Padronização e Aplicação da Espectrometria de Massa por Ionização e Dessorção a Laser - Assistida por Matriz na Detecção de Carbapenemases em Bactérias Gram-negativas
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutor em Infectologia.
São Paulo
CECILIA HELENA VIEIRA FRANCO DE GODOY CARVALHAES
Padronização e Aplicação da Espectrometria de Massa por Ionização e Dessorção a Laser - Assistida por Matriz na Detecção de Carbapenemases em Bactérias Gram-negativas
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutor em Infectologia.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales Coorientador: Dr. Rodrigo Cayô da Silva
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro fornecido pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
São Paulo 2014
CARVALHAES, Cecilia Helena Vieira Franco de Godoy
Padronização e Aplicação da Espectrometria de Massa por Ionização e Dessorção a Laser - Assistida por Matriz na Detecção de Carbapenemases em Bactérias Gram-negativas. Cecilia Helena Vieira Franco de Godoy Carvalhaes - São Paulo, 2014.
xxiii, 179.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Standardization and application of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry for carbapenemase detection in Gram-negative rods.
1. Pseudomonas spp., 2. Acinetobacter spp., 3. Enterobactérias, 4. Klebsiella pneumoniae; 5. β-lactamase; 6. OXA-carbapenemase; 7. KPC; 8. Infecção de corrente sanguínea; 9. Metalo-β-lactamase; 10. MALDI-TOF MS; 11. Hemocultura;
12. Espectrometria de massa; 13. Resistência bacteriana.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Profa. Dra. Maria Tereza Zanella
Coordenador do curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
Chefe da Disciplina de Infectologia:
Prof. Dr. Celso Franciso Hernandes Granato
São Paulo 2014
CECILIA HELENA VIEIRA FRANCO DE GODOY CARVALHAES
Padronização e Aplicação da Espectrometria de Massa por Ionização e Dessorção a Laser - Assistida por Matriz na Detecção de Carbapenemases em Bactérias Gram-negativas
BANCA EXAMINADORA:
Presidente:
Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Professora Adjunta e Diretora do Laboratório ALERTA da Disciplina de Infectologia do Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
Titulares:
Prof. Dr. Luis Martinez-Martinez
Professor Titular do Departamento de Biología Molecular da Facultad de Medicina da Universidad de Cantabria - UNICAN e Chefe do Servicio de Microbiología do Hospital Universitario Marqués de Valdecilla - IDIVAL, Santander, Espanha.
Prof. Dr. Cledir Rodrigues Santos
Gerente da Qualidade da Micoteca da Universidade do Minho, Braga, Portugal e Professor Visitante Internacional no Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras, Minas Gerais.
Prof. Dr. Adagmar Andriolo
Professor Associado e Livre Docente da Disciplina de Patologia Clínica do Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
Prof. Dr. Luis Fernando Aranha Camargo
Chefe do Grupo de Infecção em Transplantes da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
Suplentes:
Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino
Professora Adjunta da Disciplina de Microbiologia do Departamento de Ciências Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e Médica-coordenadora do Setor de Microbiologia do Laboratório Clínico da Sociedade Beneficente Israelita Brasileira Hospital Albert Einstein (SBIBHAE).
Prof. Dr. João Nóbrega de Almeida Júnior
Médico Assistente do Laboratório de Microbiologia da Divisão de Laboratório Central, Hospital das Clínicas - HC, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - USP.
“O começo de todas as ciências é o espanto de as coisas serem o que são”
Aristóteles
Dedico este trabalho ao meu pai, Prof. Dr. Cid Vieira Franco de Godoy, a quem eu tenho muito orgulho de chamar de PAI.
Agradeço à DEUS, pela Sua INTERCEDÊNCIA na minha vida, pela Sua SABEDORIA acima de todas as coisas, e por permitir a CONFLUÊNCIA de fatores que me levaram a concretizar esta jornada.
Agradeço ao meu pai, Prof. Dr. Cid Vieira Franco de Godoy, mas para mim, MEU PAI, que com muito amor e dedicação me ensinou o valor do ESFORÇO e da DEDICAÇÃO, e que devo sempre ter mérito e perseverança para alcançar os meus objetivos. Pai, você me proporcionou todos os instrumentos para que eu trilhasse meu caminho. OBRIGADA MEU PAI.
Agradeço à minha amada mãe, Maria Carmen, não há palavras no mundo que possam expressar meu reconhecimento e retribuir seu AMOR, DEDICAÇÃO e CARINHO, sempre tão presentes em minha vida. Mãe, você é o meu alicerce. Obrigada por procurar fazer de mim uma pessoa melhor, por ser o exemplo do AMOR INCONDICIONAL, por me ensinar a FÉ e a buscar
Agradeço ao meu amado marido, Marcelo, meu companheiro de uma longa jornada, pela paciência, pela compreensão nos momentos em que estive ausente, pelos conselhos, pela segurança na tomada de decisões. Agradeço a construção e dedicação à nossa MARAVILHOSA FAMÍLIA e por permitir que eu buscasse meu SONHO e a minha REALIZAÇÃO.
Agradeço aos meus amados filhos, Alessandra e Lucas, que me ensinaram que a VIDA é um milagre de DEUS e que o AMOR pode ser maior do que eu poderia imaginar. Obrigada pela
Agradeço às minhas irmãs, Cris, Carola e Silvinha, minhas amadas companheiras de vida, cada uma um exemplo incrível de dedicação, perseverança, esforço e força. Obrigada, pelo amor e carinho a mim dedicados, por estarem do meu lado em TODOS os momentos da minha vida e me levantarem quando mais precisei. Somos uma IRMANDADE com toda força, amor e união que a palavra remete. Amo vocês.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora e amiga, Profa. Dra. Ana Cristina Gales, por quem tenho imenso RESPEITO e ADMIRAÇÃO. Sinto-me imensamente privilegiada não apenas pelos inúmeros conhecimentos transmitidos e grande dedicação à minha formação, mas também pela sua essência, pela busca no aprimoramento do SER HUMANO, mente e espírito, por compartilhar experiências de VIDA e por me dedicar seu escasso tempo com muito carinho. Tenho ORGULHO de ser sua aluna e, muito mais, de ser sua AMIGA. OBRIGADA, Ana.
Ao meu grande AMIGO, Rodrigo Cayô, a quem eu muito ADMIRO pela DEVOÇÃO ao trabalho, pelo ESFORÇO e MÉRITO por tudo que faz e, principalmente, o que o destaca, pela sua capacidade de se DOAR aos outros. Eu agradeço pelos inúmeros momentos que passamos juntos, pelo conhecimento compartilhado, pelos conselhos, pelo altruísmo e dedicação para comigo. Agradeço do fundo do meu coração. OBRIGADA, meu AMIGO.
