3.3.1 Composi¸c˜ao elementar e isot´opica
Depois de secos e macerados, os sedimentos superficiais e o MPS-g, foram pesados em c´apsulas de prata e descarbonatados com 100 µl de HCl 1N. As amostras de solo e fra- mentos vegetais, foram pesados em c´apsula de estanho. As amostras foram encaminhadas ao Centro de Energia Nuclear na Agricultura da Universidade de S˜ao Paulo (CENA-USP) onde com analisador elementar Perkin-Elmer 2400 acoplado ao espectrˆometro de massa Finigan Delta Plus, foram realizadas as an´alises da composi¸c˜ao elementar (porcentagem de carbono e nitrogˆenio) e isot´opica (δ13C e δ15N). A precis˜ao anal´ıtca para o carbono
foi de 0,01% e 0,005% para o nitrogˆenio. Os valores dos is´otopos foram calculados em fun¸c˜ao dos seus respectivos padr˜oes, seguindo a equa¸c˜ao descrita na subse¸c˜ao 2.3.1. O
padr˜ao utilizado para o carbono foi o PDB (Pee Dee Belemnite) e para o nitrogˆenio foi o N2 atmosf´erico.
3.3.2 Produtos da oxida¸c˜ao alcalina com CuO
Esta an´alise foi baseada na metodologia publicada por (HEDGES; ERTEL, 1982) e (GO ˜NI; HEDGES, 1995). Este m´etodo extrai de uma determinada amostra os fen´ois
tipicamente oriundos da quebra da lignina e compostos que n˜ao s˜ao provenientes exclu- sivamente desta mol´ecula, como o ´acido 3,5 di-hidroxibenz´oico (3,5 Bd) e os fen´ois do grupo p-hidroxi (Tabela 2).
A an´alise ´e iniciada pesando-se uma quantidade de amostra que contenha no m´aximo 5 mg de carbono orgˆanico em uma c´apsula de a¸co inoxid´avel (mini-bomba; vo- lume 3 ml). `A amostra s˜ao adicionados 300 mg de CuO e 30 mg de Fe(NH4)2(SO4)∗6H2O
em meio alcalino, para tanto usa-se NaOH 8% (livre de O2). As mini-bombas s˜ao coloca-
das em um purgador com fluxo de N2 durante duas horas para que se crie uma atmosfera
an´oxica para s´o ent˜ao serem fechadas. Posteriormente, elas s˜ao levadas ao forno de um cromat´ografo HP5890, `a 155◦
C por 3 horas, adaptado com um carrossel, acoplado a um motor el´etrico, na parte interna da porta para que durante a oxida¸c˜ao as amostras sejam homogeneizadas.
Depois do processo de oxida¸c˜ao, as amostras s˜ao transferidas para tubos de en- saio e quantidades conhecidas dos padr˜oes internos etilvanilina e ´acido trans-cinˆamico (eVl e Cnd, respectivamente) s˜ao adicionados para o posterior c´alculo da recupera¸c˜ao do processo de extra¸c˜ao. As amostras s˜ao acidificadas a pH 1, com ´acido clor´ıdrico 37 %, para precipita¸c˜ao dos ´acidos h´umicos. Os produtos da oxida¸c˜ao alcalina com CuO s˜ao extra´ıdos da solu¸c˜ao ´acida atrav´es da adi¸c˜ao de 6 ml (3 x 2 ml) de acetato de etila. Depois de serem homogeneizadas e centrifugadas, as amostras apresentam duas fases bem defini- das. A fase superior ´e transferida para tubos de ensaio e passada em colunas feitas com pipetas pasteurs (23 cm de altura e 0,5 cm de diˆametro) contendo sulfato de s´odio para retirar ´agua remanescente da extra¸c˜ao. Durante esse processo, as amostras s˜ao recolhidas e secas, sob fluxo de N2, em vials de 1,8 ml. Para conserva¸c˜ao e posterior inje¸c˜ao no
cromat´ografo, as amostras s˜ao re-dissolvidas em 200 µl de piridina.
Materiais de referˆencia (MR), amostras com valores previamente determinados, neste caso os fen´ois da lignina, foram utilizados como controle de qualidade desta an´alise.
