Análise bioinformática e validação das mutações

A análise dos dados gerados foi realizada da seguinte forma: o software BWA-MEM 0.7.5a (Li, 2013) foi utilizado para alinhamento dos reads com a sequência do genoma de referência humano (NCBI37/hg19); FreeBayes 9.9.13 para variant calling; e GATK Variant Annotator (McKenna et al., 2010), Ensembl Variant Effect Predictor (McLaren et al., 2010. <http://www.ensembl.org/Tools/VEP>) e wANNOVAR (Wang et al., 2010. <http://wannovar.usc.edu>) para anotação das variantes.

As variantes foram primeiramente filtradas com base na frequência alélica, de modo que aquelas com frequências alélicas (MAF, do inglês minor allele frequencies) > 0,01 foram excluídas, com a finalidade de selecionar apenas alterações raras e potencialmente patogênicas. Somente as variantes candidatas com maior probabilidade de causarem doença foram investigadas mais detalhadamente.

A nomenclatura das mutações foi checada utilizando o programa Mutalyzer 2.0.5 (Wildeman et al., 2008. <http://mutalyzer.nl>). Informações disponíveis em distintas bases de

dados, como NCBI dbSNP138 (Sherry et al., 2001.

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP>), Ensembl (Cunningham et al., 2015. <http://www.ensembl.org>), 1000 Genomes Project (<http://www.1000genomes.org>), Exome Variant Server (<http://evs.gs.washington.edu/EVS>), HGMD (Stenson et al., 2003. <http://www.hgmd.cf.ac.uk>) e Deafness Variation Database (Shearer et al., 2014. <http://deafnessvariationdatabase.org>), foram comparadas para verificar se as variantes já estavam descritas na literatura em associação à surdez, e para excluir alterações genéticas previamente descritas como benignas.

No caso de mutações novas, foi analisado o possível efeito patogênico das alterações na proteína, empregando as ferramentas de predição in silico SIFT (Ng & Henikoff 2001. <http://sift.bii.a-star.edu.sg>), PolyPhen-2 (Adzhubei et al., 2010. <http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2>) e Mutation Taster (Schwarz et al., 2010. <htttp://www.mutationtaster.org>). O grau de conservação evolutiva dos resíduos afetados pelas mutações foi verificado utilizando a ferramenta PhyloP (Pollard et al., 2010. <http://compgen.cshl.edu/phast>) e o programa ConSurf (Ashkenazy et al., 2010; Celniker et al., 2013. <http://consurf.tau.ac.il>).

As mutações apontadas como possível causa da perda auditiva nos pacientes foram confirmadas por sequenciamento convencional (método Sanger), de acordo com os procedimentos descritos previamente (Item 2.2.1 dos Métodos), assim como foi verificada a segregação das mutações com o fenótipo clínico nas famílias. A Tabela 24 mostra os primers utilizados para a confirmação das variantes candidatas e verificação da segregação nas famílias.

Tabela 24. Sequência dos primers utilizados, temperatura de anelamento e tamanho dos fragmentos gerados para confirmação das variantes candidatas e verificação da segregação nas famílias. Em destaque estão as variantes que não foram validadas pelo sequenciamento Sanger (a), consideradas não patogênicas após estudos detalhados (b) ou para as quais o fenótipo do paciente não estava de acordo com a perda auditiva típica para mutações naquele gene (c).

Indiv Gene Mutação Sequência 5’  3’ Tempera-

tura Tamanho fragmento 1 CDH23 p.L627Rfs*10 17F- AGCCATAACTTCTCTGCCCAAA 63°C 329 pb 17R- CAGGGACAGCCAAGGAGGT 1 CDH23 p.D990N 25F- TGGAGACGCTGCTCTGGA 63°C 367 pb 25R- TCACCTGCCCCCACCTAGT 2 MYO15A p.R827S a 2F- GGAGGCGAGCTTGGTCAC 60°C 365 pb 2R- CACTTGCGGCTTCACAGC 2 MYO15A p.R1763W b 20F- GACCCTGCCTGTCTGTTTTC 60°C 249 pb 20R- GGTCATGAGGTGGGTTAAGG 2 MYO15A p.S3525G b 66F- TCTGTACTTCCCACCCAAG 60°C 228 pb 66R- TGAGGCCACACAGTGAGTCT