À UNIFESP, a minha amada ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA, que ainda jovem me acolheu, onde apreendi e trilhei meu caminho profissional com muito orgulho. Onde agora posso retribuir o muito que me foi ensinado.
Ao Prof. Dr. Adagmar Andriolo, por me acolher na Patologia Clínica, e compartilhar seus conhecimentos. Agradeço pela sua dedicação e perseverança em tornar nossa especialidade reconhecida e forte.
À Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado, por me ensinar MICROBIOLOGIA, por me auxiliar na busca pelo mestrado e doutorado, pelos inúmeros conselhos pessoais e profissionais, e, principalmente, pelo sempre presente suporte profissional. OBRIGADA pelo INCENTIVO e ORIENTAÇÃO.
À minha querida AMIGA, Eliete Frigatto, que me passou mais do que seus conhecimentos e imensa experiência, mas também sua paixão pela nossa MICROBIOLOGIA. Uma grande amiga, um exemplo de dedicação e altruísmo, de respeito e responsabilidade, de comprometimento e educação. Sinto-me honrada de tê-la ao meu lado, no trabalho, mas, principalmente, na vida.
À Equipe de Microbiologia do Laboratório Central, por me acolher ainda na resisdência médica, por compartilhar seus conhecimentos, por dividir momentos de alegria e de tristeza, por sofrer com a falta e alegrar-se com as nossas conquistas e, principalmente, por tornarem-se a MINHA EQUIPE, da qual eu tenho muito orgulho de estar a frente.
A todos os Médicos e Colaboradores do Laboratório Central e Disciplina de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial pelo apoio e incentivo, pela alegria do convívio diário.
Ao Prof. Dr. Luis Fernando Aranha Camargo, por me receber no seu competente e dedicado grupo de Infecção em Transplante, onde tive oportunidade de adicionar à minha formação seus preciosos conhecimentos de Infectologia, e compartilhar com profissionais de excelência, como Dr. Alexandre Marra, Dr. Moacyr Silva Jr., Dr. Fernando Gatti Menezes e Dr. Marcelo Mostardeiro. Obrigada a todos pela amizade, companheirismo e conhecimentos compartilhados.
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, pelo exemplo do que significa a profissão de Médico, pela dedicação aos pacientes acima de tudo, pelos ensinamentos e conselhos fornecidos, pela experiência de vida compartilhada, por me ensinar a ser flexível e me mostrar caminhos não antes percebidos. OBRIGADA Professor pela sua SABEDORIA.
Aos pós-graduandos do Laboratório ALERTA, Adriana Nicoletti, Adriana Pereira, Ana Carolina Ramos, Ana Paula Streling, Anderson Santos, Bruna Nonato, Danilo Xavier, Dandara Corsi, Eloiza Campana, Eliete Frigatto, Fernanda Petrolini, Fernanda Rodrigues, Graziela Braun, Jéssica Werneck, Jhonatha Moura, Juliana Provasi, Lorena Fehlberg, Lucas Andrade, Lygia Schandert, Marina Visconde, Paula Peraro, Rafael Affini, Renata Picão, Rodrigo Cayô e Talita Barone, que me ensinaram a MICROBIOLOGIA de ponta, mas também o respeito, a amizade e a dedicação entre companheiros de trabalho. Agradeço a todos aqueles que hoje estão no laboratório e também àqueles que por lá passaram e plantaram suas sementes, àqueles que participaram ativamente dos meus trabalhos e dos quais são coautores, que me auxiliaram quando eu tinha minhas obrigações maternas e que cresceram junto comigo.
Agradeço às minhas coorientandas, Ana Carolina, Bruna e Eliete, que me proporcionaram um amadurecimento profissional. Agradeço especialmente, as minhas amigas Raquel Girardello, Ana Carolina Ramos e Ana Paula Streling.
Aos pós-graduandos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC) pelos ensinamentos e experiências compartilhadas. Agradeço em especial ao Dr. André Doi e à Rosana Capecce.
Ao Prof. Dr. Luis Martínez-Martínez, por me receber em um curto estágio em seu Serviço de Microbiologia, em Santander, Espanha. Agradeço pela oportunidade de conhecer e a almeijar um serviço de excelência, pelos seus inúmeros conhecimentos compartilhados, pela dedicação e conselhos em nossos projetos. Agradeço imensamente por me dar a honra de ser membro de minha banca de doutorado.
À Equipe do Servicio de Microbiología do Hospital Universitário Marqués de Valdecilla, Santander, Espanha, por me acolher e compartilhar seus conhecimentos, especialmente, Bélem Ruiz del Castillo, Elena Román Paucar, Alain Ocampo Sosa e Dr. Jorge Calvo Montes.
À querida amiga María Pilar Garcillán Barcia, que acolheu a mim e a minha família em sua casa, pelo carinho, alegria e dedicação. MUITO OBRIGADA.
Ao Departamento de Biofísica da UNIFESP, ao Prof. Dr. Luiz Juliano Neto e Profa. Dra. Maria Juliano, pela colaboração e apoio aos nossos estudos. À toda equipe, especialmente, à Débora e Lilian, pelos auxílios e dedicação a mim dispensados.
Ao amigo Diego Magno Assis, por acreditar e se dedicar ao nosso projeto, pelos conhecimentos e grandes momentos de alegria compartilhados quando no sucesso do projeto.
Muito OBRIGADA, sem você este trabalho não teria se concretizado.
Ao Prof. Dr. Alberto Duarte, pelo apoio e incentivo para conclusão deste trabalho. Tenho uma grande ADMIRAÇÃO pelo seu exemplo de que a ciência PODE e DEVE estar acima de outros interesses.
Aos meus colegas e amigos do HCor, pela compreensão, apoio e estímulo para a conclusão deste trabalho. Agradeço especialmente ao Dr. André Doi, Dr. Nilo Duarte, Dra. Carina Ceneviva, Dr. Luis Gustavo, Dra. Maria Rita Elmor de Araújo, Dra. Lucilene Rodrigues e Dra. Annelise Lopes. Agradeço também ao carinho e atenção dispensados a mim pela equipe da
À minha sogra, Maria Alice, pela sua IMENSA dedicação à minha família, por me auxiliar e me dar o suporte para que eu pudesse me ausentar muitas vezes do meu lar. OBRIGADA por estar sempre presente, pelo seu APOIO, COMPREENSÃO, CARINHO e DEVOÇÃO.