Os MRs utilizados neste trabalho foram cedidos pelo Professor Carlos Eduardo Rezende da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) que validou esses MRs atrav´es da an´alise conjunta com o sedimento do Lago Washington (EUA) (comunica¸c˜ao pessoal). Esta amostra tem sido usada por alguns pesquisadores para calibrar an´alises dos produtos de oxida¸c˜ao da lignina em sedimentos e plantas (OPSAHL; BENNER, 1995); (LOBO; MO- ZETO; CASS, 2000); (GO ˜NI; MONTGOMERY, 2000). Os valores dos MR obtidos pela UENF e os valores obtidos pela UFF est˜ao apresentados na Tabela 5. Considerando as diferen¸cas entre as metodologias empregadas nas duas universidades, admite-se que resultados para os MRs obtidos na UFF que ficaram entre a m´edia mais ou menos um desvio padr˜ao, em rela¸c˜ao aos resultados obtidos na UENF, s˜ao aceit´aveis.
Tabela 5 - Valores em µg/100mgCO dos Materiais de Referˆencia UENF - UFF
Cana Pasto Lama Manguezal
n = 7 n = 9 n = 9 n = 9 UENF (m´edia) 963,32 2702,89 2289,33 7183,49 Desvio Padr˜ao (DP) 224,85 456,27 752,74 1176,93 M´edia +1DP 1188,17 3159,16 3042,07 8360,42 M´edia -1DP 738,47 2246,63 1536,59 6006,55 UFF (m´edia; n = 2) 812,01 2273,39 2587,50 6244,52
As amostras de sedimentos, solos e MRs foram analisados em duplicata. Os vege- tais e os MPS-g foram analisados sem r´eplicas em fun¸c˜ao do pouco material coletado. Caso os MRs de cada lote de amostra (n=12) n˜ao ficassem dentro dos valores pr´e-estabelecidos, todo lote seria repetido. Adotou-se tamb´em como crit´erio de qualidade que amostras com valores de recupera¸c˜ao inferiores a 50% e maiores que 110% seriam repetidas. As recu- pera¸c˜oes obtidas para a eVl ficaram entre 54 e 105%, com uma m´edia de 78%; e para o Cnd entre 54 e 107%, e m´edia de 80%.
Para a determina¸c˜ao dos tempos de reten¸c˜ao dos fen´ois de interesse, solu¸c˜oes para cada composto foram feitas com padr˜oes artificiais e injetadas isoladamente em cromato- grafia gasosa com detector de ioniza¸c˜ao de chama (Agilent 6890N / CG-DIC). A coluna utilizada foi a DB-5 MS (J&W Scientific) de 30 m de comprimento, 0,32 mm de diˆamentro interno e 25 µm de espessura do filme. O g´as carreador utilizado foi o hidrogˆenio, a tem- peratura do injetor e do detector foram ajustadas para 270◦
C e 320 ◦
C, respectivamente. A derivatiza¸c˜ao foi feita imediatamente antes da inje¸c˜ao com a adi¸c˜ao de 50 µl de BSTFA (N, O- bistrimetilsililtrifluoracetamida) em 50 µl de padr˜ao, ou amostra, e aquecidas em forno a 60 ◦
modo com divis˜ao a uma taxa de 1:10. A rampa de temperatura usada ´e apresentada na Tabela 6 e o tempo total de corrida ´e de 73,33 minutos.
Tabela 6 - Rampa de temperatura da CG-DIC para identifica¸c˜ao dos produtos da oxida¸c˜ao alcalina com CuO.
Taxa temperatura Temperatura Mant´em por
(◦ C/min) (◦ C) (min) - 100 - 1,5 160 - 5,0 220 - 3,0 230 - 5,0 300 3,0 P´os-corrida 300 1,0
Para quantifica¸c˜ao dos compostos, solu¸c˜oes com diferentes concentra¸c˜oes (1 a 100 µl), foram preparadas e injetadas para determina¸c˜ao das curvas de calibra¸c˜ao de cada fenol. Os pontos foram ajustados atrav´es de regress˜ao linear com coeficiente linear nulo. Os coeficientes angulares, as ´areas dos padr˜oes internos e dos fen´ois de interesse das amostras foram colocados em um programa desenvolvido em Visual Basic (LIGCALC vers˜ao 1.0) para o c´alculo das concentra¸c˜oes dos fen´ois e percentual de recupera¸c˜ao.