3 OTOF p.I1573T 39F- CTCCCACCCTAGCCAATCCTTA 63°C 273 pb

39R- TGGAGGCAAAGCAGGCACACT

7 CDH23 p.E2520K 53F- TGCCTGTCCTTCCTCTATCCA 63°C 726 pb

53R- AGCCAAGTTTCCCCACCTTTA

7 CDH23 p.A2637P 55F- GGGAGGAGAGAAGAGGGACA 64°C 521 pb

55R- GGGATTGGCTTGGGGAC

8 DFNA5 c.991-2A>G 8F-GTAGAGAAGAGCTGCGGGTCGTAC 63°C 409 pb 8R-GTGTCCCCAGAAGCATAGATAGTA

13 ACTG1 p.K118M 3F- GCGGGGTGGGTTCGGTGTC 60°C 352 pb

3R- AAGCCGGGCAGAAAATGACTG

14 PRPS1 p.I140S 4F- GCCTTCCCATCAGTTTGAAT 62°C 250 pb

4R- ACCTCTTAGCTCCACCAGCA

15 COCH p.I437S 11F- CTTATGATCAGCGCACGGAG 58°C 175 pb

11R- AGGAAGTTCTTGTTGGGGCT

16 DIAPH1 p.A1210Sfs*31 c 27F- CTGTGGGAGAGGGGAAATCA 60°C 235 pb 27R- CCTTCGACACCCAGGATGAG

17 OTOF p.W718X 19F- TCCTCCACTCCACCAATGC 55°C 308 pb

19R- CCTCTGACAGCGCCGTCT

17 OTOF p.D1709Efs*54 42F- TTAGGAGGGAGAGGAGAGC 55°C 286 pb

42R- AGGGATGCCAACTGGCCAA

18 COL11A2 c.799-2A>C a 7F- CTCCTGACCCTCAACCTCTC 60°C 235 pb

7R- GGTTGTCCCCGTAGTCATCA

19 CRYM p.G227X 8F- GTTCACCTCTCTCCTGTGCT 62°C 159 pb

No caso de mutações novas, as mesmas foram ainda rastreadas no grupo controle, composto por 130 indivíduos brasileiros não relacionados, sem perda auditiva. O rastreamento dessas alterações foi realizado mediante análise de restrição enzimática. Foram investigadas somente as variantes patogênicas que foram confirmadas por sequenciamento Sanger e/ou para as quais foi confirmada a segregação nas famílias. A Tabela 25 mostra as enzimas utilizadas para a triagem das mutações novas no grupo controle.

Tabela 25. Enzimas utilizadas para o rastreamento no grupo controle das mutações não descritas na literatura.

Indivíduo Gene Mutação Enzima

1 CDH23 p.L627Rfs*10 EcoRII

14 PRPS1 p.I140S EcoRV

15 COCH p.I437S FokI

17 OTOF p.D1709Efs*54 AflIII

19 CRYM p.G227X MmEI

Para as mutações p.E2520K e p.A2637P no gene CDH23 (indivíduo 7) não foi possível realizar ensaios com enzimas de restrição. Dessa forma, foi empregada a análise de heteroduplex de DNA em dHPLC, utilizando o sistema de dHPLC Wave® System (Transgenomic, Omaha, Estados Unidos). O fundamento da técnica consiste em detectar mutações mediante a formação de heteroduplex de um determinado fragmento de DNA. O produto da PCR sofre aquecimento a 95°C, o que permite a desnaturação da dupla fita de DNA, seguido de uma lenta redução da temperatura, levando à renaturação gradativa e formação de homoduplex (fragmentos de DNA com as duas fitas pareadas) e heteroduplex (união incorreta de uma fita normal e outra com mutação). Posteriormente, os fragmentos de DNA passam por uma coluna de cromatografia líquida de fase reversa, chamada cromatografia líquida desnaturante de alta performance (dHPLC – do inglês denaturing high- performance liquid chromatography). As heteorduplex, por apresentarem menor força de ligação, eluem na coluna antes que as homoduplex. Por meio de um detector de raios ultravioleta se mede a absorbância obtida dos fragmentos de DNA liberados e os resultados são enviados ao Navigator Software (Transgenomic, Omaha, Estados Unidos) no computador. Então é gerado um cromatograma, que permite a análise e detecção de mutações.

As mutações p.R1763W e p.S3525G no gene MYO15A (indivíduo 2), que apresentavam significado clínico não esclarecido, também foram triadas no grupo controle mediante análise de heteroduplex de DNA em dHPLC, já que não foi possível realizar ensaios com enzimas de restrição.

A Figura 11 resume de forma esquemática como foi realizado o processo de análise dos dados e de seleção e confirmação das variantes encontradas após a realização do sequenciamento de nova geração (NGS).

Figura 11. Fluxograma das etapas empregadas na análise dos dados obtidos após o sequenciamento de nova geração (NGS), evidenciando os critérios empregados na seleção e confirmação das variantes candidatas.

MAF: minor allele frequency.