Ao meu querido sogro, Luís Fernando, a quem eu tenho enorme apreço, AGRADEÇO o AMOR que tem por mim e pelos meus filhos, AGRADEÇO à DEUS por permitir compartilhar destes momentos preciosos ao seu lado, e PEÇO com muito carinho que cuide de sua sáude, para que desfrutemos de muitos outros.
À Amara Maria Felix, que com simplicidade, muita dedicação, paciência e AMOR cuida dos meus filhos como se fossem seus, me garantindo a segurança e confiança para exercer meu trabalho profissional. O meu profundo AGRADECIMENTO.
O meu muito obrigado aos pacientes, que proporcionaram a execução deste trabalho, muitos dos quais já evoluiram para outra dimensão em decorrência destas infecções. Que o fruto deste trabalho posse reverter em benefício a muitos outros pacientes que virão.
Às bactérias, a quem tenho apreço e respeito, pois apesar de suas minúsculas dimensões, habitam a Terra há milhares de anos antes que nós e provavelmente a habitarão por milhares de anos a mais. Temos ainda muito que apreender com vocês.
SUMÁRIO
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... XVIII ÍNDICE DE TABELAS ... XX ÍNDICE DE FIGURAS ... XXI
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 6
2.1. A Espectrometria de Massa Aplicada à Microbiologia Clínica ... 7
2.1.1. O Princípio da Técnica de MALDI-TOF MS... 9
2.1.2. A Espectrometria de Massa na Identificação de Micro-organismos ... 11
2.1.2.1. Identificação de Bactérias Aeróbicas...13
2.1.2.2. Identificação de Bactérias Anaeróbicas...15
2.1.2.3. Identificação de Micobactérias...15
2.1.2.4. Identificação de Fungos...16
2.1.2.5. Identificação de Micro-organismos Diretamente de Frascos de Hemocultura...18
2.1.3. A Espectrometria de Massa na Tipagem de Micro-organimos ... 24
2.1.4. A Espectrometria de Massa na Resistência aos Antimicrobianos ... 25
2.2. Epidemiologia das Bactérias Gram-negativas no Ambiente Hospitalar ... 27
2.2.1. Resistência aos Antimicrobianos β-lactâmicos em Bactérias Gram-negativas ... 31
2.3. Mecanismos Envolvidos na Resistência aos Carbapenens ... 34
2.3.1. Cefalosporinases e ESβL Associadas à Impermeabilidade de Membrana ... 35
2.3.2. Produção de β-lactamases: Carbapenemases... 45
2.3.3.1. Carbepenemases de Classe A...49
2.3.3.2. Carbapenemases de Classe B...52
2.3.3.3. Carbapenemases de Classe D...54
2.4. Impacto Clínico da Resistência aos Carbapenens ... 56
2.5. Metodologias Aplicadas à Detecção de Carbapenemases ... 60
2.5.1. Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos ... 61
2.5.2. Teste de Hodge Modificado ... 64
2.5.3. Teste com Inibidores de Carbanemases ... 65
2.5.4. Testes Genotípicos ... 67
2.5.5. Testes Baseados na Detecção da Atividade Enzimática ... 69
2.5.5.1. Testes Colorimétricos (Carba NP, CarbAcineto NP e Blue Carba)...69
2.5.5.2. Espectrofotometria...71
2.5.5.3. Espectrometria de Massa - MALDI-TOF MS...71
3. OBJETIVOS ... 75
4. ARTIGOS CIENTÍFICOS ... 77
4.1. Artigo Científico 1: Detection of SPM-1-Producing Pseudomonas aeruginosa and Class D β-Lactamase-Producing Acinetobacter baumannii Isolates by Use of Liquid Chromatography- Mass Spectrometry and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry………..………....79
4.2. Artigo Científico 2: Detection of carbapenemase activity directly from blood culture vials using MALDI-TOF MS: a quick answer for the right decision……….………92
4.3. Artigo Científico 3: Detection of carbapenemase activity using VITEK® MS: Interplay of carbapenemase type and period of incubation………..……108
5. DISCUSSÃO ... 118
6. CONCLUSÕES ... 138
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 140
8. ANEXOS ... 165
8.1. Anexo 1: Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results………..………….…167
8.2. Anexo 2: Tabela 8 - Estudos da literatura que avaliaram a detecção de carbapenemases pela ténica de MALDI-TOF MS...178
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APACHE - Acute Physiology and Chronic Health Evaluation APBA - Ácido Aminofenil Borônico
BRCAST - Comitê Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos CARB - White House National Strategy for Combating Antibiotic Resistant Bacteria CDC - Centers for Disease Control and Prevention
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CHDL - Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamases CLSI - Clinical Laboratory Standard Institute
DPA - Ácido Dipicolínico
EARS-Net - European Antimicrobial Resistance Surveillance Network ECDC - European Centrer for Disease Prevention and Control EDTA - Ethylenediamine Tetraacetic Acid
ESβL - Extended-Spectrum β-Lactamases EUA - Estados Unidos da America
EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing HCCA - Ácido α-Ciano-4-Hidroxicinâmico
ICSP - International Committee on Systematics of Prokaryotes ICS - Infecção de Corrente Sanguínea
IRAs - Infecção Relacionada à Assistência à Saúde IS - Insertion Sequence
KPC - Klebsiella pneumoniae carbapenemase LPS - Lipopolissacarídeos
MALDI-TOF MS - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight - Mass Spectrometry
MβL - Metalo-β-Lactamases MDR - Multirresistentes MHT - Modified Hodge Test
MRSA - S. aureus resistente à meticilina MSSA - S. aureus sensível à meticilina
NCBI - National Center for Biotechnology Information NHSN - National Healthcare Safety Network
OMS - Organização Mundial da Saúde OMPs - Proteínas de membrana externa
PAV - Pneumonia associada à ventilação mecânica PCA - Análise dos Componentes Principais
PCR - Polymerase Chain Reaction SBI - Sociedade Brasileira de Infectologia SBM - Sociedade Brasileira de Microbiologia
SBPC/ML - Sociedade Brasileira de Patologia Clínica / Medicina Laboratorial SCIHs - Serviços de Controle de Infecção Hospitalar
SCoN - Staphylococcus coagulase negativa STs - Sequences Types
TSB - Caldo tríptico de soja
UTIs - Unidades de Terapia Intensiva
VRE - Enterococcus spp. resistentes à vancomicina WHO - World Health Organization
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Diferenças entre os principais artigos publicados que descreveram a identificação de bactérias diretamente do frasco de hemocultura... 20
Tabela 2. Característica dos estudos de vigilância epidemiológica que incluem isolados bacterianos brasileiros... 30
Tabela 3. Classificação das β-lactamases adaptada de Bush & Jacoby (2010)... 42 Tabela 4. Características das principais carbapenemases reportadas………... 46 Tabela 5. Pontos de corte utilizados para triagem e para classificação da sensibiliade de enterobactérias recomendados pelo EUCAST e CLSI...………..…...…... 63
Tabela 6. Characterization of the 73 clinical isolates and performance of carbapenemase detection by different methodologies (Table 1 - Artigo Científico 1)………... 88
