Devido às muitas ligações de hidrogénio formadas entre as bases de duas cadeias de ADN emparelhadas (Figs. 2.3 e 2.4), a hélice dupla é uma estrutura notavelmente estável. Além disso, se as ligações de hidrogénio que mantém a hélice se quebrarem devido a aquecimento ou a contacto com compostos químicos (desnaturação), a hélice tem capacidade de se refazer quando as condições se tornarem de novo favoráveis. Esta capacidade de a hélice de ADN se refazer, ou renaturar, é a base da hibridização molecular. Na hibridização molecular, uma sequência de ADN ou de ARN marcada (com radioatividade ou fluorescência) é usada como uma sonda para identificar ou quantificar as cadeias complementares correspondentes presentes numa amostra. Nos anos 1960, os investigadores Joseph Gall e Mary Lou Pardue (1969) verificaram que a hibridização molecular podia ser usada para identificar a posição de sequências de ADN in situ (isto é, nas suas posições naturais nos cromossomas). Os dois cientistas demonstraram que cópias radioativas de uma sequência de ARN ribossomal (ARN dos ribossomas) podiam ser usadas para detetar sequências complementares de ADN no núcleo de um ovo de rã. Pouco tempo depois, as sondas radioativas foram substituídas por sondas fluorescentes e, hoje em dia, a
19 maior parte dos trabalhos de hibridização in situ é feita utilizando sondas com fluorescência. Neste contexto, e numa aceção muito simplificada, entende-se fluorescência como sendo a capacidade de emitir luz. A deteção de uma sequência de ADN pode ser comparada à procura de uma agulha num palheiro, em que a agulha é a sequência de ADN a procurar e a palha é um conjunto numeroso de cromossomas. Esta procura é facilitada se o investigador tiver um íman poderoso – neste caso, uma sequência complementar da sequência de ADN que interessa (sequência alvo). A hibridização ocorre quando o íman encontra a agulha, ou seja quando a sonda, composta por uma dada sequência de bases, se liga à sequência que lhe é complementar. Para que isso suceda, é necessário conhecer a sequência alvo que se pretende detetar na amostra e depois construir uma sonda com uma sequência de bases complementar, como se pode ver na Figura 2.5. 6 6 http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327 Fluorófuro Fluorófuro Hapteno Hapteno Alvo Alvo Sonda Sonda
Figura 2.5 – Técnica de FISH, ver texto para explicação (adaptado de Scitable by Nature Education6).
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Na Figura 2.5, a sequência de ADN da sonda está representada a vermelho (a - imagem da esquerda). Os cromossomas da sequência de ADN de interesse, ou sequência alvo, estão representados a azul (a - imagem da direita). As ligações de hidrogénio que ligam as bases das duas cadeias da hélice de ADN estão representadas por linhas negras.
O primeiro passo do processo é a produção de uma sonda fluorescente (Fig. 2.5, imagens do centro) ou à qual se possa adicionar fluorescência num passo posterior (Figura 2.5, imagens da esquerda). A seguir, antes de ocorrer a hibridização, tanto a sonda como a sequência alvo devem sofrer um processo de desnaturação por ação do calor ou de agentes químicos. A desnaturação é a separação da hélice dupla de ADN nas suas duas cadeias complementares (semelhante à abertura de um fecho éclair), Figura 2.5c. Este passo de desnaturação é necessário para que se possam formar novas ligações de hidrogénio entre a sonda e o alvo durante o passo de hibridização subsequente. As sequências alvo e as sondas são então misturadas (Figura 2.5d) e as sondas hibridizam especificamente com as sequências complementares (alvo). Se a sonda já for fluorescente (Figura 2.5, imagens do centro) será possível detetar o local de hibridização diretamente. Caso a sonda não seja fluorescente, é necessário um passo adicional para conferir fluorescência à sonda (Figura 2.5, imagens da esquerda). Devido à fluorescência das sondas, os híbridos formados entre as sondas e as sequências alvo podem ser detetados usando um microscópio de fluorescência.
Em Engenharia do Ambiente, a técnica de FISH constitui uma abordagem revolucionária que permite aos investigadores a identificação e quantificação rápida de microrganismos presentes numa amostra ambiental. A identificação de microrganismos com o método FISH pode ser realizada devido à disponibilidade de sondas moleculares contendo uma sequência de material genético (ADN ou ARN) complementar à sequência de ADN (ou ARN) de interesse. Na análise, as sequências das sondas ligam-se às correspondentes sequências de material genético dos microrganismos que se pretende detetar. Devido à molécula fluorescente (fluorocromo) ligada à sonda, os microrganismos tornam-se visíveis
21 ao microscópio, permitindo a sua identificação e quantificação (Domanska et al., 2014). Hoje em dia, o processo está consideravelmente simplificado, pois o utilizador apenas necessita de submeter a sequência complementar a uma empresa comercial e recebe a sonda em poucos dias. As sondas marcadas com fluorescência são transferidas para as células onde se ligam às sequências complementares, se estas estiverem presentes. A observação da amostra num microscópio de fluorescência permite visualizar as sondas e assim detetar os microrganismos de interesse.
Um protocolo laboratorial de FISH consiste em cinco fases principais (Ormeci e Linden, 2008): preparação da amostra, fixação, imobilização, hibridização e observação em microscópio de fluorescência. A fixação aumenta a permeabilidade da célula, de forma a permitir a penetração da sonda e protege a célula de lise durante a hibridização. Durante a imobilização, tipicamente, as células são aplicadas em lâminas de microscopia e desidratadas com uma série de soluções de etanol. O passo de hibridização envolve a penetração da sonda na célula e a ligação específica do oligonucleótido marcado às sequências complementares do ácido nucleico existente na amostra. Finalmente, a sonda ligada por hibridização é visualizada num microscópio de fluorescência (Ormeci e Linden, 2008).
A revisão de Swiger e Tucker (1996) apresenta os conceitos básicos relacionados com a metodologia FISH. Os trabalhos de Levsky e Singer (2003), Lakatosova e Holeckova (2007) e de Volpi e Bridger (2008) dão uma perspetiva da evolução da metodologia FISH para a identificação de sequências nucleotídicas nas suas mais diversas aplicações.
A Hibridização in situ de Fluorescência é um método expedito de detetar células individuais em amostras limpas. No entanto, a aplicação de FISH a amostras de águas residuais ou de lamas biológicas apresenta um conjunto de problemas específicos. Estas amostras geram uma elevada fluorescência de fundo devido ao seu teor orgânico e inorgânico e pode ser difícil diferenciar o sinal da sonda do sinal de partículas fluorescentes existentes na amostra. Além disso, alguns dos passos da técnica de FISH envolvem um tratamento agressivo das amostras e podem romper os flocos biológicos e alterar a associação entre partículas e
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microrganismos. Por estas razões, os protocolos FISH desenvolvidos para culturas de células puras podem não ser adequados em matrizes aquosas mais complexas, justificando-se a adaptação de protocolos para utilização específica com amostras de lamas de ETAR (Ormeci e Linden, 2008).
Capítulo 3
A tradução científica e técnica
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3A tradução científica e técnica