3.3.3 Lip´ıdios: Ester´ois
Esta an´alise foi adaptada da metodologia publicada por (WAKEHAM; CANUEL,
1988). Na primeira parte da an´alise uma massa de amostra, seca e macerada, entre 2 e 8 g (massa dependente da porcentagem de carbono orgˆanico da amostra) ´e pesada em frascos de vidro (40 ml) calcinados. `A essa amostra, ´e adicionado 25 µl do padr˜ao interno androstanol (1 mg/ml) para posterior c´alculo da recupera¸c˜ao. Os lip´ıdios totais s˜ao extra´ıdos da amostra atrav´es da adi¸c˜ao sequencial de 10 ml dos seguintes solventes: diclorometano (DCM), DCM:metanol (v:v) e metanol, sendo este ´ultimo adiconado `a amostra duas vezes. Em cada sequˆencia de solventes adicionados, a amostra ´e levada a banho-maria com ultrassom durante 15 minutos. Os sobrenadantes s˜ao separados em tubos de ensaio de 10 ml e centrifugados. Essas fra¸c˜oes s˜ao combinadas e colocadas em um bal˜ao p´oprio para serem concentradas em evaporador rotativo a v´acuo (Marconi - MA 120 com condensador diagonal) at´e que reste aproximadamente 1 ml da amostra. S˜ao adicionados mais 2 ml de heptano para recuperar o restante da amostra presente no bal˜ao. Ap´os este procedimento, a amostra ´e tranferida para um vial de 1,8 ml e seca sob
fluxo de nitrogˆenio.
Na segunda parte da an´alise, os lipidios totais s˜ao fracionados para obten¸c˜ao dos ester´ois. A amostra ´e re-elu´ıda com 1 ml de heptano, sendo apenas utilizado 0,5 ml para o fracionamento. A amostra re-elu´ıda ´e transferida para o topo de uma micro-coluna feita em pipeta pasteur (23 cm de altura e 0,5 cm de diˆametro) preenchidas com s´ılica gel (calcinada, ativada a 120 ◦
C/24h e desativada com 5% de ´agua destilada) em heptano. Em seguida, diferentes solventes s˜ao passados na micro-coluna para separa¸c˜ao das fra¸c˜oes dos lip´ıdios, conforme a Tabela 7. As amostras de sedimentos e solos foram analisados em duplicata. Os vegetais e os MPS-g foram analisados sem r´eplicas em fun¸c˜ao do pouco material coletado.
Tabela 7 - Lip´ıdios obtidos na fase do fracionamento das amostras.
Fra¸c˜ao Solvente Volume (ml) Compostos
F1 Heptano 2,5 n-alcanos
F2 Heptano + Tolueno 50% 2,5 Alcools e Graxas´
F3 Heptano + Acetato de Etila 10% 2,0 Cetonas e Alquenonas
F4 Heptano + Acetato de Etila 20% 3,5 Ester´ois
F5 Acetato de Etila 3,0 HPA´s
Das fra¸c˜oes coletadas somente a F4 foi utilizada neste trabalho. Os ester´ois iden- tificados neste trabalho s˜ao descritos na Tabela 3. Para a determina¸c˜ao dos tempos de reten¸c˜ao e consequente identifica¸c˜ao dos compostos de interesse, solu¸c˜oes para cada composto foram feitas com padr˜oes artificiais Sigma-Aldrich e injetadas isoladamente em cromatografia gasosa com detector de ioniza¸c˜ao de chama (Agilent 6890N / CG-DIC). A coluna utilizada foi a DB-5 MS (J&W Scientific) de 30 m de comprimento, 0,32 mm de diˆamentro interno e 25 µm de espessura do filme. O g´as carreador utilizado foi o hidrogˆenio, a temperatura do injetor e do detector foram ajustadas para 280◦
C e 300◦
C, respectivamente. A derivatiza¸c˜ao foi feita com a adi¸c˜ao de 25 µl de BSTFA em 25 µl de heptano para re-elui¸c˜ao da amostra, estas foram aquecidas em forno a 70 ◦
C durante 60 minutos. A inje¸c˜ao de 2 µl de amostra foi feita no modo com divis˜ao a uma taxa de 1:25. A rampa de temperatura usada ´e apresentada na Tabela 8 e o tempo total de corrida ´e de 40,5 minutos. Para quantifica¸c˜ao dos compostos, solu¸c˜oes com diferentes concentra¸c˜oes (10 a 100 µl) do padr˜ao artificial 5α-colestano, foram preparadas e injetadas para deter- mina¸c˜ao da curva de calibra¸c˜ao. Os pontos foram ajustados atrav´es de regress˜ao linear admitindo-se coeficiente linear nulo.
Tabela 8 - Rampa de temperatura da CG-DIC para identifica¸c˜ao dos ester´ois.
Taxa temperatura Temperatura
(◦ C/min) (◦ C) 10,0 215 5,0 250 2,0 280 10,0 320