Tabela 7. Carbapenem susceptibility profile and time in days for detection of carbapenemase- producing isolates by MALDI-TOF MS (Table 1 - Artigo Científico 2)………... 107
Tabela 8. Interplay of carbapenemase type and period of incubation (IP) for detection of carbapenemase activity by testing VITEK® MS (Table 1 - Artigo Científico 3)……... 114
Tabela 9. Estudos da literatura que avaliaram a detecção de carbapenemases pela ténica de MALDI-TOF MS...………... 178
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Espectômetro de massa - MALDI-TOF MS... 10 Figura 2. Espectro de massa gerado pelo MALDI-TOF MS para diferentes espécies bacterianas... 14
Figura 3. Fluxograma do uso da técnica de MALDI-TOF MS na identificação de micro-organismos no laboratório de microbiologia clínica... 23
Figura 4. (A) The hydrolysis of ETP mediated by β-lactamases occurring in two steps. (B) Analysis of ETP degradation by MALDI-TOF MS (Figure 1 - Artigo Científico 1)... 90
Figura 5. Analysis of ETP degradation by MALDI-TOF MS from carbapenemase-producing isolate and non-carbapenemase-producing isolate (Figure 1 - Artigo Científico 2)..……….………... 106
Figura 6. Interplay of carbapenemase type and period of incubation (IP) for detection of carbapenemase activity by testing VITEK® MS (Figure 1 - Artigo Científico 3)... 114
RESUMO
A presente tese de doutorado objetivou a padronização e a aplicação do MALDI-TOF MS na detecção de carbapenemases em bacilos Gram negativos. Inicialmente, realizamos a padronização de um ensaio para detecção da atividade de diferentes carbapenemases pela técnica de MALDI-TOF MS. Foram testados para esse estudo 73 isolados clínicos produtores e não produtores de carbapenemase. O método foi comparado à LC-MS, ao MHT e à espectrofotometria. O espectro de massa do ertapenem mostrou-se superior ao do imipenem e ao do meropenem. A atividade de carbapenemase das classes A e B foi rapidamente detectada pelo MALDI-TOF MS após 2 horas de incubação, enquanto uma extensão do período de incubação foi necessária para a detecção das enzimas da classe D em isolados de A.
baumannii. Embora todos os resultados obtidos pelo MALDI-TOF MS tenham sido confirmados pela LC-MS e pela espectrofotometria, o MHT detectou 55%, 100% e 68% das enzimas de classes D, A e B testadas, respectivamente. No segundo estudo, padronizamos a técnica de MALDI-TOF MS na detecção de carbapenemase diretamente de 100 frascos de hemocultura.
Adicionalmente, realizamos a rápida identificação dos micro-organismos causadores de infecção de corrente sanguínea diretamente da hemocultura. O ensaio de carbapenemase no MALDI-TOF MS identificou 21 (72,4%) dos 29 isolados produtores de carbapenemase, especialmente aqueles produtores de KPC-2 (100%) e SPM-1 (100%), após um período de 4 horas de incubação. Apesar da maioria dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 não terem sido identificados no primeiro dia, todos foram identificados como produtores de carbapenemases quando testados diretamente da colônia bacteriana no dia seguinte. Após a padronização da técnica de MALDI-TOF MS na detecção de diferentes carbapenemases direto da colônia bacteriana e de hemoculturas, utilizando o equipamento da Bruker Daltonics, decidimos avaliar então o desempenho do VITEK MS. Nesse terceiro estudo, 79 isolados de bacilos Gram negativos produtores e não produtores de carbapenemases foram avaliados.
Taxas progressivas de detecção dos isolados produtores de carbapenemase foram observadas de acordo com o período de incubação para todas as classes. A maioria dos isolados produtores de KPC e MβL foi detectada após 1 hora de incubação. Entretanto, um período de 4 horas de incubação foi necessário para excluir a atividade de carbapenemases entre amostras produtoras de carbapenemases fracas, como as CHDLs em isolados de A. baumannii. A técnica de MALDI- TOF MS mostrou-se ser uma excelente ferramenta para a detecção de diferentes carbapenemases. As principais vantagens encontradas são a rapidez e acurácia na detecção das diferentes classes moleculares de carbapenemases, além da simplicidade de execução tanto da colônia bacteriana quanto diretamente dos frascos de hemocultura.
ABSTRACT
Initialy, we standardize a protocol for detecting carbapenemase activity from different carbapenemase-producing Gram-negative bacilli by MALDI-TOF M. A total of 73 carbapenemase- and non-carbapenemase-producing clinical isolates were studied. The method was compared to LC-MS, MHT and spectrophotometric assays. Ertapenem mass spectrum was easier to interpret than those of imipenem and meropenem. Class A and B carbapenemases were rapidly detected by MALDI-TOF MS in a 2-h assay. However, an extended incubation time was necessary for detection of class D carbapenemases in A. baumannii. Although, all MALDI- TOF MS results were confirmed by LC-MS and espectophotometric assay, MHT detected 55%, 100%, and 68% of classes D,A and B carbapenemases, respectively. In the second study, we standardized the MALDI-TOF MS assay for detecting carbapenemase activity directly from 100 positive blood culture vials. Additionally, we performed a rapid identification of microorganism causing bloodstream infections directly from blood cultures. The MALDI-TOF MS carbapenemase assay identified 21 of 29 (72.4%) of the carbapenemase-producing isolates directly from blood culture vials, especially those producing KPC-2 (100%) and SPM-1 (100%), after a 4 h incubation period. Although the majority of OXA-23-producing A. baumannii isolates were not identified on the first day, but all isolates were identified as carbapenemase producers directly from the bacterial colony on the next day. After the standardization of the MALDI-TOF MS carbapenemase protocol from both bacterial colony and directly from blood culture vials using the Bruker Daltonics’ equipment, we evaluated the performance of the VITEK MS by applying the same protocol. In the third study, a collection of 79 carbapenem-producing and 28 non- carbapenemase-producing Gram-negative clinical isolates were evaluated. Progressive detection rates of carbapenemase-producing isolates were observed according to the extension of incubation period for all classes. The majority of KPC and MβL-producing isolates were detected by testing 1-h incubation period. However, a 4-h incubation period was necessary to exclude carbapenemase activity in strains producing weak carbapenemases, like the CHDLs in A.
baumannii isolates. In conclusion, the MALDI-TOF MS showed to be an excellent tool for identifying bacterial species and different types of carbapenemase. Its main advantages are its simplicity, accuracy and speed in detecting different carbapenemases from both bacterial colony and positive blood culture vials.
