (Saramis) (Mather et al., 2014). Os bancos de dados dos sistemas VITEK MS e Biotyper têm sido atualizados principalmente com o aumento no número e variedade de espectros de micobactérias, o que deve melhorar o desempenho desta metodologia no futuro. A condição e tempo de crescimento das colônias de micobactérias também podem influenciar a qualidade dos espectros obtidos. Lotz e colaboradores (2010) observaram que quando cultivada em meio sólido (Löwenstein-Jensen), o extrato proteico obtido apresentava qualidade supeiror no espectro de massas do que quando as amostras eram cultivadas em meio líquido, consequentemente a identificação correta foi obtida para 97% e 77% dos isolados cultivados em meio sólido e líquido, respectivamente (Lotz et al., 2010).
2.1.2.4. Identificação de Fungos
A identificação de leveduras pelo MALDI-TOF MS apresenta bons resultados, sendo uma ótima alternativa aos métodos manuais, trabalhosos e demorados ou aos métodos automatizados e painéis comerciais, que são mais honerosos. Entretanto, há diferenças de desempenho quando avaliamos os sistemas disponíveis. O sistema VITEK MS apresenta excelentes resultados (97-95%), apenas com a transferência da colônia associada ao ácido
fórmico na própria placa do MALDI-TOF MS (Westblade et al., 2013; Pence et al., 2014; Hamprecht et al., 2014). Entretanto, o sistema da Bruker somente apresenta bons resultados (90%), quando a análise é precedida de extração proteica, utilizando-se ácido fórmico e acetonitrila. Esse sistema alcançou 100% quando o sistema Biotyper (v. 3.0) foi adicionado à
construção de um banco de dados próprio (Mancini et al., 2013). Desta forma, o sistema Biotyper
requer melhorias no seu banco de dados em relação aos espectros de leveduras incluídos. Corroborando com estes achados, De Carolis e colaboradores (2014) demonstraram excelente desempenho (96% de 4232 leveduras) quando, além do desenvolvimento do seu próprio banco de espectros com 156 cepas referências de leveduras, os autores realizaram um rápido procedimento de extração, analisando o sobrenadante da combinação de uma colônia com 50 µL de ácido fórmico a 10%, após homogenização vigorosa com auxílio de um vórtex (De
Carolis et al., 2014). Santos e colaboradores (2011) avaliaram 67 isolados de leveduras,
intimamente relacionadas, como Candida parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis; C. albicans e C. dubliniensis; e C. glabrata e C. bracarensis, que somente podem ser discriminadas entre si através de técnicas moleculares. Apesar de algumas espécies não apresentarem
espectros no banco de dados Saramis, quando os mesmos foram inseridos, o MALDI-TOF MS
foi capaz de identificar e distinguir todas as espécies, mostrando-se uma excelente ferramenta para identificação de leveduras (Santos et al., 2011). Em nossa experiência com o sistema
VITEK MS para identificação direta da colônia de 66 leveduras, incluindo Trichosporon asahii,
Kodamaceri ohmeri e diversas espécies emergentes de Candida, obtivemos 92% e 84% de
concordância em gênero e espécies com o sistema API ID32, respectivamente (Mota et al.,
2014).
Embora a identificação de fungos filamentosos possa ser realizada pela plataforma de MALDI-TOF MS, cuidados devem ser tomados para evitar que meios de cultura possam favorecer a mutagênese ou a presença de inibidores que alterem o perfil proteico, e levem,
consequentemente, às alterações nas análises pelo MALDI-TOF MS (Santos et al., 2010). Outro desafio é a aquisição das proteínas totais e em qual momento do crescimento fúngico a extração proteica deverá ser realizada de modo efetivo. Diferentes protocolos foram descritos na literatura e bons resultados foram alcançados quando banco de dados apropriados foram combinados. Isso demonstrou, que da mesma forma como ocorre para micobactérias, os sistemas atualmente disponíveis requerem aprimoramento dos seus respectivos bancos de espectros para fungos filamentosos (Lau et al., 2013; Schulthess et al., 2014).