1. INTRODUÇÃO
As doenças infecciosas são uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo. Uma grande diversidade de micro-organismos, desde virais, bacterianos, parasitários e fúngicos, são capazes de acometer indivíduos tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade. Apesar da euforia proveniente do decréscimo das taxas de mortalidade relacionadas às infecções bacterianas após a descoberta do primeiro antimicrobiano e da imunização em larga escala, vivenciamos, atualmente, a angústia da escassez de agentes eficazes contra uma progressiva gama de micro-organismos. Diversos fatores podem estar relacionados a este fato. O uso indiscriminado de agentes antimicrobianos não apenas na prática médica, mas igualmente na veterinária e, principalmente, na agricultura e na pecuária, seja, talvez, um dos maiores responsáveis pela seleção natural e disseminação de bactérias resistentes aos antimicrobianos (Cars et al., 2011).
A crescente observação da resistência aos antimicrobianos em isolados bacterianos é um fato que tem recebido grande destaque não apenas na comunidade médica, mas também no âmbito governamental, econômico e social. Em 2013, no Fórum Econômico Mundial de Davos a resistência bacteriana foi descrita como um dos poblemas que pode por em risco a existëncia da raca humana. Em abril de 2014, a Organização Mundial da Saúde (OMS) publicou um documento que alerta sobre o risco da era pós-antibiótica, onde não haverá antimicrobianos disponíveis para o tratamento de infecções causadas por bacterias mutirresistentes (WHO, 2014). Assim como, em 2013, o Center for Disease Control and Prevention (CDC) publicou um documento classificando o risco das bactérias multirresistentes e alertando sobre as taxas de mortalidade e dos custos relacionados às infecções causadas por bactérias multirresistentes.
Neste documento, é estimado que 23.000 mortes ocorram por ano nos Estados Unidos (EUA) em consequência das infecções causadas por bactérias resistentes. Além disto, estas infecções representam um custo adicional de $20 bilhões de dolares (CDC, 2013). Em ambas as publicações, do CDC e da OMS, as bactérias Gram-negativas constituem ao menos metade dos
agentes bacterianos citados como de urgente ou de grave ameaça à saúde pública. Destes, ambos os documentos citam enterobactérias, como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella não-typhi e Shigella spp., resistentes aos carbapenens, cefalosporinas de amplo espectro e/ou fluoroquinolonas como uma grave ameaça. O CDC ainda inclui neste grupo os isolados de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes (MDR).
O custo adicional relacionado às infecções causadas por bactérias multirresistentes ao sistema de saúde está relacionado à necessidade da prescrição de antimicrobianos, que podem ser mais tóxicos, menos efetivos e/ou mais onerosos. Além disso, mesmo quando há alternativa terapêutica, a mortalidade de pacientes acometidos por infecções causadas por micro- organismos resistentes a múltiplas classes de antimicrobianos é mais elevada, e aqueles pacientes que sobrevivem experienciam maior tempo de internação, recuperação prolongada e maior morbidade.
Diversas são as estratégias consideradas fundamentais para conter a resistência antimicrobiana. Dentre elas podemos citar, nos âmbitos sócio-econômico e veterinário, a proteção aos suprimentos alimentícios, o uso criterioso de antimicrobianos no agronegócio, na pecuária e na prática veterinária e, no âmbito da medicina, tanto o uso racional de antimicrobianos como o controle da disseminação pessoa-a-pessoa através da detecção, do tratamento e da prevenção. O entendimento da dimensão da resistência antimicrobiana em bactérias Gram-negativas no âmbito hospitalar, assim como dos mecanismos envolvidos na sua disseminação, constitue o ponto de partida para estabelecer as estratégias de detecção, terapia adequada e controle, sobre as quais versa este estudo.
Desde a descoberta do primeiro agente antimicrobiano da classe, os β-lactâmicos são a terapia de escolha para diversas infecções devido às suas propriedades favoráveis como amplo espectro de atividade, boa penetração tecidual e baixa toxicidade. As infecções graves causadas por bactérias Gram-negativas eram frequentemente tratadas com cefalosporinas de amplo
espectro, até o surgimento e disseminação de isolados produtores de β-lactamases de espectro extendido, quando o uso de carbapenens aumentou significativamente. Consequentemente, o surgimento e disseminação de carbapenemases nestes agentes restringiu o uso desta classe de antimicrobianos na prática clínica.
Atualmente, devido ao constante aumento da resistência aos antimicrobianos em isolados clínicos de P. aeruginosa, A. baumannii e enterobactérias em todo o mundo, estamos ingressando a era pós-antibiótica, onde a falta de opções terapêuticas disponíveis para estes patógenos tem limitado o tratamento das infecções causadas por bactérias MDR (Peleg &
Hooper, 2010). Sabe-se, ainda, que a resistência aos antimicrobianos e a terapia inadequada são fatores associados à mortalidade em pacientes com infecção graves por estes patógenos (Falagas et al., 2008). Nos casos de infecções graves, como a infecção de corrente sanguínea (ICS), somente com o conhecimento do micro-organismo causador e do seu perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, será possível a introdução precoce da terapia antimicrobiana adequada, que representa a base para o sucesso clínico do tratamento destas infecções.
A produção de carbapenemases em bactérias Gram-negativas é o principal mecanismo associado à resistência aos carbapenens. Porém, a diversidade de enzimas, assim como as diferentes características cinéticas e distribuição geográfica heterogênea dificultam sua detecção. Dessa forma, considerando que: (I) as bactérias Gram-negativas vêm aumentando sua participação nas infecções nosocomiais, especialmente espécies de enterobactérias, P.
aeruginosa e Acinetobacter spp.; (II) as taxas de resistência aos antimicrobianos entre estes isolados tem aumentado progressivamente. Apesar de múltiplos mecanismos de resistência possam estar presentes, a produção de β-lactamases é o principal mecanismo de resistência ao principal grupo de antimicrobianos utilizados para o tratamento de infecções graves causadas por estes agentes; (III) os carbapenens são os compostos mais potentes deste grupo e a produção de carbapenemases pelas espécies de bactérias Gram-negativas acima descritas
inviabiliza a utilização destes compostos como opção terapêutica em monoterapia; (IV) a frequente localização em elementos genéticos móveis dos genes que codificam as carbapenemases facilitam a disseminação destes fatores de resistência entre diferentes espécies bacterianas; (V) os testes disponíveis até o momento para a detecção de carbapenemases tem importantes limitações: (i) falta de rapidez para liberação dos resultados dificultando a administração da terapia antimicrobiana adequada e instituição de medidas de prevenção e controle de disseminação no ambiente hospitalar, (ii) flexibilidade para detecção de todas as inúmeras enzimas deste grupo, (iii) acurácia na detecção dos tipos e variantes de carbapenemases, (iv) baixo custo, para que possa ser realizados em diversos cenários econômicos, e (v) simplicidade de execução.
A espectrometria de massa consiste em uma nova ferramenta para detecção da atividade hidrolítica de carbapenemases através da vizualização da modificação da molécula do antimicrobiano. Dessa forma, optamos, inicialmente, pela padronização da detecção de carbapenemases pela espectrometria de massa (MS) utilizando a técnica de dessorção e ionização a laser assistida por matriz em um tempo de vôo (MALDI-TOF) a partir da colônia bacteriana, para, em seguida, prosseguir com a detecção diretamente de frascos de hemocultura.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. A Espectrometria de Massa Aplicada à Microbiologia Clínica
A espectrometria de massa está revolucionando a microbiologia ao redor do mundo. A identificação de micro-organismos que antes demoravam dias agora é realizada em minutos por um sistema automatizado e de simples utilizacao. Historicamente, a utilização da espectrometria de massa na microbiologia ganhou seu espaço quando a identificação de bactérias foi proposta nos anos 70, por Anhalt e Fenselau (1975). Estes autores demonstraram que espécies bacterianas poderiam ser discriminadas pela obtenção de espectros de massas após o aquecimento das mesmas (Anhalt & Fenselaul, 1975). Entretanto, somente com a descoberta de uma matriz capaz de ionizar macromoléculas de forma a não fragmentá-las através da absorção eficiente da energia do laser, pelo engenheiro japonês Kioshi Tanaka, é que esta tecnologia pôde ser aplicada para a identificação de micro-organismos (Tanaka et al., 1988). Este trabalho rendeu-lhe, em 2002, o Prêmio Nobel de Química. Na mesma época, Karas e Hillenkamp (1988), reportaram a dessorção e ionização suave (ou seja, sem fragmentação das proteínas) utilizando um composto orgânico como matriz, denominando-a de MALDI - dessorção e ionização à laser assistida por matriz (Karas & Hillenkamp, 1988).
Mesmo após este avanço, os primeiros experimentos para a identificação de bactérias usando a técnica de MALDI-TOF MS iniciaram-se na década de 90. Alguns pesquisadores apresentaram o método inicialmente utilizando a correlação de cada ion gerado com uma proteina e esta com o organismo fonte, através de um banco de dados de proteínas disponível na internet (Krishnamurthy & Ross, 1996; Demirev et al., 1999). O método, apesar de promissor, necessitava de aperfeiçoamentos relacionados ao preparo da matriz, da reprodutibilidade dos espectros de massas, da presença de contaminantes, e principalmente, da acurácia, robustez e agilidade no banco de dados. Dessa forma, muitos anos se passaram antes que a tecnologia pudesse ser disponibilizada, mesmo que somente na pesquisa em laboratórios de microbiologia.
Vários anos foram dedicados à implementação de um banco de dados robusto, acurado que
permitisse a agilidade da análise realizada pelo MALDI-TOF MS. Pesquisadores de diversas instituições participaram do desafio de criar e comparar os perfis de massas dos micro- organismos com bancos de dados contendo os espectros de referência através da criação de diversos algoritmos (Fenselau & Demirev, 2001; Keys et al., 2004).
A aprovação nos órgãos regulamentadores e a comercialização do MALDI-TOF MS para os laboratórios de microbiologia clínica ocorreu apenas recentemente. A lista de micro- organismos do sistema MALDI Bioyper (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) aprovada pelo Federal and Drug Administration (FDA) nos EUA, e pela ANVISA, no Brasil, está limitada apenas às bactérias Gram-negativas, apesar de sua aplicação para a identificação de outros micro- organismos estar disponível somente para fins de pesquisa. Este sistema permite a construção personalizada de um banco de dados. O sistema VITEK® MS (bioMérieux, Marcy l'Etoile, França) está aprovado pelo FDA e pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para identificação de bactérias aeróbias e anaeróbias, Gram-negativas e Gram positivas, além de leveduras. Apesar de ambos os equipamentos serem compostos por um espectrômetro de massa, por banco de dados e por um software, estes diferem de um equipamento para o outro.
O MALDI Biotyper é um equipamento de menor porte, de bancada, capaz de trabalhar em sistema aberto ou fechado, utilizando o mesmo banco de dados denominado Biotyper system, atualmente na versão 4.0. O VITEK MS é um equipamento instalado sobre o piso, e disponibiliza dois sitemas de banco de dados, o Myla (IVD) e o Saramis (RUO), porém, estes foram combinados recentemente no VITEK MS Plus. Algumas diferenças em relação ao manuseio dos sistemas e amostras também ocorrem. O MALDI Biotyper analisa no máximo 96 amostras por corrida e disponibiliza placas de metal reutilizáveis, já o VITEK MS analisa quatro placas descartáveis de 48 amostras cada (172 amostras em uma única corrida), porém, devem ser analisadas de 16 em 16 ou os spots remanescentes serão inutilizados (Patel, 2013).
2.1.1. O Princípio da Técnica de MALDI-TOF MS
Na técnica de MALDI-TOF MS, um composto, chamado de matriz, é utilizado para auxiliar na dessorção e isonização das partículas de micro-organismos através da energia do laser. Este se caracteriza por um laser de N2 de comprimento de onda de 336 nm, frequência de 60 Hz e tempo de vida de milhões de disparos. A função da matriz é diluir a amostra e absorver a energia do laser, promovendo assim a suave ionização das suas moléculas (Marvin et al., 2003).
Inúmeras matrizes estão disponíveis, e a escolha da matriz adequada para cada amostra é fundamental para o sucesso da análise (Santos et al., 2010). Estas são compostas de derivados de ácido cinâmico ou benzóico, diluídos em um solvente orgânico e água, ou ainda em ácido trifluoracético. A matriz adequada permite a obtenção de espectros com melhor qualidade, pela ótima razão entre sinal e ruído e picos estreitos, favorecendo a análise final do espectro de massas (Santos et al., 2010).