2.1.2.5. Identificação de Micro-organismos Diretamente de Frascos de Hemocultura
O diagnóstico etiológico rápido de infecção de corrente sanguínea (ICS) e a introdução precoce da terapia antimicrobiana são a base para o sucesso clínico desta grave infecção. Atualmente, o procedimento mais utilizado para o diagnóstico etiológico de ICS requer a cultura em meio líquido, continuamente monitorizada, seguida da pesquisa direta pela coloração de GRAM e subcultivo para a realização de testes fenotípicos de identificação bacteriana, automatizados, ou não, seguido do teste de sensibilidade aos antimicrobianos. Este processo geralmente necessita de 3 a 5 dias, retardando a adequação da terapia antimicrobiana. Algumas limitações comprometem ainda mais o resultado deste processo como a baixa sensibilidade na
detecção de micro-organismos de difícil crescimento (Bizzini et al., 2011).
A redução no tempo de resposta dos resultados microbiológicos é muito desejada para melhorar o desfecho clínco dos pacientes, otimizar o uso de antimicrobianos, e, reduzir custos
(Doern et al., 1994; Barenfanger et al., 1999). A comunicação da coloração de Gram é
considerada urgência para as boas práticas de microbiologia clínica, e mostrou-se de grande
valor para a adequação de terapia empírica (Munson et al., 2003). Barenfanger e colaboradores
(2008) reportaram uma redução significativa da mortalidade geral quando grupos pareados de pacientes com ICS foram comparados em relação ao tempo de comunicação da coloração de
Gram. O grupo em que o Gram foi reportado em menos de 1 hora (tempo médio 0,1 hora) a mortalidade foi de 10% enquanto que quando o Gram ultrapassou este tempo (média de 3,3
horas) a mortalidade elevou-se para 19% (Barenfanger et al., 2008). Portanto, há uma imensa
necessidade de testes que auxiliem na instituição da terapia antimicrobiana apropriada precoce. Com este objetivo, diversos protocolos foram propostos para obter a identificação do micro-organismo causador de ICS diretamente de frascos de hemocultura utilizando-se a técnica de
MALDI-TOF MS (Prod’hom et al., 2010; Martiny et al., 2012; Stevenson et al., 2010). A Tabela 1
Tabela 1. Diferenças entre os principais artigos publicados que descreveram a identificação de bactérias diretamente do frasco de hemocultura.
Estudo MALDI-TOF MS Extração Volume da HMC soluções utilizadas N de passos e Análise Critério comparação Método de N° Concordância Erros
Stevenson et al., 2010 Microflex LT "in house" utilizando tubo contendo gel separador 8 mL 5 passos de lavagem e centrifugação; solução de lise NH4Cl, NaHCO3, EDTA Extração
proteica A Convencional 202 95% complexoEspécie: E. cloacaeS. mitis;
Prod'hom et al., 2010 Microflex LT "in house" 5 mL 3 passos de lavagem e centrifugação; solução de lise NH4Cl e KHCO3
Extração
proteica B Convencional 122 79%
Espécie: S. caprae; Não identificou 21%
Kok et al., 2011 Microflex LT Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e centrifugação Extração proteica B Convencional 476 75% putida Espécie: Não identificou: S. mitis; P. 23,7%
Vlek et al., 2012 Microflex LT "in house" 5 mL 3 passos de lavagem e centrifugação Extração proteica B Convencional 89 56% Não identificou: 39%
Martiny et al., 2012
Microflex LT "in house" 1 mL
2 passos de lavagem e centrifugação, solução
de lise Saponina 5% Colônia C Convencional 59
BGN: 90%; CGP:
62% Espécie: identificou: 27% S. typhi; Não
Microflex LT Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e centrifugação
Extração proteica para CGP e Colônia para BGN C Convencional 59 BGN: 68%; CGP: 73% Espécie: S. typhi e S. marcescens; Não identificou: 29%
Chen et al., 2013 Microflex LT Martiny et al., "in house" de
2012 1 mL 2 passos de lavagem e centrifugação, solução de lise Saponina 5% Extração proteica D Sequenciamento
Vitek MS "in house" de Martiny et al., 2012 1 mL 2 passos de lavagem e centrifugação, solução de lise Saponina 5% Extração
proteica E Sequenciamento gene 16S rRNA 92 88% Não identificou: 12%
Microflex LT Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e centrifugação Extração proteica D Sequenciamento gene 16S rRNA 202 94% Não identificou: 6,5%