As partículas de micro-organismos e da matriz, através da incidência do laser, desprendem-se da superfície onde se encontram (Figura 1). A maioria da energia é absorvida pelas moléculas da matriz, convertendo-as para um estado ionizado. Através de colisões aleatórias, na fase gasosa, a carga elétrica é transferida da matriz para as moléculas da amostra. Estas são aceleradas, baseadas na sua relação de massa e carga para um tubo de vácuo, o analizador de massas (TOF; tempo de vôo) (Fenselau & Demirev, 2001). Os íons migram pelo campo elétrico até alcançarem o detector, com velocidades inversamente proporcionais às suas massas. O espectro de massas é gerado, representanto o número de íons que atingem o detector através do tempo. O analisador TOF determina a razão da massa molecular pela carga (m/z) dos íons por meio da mensuração da velocidade destes, após a calibração do instrumento com moléculas de pesos conhecidos (Santos et al., 2010). A separação ocorre pela razão massa/carga, entretanto, a carga é praticamente única, sendo o
peso molecular a variável que efetivamente separa as moléculas (Patel, 2014). Todo este processo ocorre de forma muito rápida, em menos de 1 minuto por amostra.
Figura 1. Espectômetro de massa - MALDI-TOF MS. A placa-alvo é inserida na câmara do espectômetro de massa. Os spots a serem analisados, são individualmente atingidos pelo feixe de laser para dessorção e ionização das moléculas do micro-organismo e da matriz. A nuvem de partículas ionizadas é acelerada em um analisador de massas (TOF), até atingir um detector. As moléculas mais leves voam mais rapidamente, seguidas das de maior peso molecular. Adaptado de Patel (2014).
As proteínas ribossomais são muito abundantes nos micro-organismos e, portanto, constituem os principais componentes de avaliação pelo espectro de massa. Com base no perfil das proteínas ribossomais, que variam de 2 a 20 kDa, que é único para cada espécie de micro- organismo, o espectro de massa obtido é comparado a um banco de espectros de referência como um todo. O micro-organismo com espectro de massa mais relacionado é identificado e a medida da confiança desta análise é indicada por um valor, que difere de um sistema para outro
(Murray, 2010; Emonet et al., 2010). A identificação em espécie e gênero é avaliada com base nestes valores de confiança.
Os principais fatores que influenciam a qualidade da identificação de micro-organismos pela espectrometria de massa são a pureza das cepas a serem identificadas, a quantidade de material biologico disponível para análise e a experiência do microbiologista. A interpretação e validação dos resultados requerem sempre a avaliação de todos os resultados obtidos até aquele momento, como as condições de crescimento do micro-organismo em meios de cultura e as suas características morfológicas e tintoriais. A análise e a expertise do microbiologista são fundamentais para a acurácia do diagóstico etiológico.
O sistema Bruker fornece valores entre 0 e 3,000, baseando-se na presença ou na ausência de picos no espectro de massa e adota critérios para a identificação em espécie e gênero, correspondentes a superior a 2,000 e entre 1,700 e 1,999, respectivamente. Valores inferiores a 1,700 indicam que a identificação do micro-organismo não é confiável. O sistema VITEK MS realiza a identificação baseando-se na similaridade do espectro do micro-organismo testado com aquele de referência no banco de dado, e àquele denominado de superespectro, que representa o espectro de picos conservados derivados de múltiplos isolados de uma espécie ou grupo em particular. O valor atribuído relaciona-se à especificidade destes para a espécie ou gênero em questão. Estes valores de confiança variam de 0 a 100% (Patel, 2014).
2.1.2. A Espectrometria de Massa na Identificação de Micro-organismos
Há exatamente cinco anos, foi publicado o primeiro estudo que avaliou a acurácia da espectrometria de massa pela técnica de MALDI-TOF MS com a finalidade de identificação de isolados bacterianos, aeróbios e anaeróbios, provenientes de amostras clínicas (Seng et al., 2009). Neste estudo, dos 1.660 isolados bacterianos, 95,4% foram identificados corretamente pelo MALDI-TOF MS e demonstraram que a acurácia na identificação bacteriana pela
espectrometria de massa se correlacionou diretamente ao número de espectros de massas daquela espécie incluído no banco de dados.
Diversos estudos se seguiram, demonstrando a utilidade desta metodologia na prática diária dos laboratórios de microbiologia. Entretanto, algumas espécies são muito relacionadas entre si e apresentam um pequeno número de picos que podem ser utilizados para distinguí-las, como Streptococcus pneumoniae do grupo Streptococcus mitis. Neste caso, o sistema VITEK MS (IVD) demonstrou superioridade, pois pelo sistema Biotyper apesar dos isolados de S.
pneumoniae serem identificados corretamente, os isolados de S. mitis/oralis podem ser erroneamente identificados como S. pneumoniae (Martiny et al., 2012). Entretanto, alguns micro- organismos são extremamente relacionados e nenhum dos algoritmos propostos, até o momento, é capaz de diferenciá-los, como E. coli e Shigella spp. (Patel, 2014). Porém, ambos os sistemas apresentam uma nota referente a esta limitação quando estas bactérias são identificadas.
O procedimento para a identificação requer apenas que se transfira a colônia bacteriana, após crescimento em placa de ágar, para o spot da placa de MALDI-TOF MS com a ajuda de um palito ou alça bacteriológica. Adiciona-se 1 µL da matriz, para a identificação bacteriana, utiliza- se, preferencialmente, o ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA) dissolvido em 50% de acetonitrila e 2,5% de ácido trifluoroacético. Em seguida o material é deixado à temperatura ambiente até que o material fique completamente seco. A placa deve ser inserida no equipamento para análise. Com o objetivo de se melhorar a qualidade do espectro obtido, a extração de proteínas pode ser realizada através de um procedimento utilizando-se ácido fórmico e acetonitrila, ou apenas com a adição de 1 µL de ácido fórmico a 70% sobre a colônia do micro-organismo na placa de MALDI-TOF MS, auxiliando a ruptura celular. Entretanto, na rotina laboratorial, este procedimento torna-se trabalhoso. Recomenda-se, então, que para facilitar o fluxo de trabalho, a análise inicial de bactérias e leveduras seja realizada diretamente
da colônia do micro-organismo, com ou sem adição do ácido fórmico e, para aquelas nas quais o resultado obtido não for satisfatório, a extração proteica poderá ser realizada (Patel, 2014).
2.1.2.1. Identificação de Bactérias Aeróbicas
O sistema de MALDI-TOF MS apresenta um excelente desempenho para a identificação de bactérias aeróbicas (Figura 2). Utilizando o sistema da Bruker, Patel (2013) observou 93% e 82% de identificações corretas em gênero e espécie, respectivamente, quando avaliou 440 isolados bacterianos de bacilos Gram-negativos usuais e não-usuais. Estas taxas foram superiores àquelas observadas para os métodos de identificação convencionais (Patel, 2013).
No mesmo estudo, Patel avaliou 217 isolados de cocos Gram positivos encontrando 98% de identificação correta para o gênero e 79% para espécie. As maiores dificuldades relatadas estão na diferenciação de espécies de Streptococcus, especialmente S. pneumoniae, grupo S. mitis e grupo S. viridans, como dito anteriormente (Martiny et al., 2012; McElvania Tekippe et al., 2013).
Lau e colaboradores (2014) obtiveram 75% de identificação correta em gênero para 67 micro-organismos de difícil identificação, como Granulicatella adiacens, Micrococcus luteus, Nocardia spp., Pantoea dispersa, Actinomyces spp., entre outros (Lau et al., 2014). Alatoom e colaboradores (2012) mostraram que os bacilos Gram positivos também poderiam ser identifcados por esta metodologia, já que observaram 85% de concordância em gênero ao avaliarem 190 isolados (Alatoom et al., 2012). Entretanto, a identificação de bacilos Gram positivos, geralmente, apresenta taxas de concordância inferiores àquelas apresentadas para cocos Gram positivos e bacilos Gram-negativos. Bizzini e colaboradores (2010) observaram uma concordância de 88,6% para os 1 371 micro-organismos testados, sendo que quando estratificados mostrou 92,2% de resultados corretos para bacilos Gram-negativos, 99,2% para cocos Gram positivos, porém, apenas 84,6% para bacilos Gram positivos (Bizzini et al., 2010).
Figura 2. Espectro de massa gerado pelo MALDI-TOF MS para as diferentes espécies bacterianas. Adapatado de Liu e colaboradores (2007).
Os estudos que avaliaram o sistema VITEK MS obtiveram resultados semelhantes, incluindo bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e fastidiosas (91-97% de identificação em gênero e 78% a 96% em espécie). No estudo de Richter e colaboradores (2013), este sistema identificou corretamente 97% e 84% das enterobactérias testadas em gênero e espécie, respectivamente (Richter et al., 2013). Martiny e colaboradores (2012) avaliaram o desempenho dos dois sistemas e respectivos bancos de dados. Estes apresentaram resultados bastante similares (93%) para a identificação de bactérias usualmente encontradas na rotina laboratorial, exceto quando o banco de dados Saramis foi utilizado (83,8%) (Martiny et al., 2012). Em nossa experiência, o sistema VITEK MS apresentou 98% e 92% de concordância em gênero e
espécies, quando 119 isolados bacterianos comumente encontrados no laboratório de microbiologia foram avaliados, diretamente da colônica bacteriana. Dentre estes a concordância em gênero e espécie foi de 97% e 86% para os 59 cocos Gram positivos, e de 100% e 98%, respectivamente, para 60 bacilos Gram-negativos (dados não publicados).
2.1.2.2. Identificação de Bactérias Anaeróbicas
A espectrometria de massa tornou-se o método de escolha para a identificação de bactérias anaeróbicas. Barreau e colaboradores (2013) avaliaram uma coleção de 1 325 bactérias anaeróbicas e alcançaram 100% e 93% de correta identificação direto da colônia em gênero e espécie, respectivamente, utilizando o sistema Biotyper (v. 3.0) (Barreau et al., 2013).
Jamal e colaboradores (2013b) reportaram 89% e 100% de identificação entre 274 bactérias anaeróbicas usando os sistemas Biotyper e VITEK MS, respectivamente (Jamal et al., 2013b).
2.1.2.3. Identificação de Micobactérias
A identificação de micobactéria é um grande desafio para o laboratório de microbiologia, e apesar de algumas limitações, o MALDI-TOF MS é uma técnica mais rápida, de menor custo, e mais fácil que as técnicas atualmente empregadas (testes bioquímicos e moleculares). As espécies de micobactérias exigem, além da inativação prévia, um procedimento de extração mais elaborado. A inativação pode ser realizada com o calor ou com exposição ao etanol, seguida de um processo de ruptura mecânica, com auxílio de pérolas de vidro, e extração proteica com ácido fórmico e acetonitrila, uma vez que sua parede é constituida por uma camada de ácidos graxos que impede sua ruptura apenas com a incidência do laser (Balada-Llasat et al., 2013; Dunne et al., 2014). Em seu estudo, Balada-Llasat e colaboradores (2013) testaram 178 isolados de micobactérias, cultivados em meios sólido e líquido, utilizando-se o calor para inativação, seguido de tratamento com etanol e lise mecânica, como recomendado pela Bruker.
Os autores observaram 98% e 94% de correta identificação em gênero e espécie, respectivamente (Balada-Llasat et al., 2013). Dunne e colaboradores (2014) demonstraram boa efetividade na inativação de isolados de Mycobacterium spp. utilizando a lise mecânica por cinco minutos na presença de etanol 70%, seguida de um período adicional de inativação por dez minutos (Dunne et al., 2014). Da mesma forma, Mather e colaboradores (2014) avaliaram 198 isolados clínicos utilizaram a lise mecânica com auxílio do vórtex e pérolas de silica na presença de etanol para inativação das amostras. Com o aprimoramento do banco de dados do sistema Biotyper (v. 2.0) com 123 espectros de cepas clínicas, foi observada uma concordância de 95% das espécies de Mycobacterium por este sistema e 94% utilizando-se o sistema VITEK MS (Saramis) (Mather et al., 2014). Os bancos de dados dos sistemas VITEK MS e Biotyper têm sido atualizados principalmente com o aumento no número e variedade de espectros de micobactérias, o que deve melhorar o desempenho desta metodologia no futuro. A condição e tempo de crescimento das colônias de micobactérias também podem influenciar a qualidade dos espectros obtidos. Lotz e colaboradores (2010) observaram que quando cultivada em meio sólido (Löwenstein-Jensen), o extrato proteico obtido apresentava qualidade supeiror no espectro de massas do que quando as amostras eram cultivadas em meio líquido, consequentemente a identificação correta foi obtida para 97% e 77% dos isolados cultivados em meio sólido e líquido, respectivamente (Lotz et al., 2010).
2.1.2.4. Identificação de Fungos
A identificação de leveduras pelo MALDI-TOF MS apresenta bons resultados, sendo uma ótima alternativa aos métodos manuais, trabalhosos e demorados ou aos métodos automatizados e painéis comerciais, que são mais honerosos. Entretanto, há diferenças de desempenho quando avaliamos os sistemas disponíveis. O sistema VITEK MS apresenta excelentes resultados (97-95%), apenas com a transferência da colônia associada ao ácido