Vitek MS Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e centrifugação Extração proteica E Sequenciamento gene 16S rRNA 202 88% Não identificou: 12%
Lagacé-Wiens et al., 2012 Microflex LT Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e centrifugação Extração proteica B Convencional 61 85% Gênero: Não identificou: 15% S. mitis, SCN;
Clerc et al., 2013 Microflex LT Prod'hom"in house" de et al., 2010
5 mL 3 passos de lavagem e centrifugação; solução de lise NH4Cl e KHCO3 Extração proteica B Convencional 165 87% Modificou a terapia empírica em 35% dos casos
Jamal et al., 2013a Microflex LT Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e centrifugação Extração proteica B Convencional e Seq. 16S rRNA 160 76%
Gênero: K. oxytoca; Espécie: Salmonella arizonae; A. baumannii, Streptococcus e Staphylococcus; Não identificou: 5,6%
Abreviaturas:HMC - Hemoculturas. Critérios adotados para identificação do micro-organismo: A. Score < 1,7: não identificado; 1,7-1,9: identificado em gênero;
≥ 1,9: identificado em espécie; B. Score < 1,7: não identificado; 1,7-1,99: gênero; ≥ 2: identificado em espécie; C. < 1,7: não identificado; 1,7-1,99: identificado em gênero; > 2: identificado em espécie. D. < 1,6: não identificado; 1,6-1,99: identificado em gênero; ≥ 2 : identificado em espécie; E. valor < 90%: não identificado; 90 - 98%: identificado em gênero e >98%: identificado em espécie.
Em seu estudo, Clerc e colaboradores (2013) utilizaram o MALDI-TOF MS para identificação de micro-organismos diretamente dos frascos de hemocultura e avaliaram seu impacto na adequação da terapia antimicrobiana mesmo após a comunicção da coloração de
Gram em um cenário de baixa prevalência de bactérias MDR (Clerc et al., 2013).A adequação
da terapia pelo resultado do MALDI-TOF MS foi realizada em 35% dos casos de bacteremia apesar do resultado prévio da coloração de Gram. Vlek e colaboradores (2012) também observaram um impacto significativo do resultado da identificação pelo MALDI-TOF MS diretamente do frasco de hemocultura na modificação da terapia antimicrobiana de pacientes com ICS (Vlek et al., 2012).
Apesar do benefício da identificação bacteriana precoce, o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, especialmente para aqueles considerados determinantes para o tratamento de infecções graves, como os carbapenens, é imprescindível para a adequação da terapia, principalmente em regiões de alta prevalência de bactérias multirresistentes.
De maneira geral, a introdução da espectrometria de massa na microbiologia clínica trouxe um grande avanço, tanto em termos de rapidez como de acurácia frente aos métodos disponíveis até o momento (Figura 3). Pela primeira vez, o laboratório de microbiologia tem disponível, em uma única plataforma, a possibilidade de identificar diferentes micro-organismos, desde bactérias comumente isoladas na prática clínica, como bactérias fastidiosas ou de díficil identificação, micobactérias, leveduras e fungos filamentosos. Adicionalmente, esta metodologia tem sido aplicada com sucesso para a identificação de micro-organismos diretamente de amostras clínicas, especificamente de frascos de hemoculturas.
Figura 3. Fluxograma do uso da técnica de MALDI-TOF MS na identificação de micro-organismos no laboratório de microbiologia clínica. Adaptado de Carvalhaes e colaboradores (2012).
Entretanto, aprimoramentos nos bancos de referência de espectros, assim como, em metodologias e padronizações de extrações e análises são necessárias e devem ocorrer no futuro próximo. Este sistema apresenta vantagens frente aos tradicionais sistemas de
identificação de micro-organismos, sendo essas: (i) facilidade de implantação; (ii) fácil manuseio
do equipamento e software; (iii) rapidez nos resultados; (iv) capacidade de identificação a partir
da colônia de bactérias e leveduras; assim como diretamente de amostras clínicas,
especificamente hemocultura (v) a acurácia semelhante ou superior a dos métodos
automatizados; (vi) baixo consumo de reagentes; (vii) poucos resíduos; (viii) baixo custo por
amostra; e (ix) com uma aplicação potencial para aplicação em tipagem de micro-organismos e