UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PRISCILA ZONZINI RAMOS
ESTUDO GENÉTICO DE PERDAS AUDITIVAS
HEREDITÁRIAS MEDIANTE NOVAS TECNOLOGIAS
BASEADAS EM ARRAY-CGH E
NEXT-GENERATION SEQUENCING
CAMPINAS 2016
PRISCILA ZONZINI RAMOS
ESTUDO GENÉTICO DE PERDAS AUDITIVAS
HEREDITÁRIAS MEDIANTE NOVAS TECNOLOGIAS
BASEADAS EM ARRAY-CGH E
NEXT-GENERATION SEQUENCING
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Genética e Biologia Molecular, na Área de Genética Animal e Evolução.
Orientadora: Profª. Drª. Edi Lúcia Sartorato
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA PRISCILA ZONZINI RAMOS, E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. EDI LÚCIA SARTORATO
CAMPINAS 2016
Campinas, 01 de abril de 2016.
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Edi Lúcia Sartorato (Orientadora)
Profª. Drª. Cláudia Vianna Maurer Morelli
Profª. Drª. Carmen Sílvia Bertuzzo
Profª. Drª. Camila Andréa de Oliveira
Prof. Dr. Victor Evangelista de Faria Ferraz
A ATA DA DEFESA COM AS RESPECTIVAS ASSINATURAS DOS MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA ENCONTRA-SE NO PROCESSO DE VIDA ACADÊMICA DA ALUNA.
À minha família tão querida.
Por compartilharem dos meus
sonhos, conquistas e alegrias.
AGRADECIMENTOS
À Professora Drª. Edi Lúcia Sartorato pela oportunidade, orientação, apoio, incentivo, confiança e aprendizado.
Al Dr. Miguel Ángel Moreno Pelayo por me aceptar en su laboratorio y permitir un gran aprendizado.
Aos Professores Dr. José Andrés Yunes, Dr. Lúcio Fábio Caldas Ferraz e Drª. Mônica Barbosa de Melo pela contribuição no exame de qualificação.
Às Professoras Drª. Carmen Sílvia Bertuzzo e Drª. Maricilda Palandi de Mello por terem aceitado participar da banca prévia para avaliação da tese, contribuindo para a melhoria deste trabalho.
Aos Professores Dr. Victor Evangelista de Faria Ferraz, Drª. Cláudia Vianna Maurer Morelli, Drª. Carmen Sílvia Bertuzzo e Drª. Camila Andréa de Oliveira por terem aceitado gentilmente participar como membros da banca examinadora de defesa da tese, contribuindo para a finalização da mesma.
A todos os colegas que estão ou que passaram pelo Laboratório de Genética Molecular Humana, do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), da UNICAMP e que de alguma forma contribuíram, ajudaram, incentivaram e me ensinaram – Sueli, Vanessa, Paulo, Carol PR, Fábio, Nathy Zocal, Lilian, Rogério, Erika, Jhonathan, Nathy Gaviolli, Mariane, Diego, Carol Conti, Flávia Elfo, Alessandra, Priscila Jacob, Nadya, Giselle, Ju Pitante, Guilherme, Katia, Mara, Ana Letícia, Carol Crivelin, Daiane, Zélo, Taci, Fer Soardi, Flávia Flor, Reginaldo, Débora, Helena, Cristiane, Denise, Pamela, Taís, Milena, Renata, Luli e Rose. À Profª. Drª. Maricilda Palandi de Mello pelo exemplo de profissionalismo e caráter.
A toda a equipe do Departamento de Otorrinolaringologia Cabeça e Pescoço, da FCM, UNICAMP, pela dedicação e esforço no atendimento e triagem dos pacientes. Em especial, ao Prof. Dr. Arthur Menino Castilho pela ajuda e atenção oferecida no decorrer deste trabalho.
A todos mis compañeros de la Unidad de Genética del Hospital Ramón y Cajal, Madrid/España: Manuela Villamar, Ignácio del Castillo, Francisco del Castillo, Gema, Elena, María, Tamara, Rosa, Lolo, Concha, Yoli, Ana, José Luis, Gloria, Cristina, Juan Manuel, Susana, Nati y Milagros, gracias por todo. En especial a Lucía Borreguero, Matías Morín y Fernando Mayo que mucho me enseñaron y me ayudaron, gracias por la paciencia. Y claro, a
Luciana Serrao de Castro que estaba siempre presente en todo lo que hiciera falta, gracias por tu gran amistad.
Aos pacientes e familiares, e a todos os colaboradores envolvidos, pois com certeza sem eles este trabalho não poderia ser realizado.
Às agências financiadoras CAPES, CNPq e FAPESP, pelas bolsas de estudo no Brasil e no exterior e auxílios concedidos.
Aos meus pais, Luciano e Lélia, meus irmãos, Luíza e Bruno, e todos da minha família pelo apoio e compreensão. Em especial, ao meu namorado Emerson pelo carinho e paciência. Obrigada por terem acreditado em mim.
A todos que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para a concretização deste trabalho.
RESUMO
A perda auditiva é uma das desordens sensoriais mais comuns em humanos. A identificação de alterações genéticas associadas à surdez pode contribuir para uma melhor compreensão das bases moleculares e dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos diferentes fenótipos das perdas auditivas hereditárias. Além disso, pode proporcionar um diagnóstico preciso, desenvolvimento de tratamentos mais específicos e aconselhamento genético para pacientes e famílias. No entanto, a elevada heterogeneidade clínica e genética da perda auditiva dificulta o diagnóstico molecular. Até o momento, já foram descritos mais de 90 genes e 150 loci envolvidos com perdas auditivas não-sindrômicas e pelo menos 40 genes associados aos principais tipos de surdez sindrômica. Com a aplicação de tecnologias de nova geração é possível otimizar o diagnóstico genético e realizar uma investigação mais ampla das perdas auditivas hereditárias. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi esclarecer a etiologia genética em uma amostra de indivíduos brasileiros com perdas auditivas associadas a distintos padrões de herança, mediante aplicação de tecnologias de nova geração (array-CGH e next-generation sequencing). Foram analisados casos esporádicos ou familiares com perda auditiva neurossensorial bilateral, para os quais foram excluídos fatores ambientais e as principais mutações relacionadas à perda auditiva de origem genética. Foi realizado o estudo molecular de 19 pacientes mediante a aplicação do OTO-NGS-Panel, um painel de captura de sequências dirigido a 71 genes envolvidos com perdas auditivas hereditárias para sequenciamento massivo, desenvolvido no Departamento de Genética do Hospital Ramón y Cajal, Madri/Espanha. Foram identificadas alterações patogênicas em nove dos 19 pacientes (47,4%). Doze mutações em sete genes distintos foram detectadas, com destaque para sete mutações que estão sendo descritas pela primeira vez neste trabalho. Dentre os genes envolvidos estavam: CDH23 e OTOF, relacionados à surdez de herança autossômica recessiva; DFNA5, ACTG1, COCH e CRYM, associados à perda auditiva de herança autossômica dominante; e PRPS1 envolvido com a perda auditiva de herança ligada ao cromossomo X. Foram pesquisadas deleções e inserções em seis pacientes com surdez de herança autossômica recessiva, mediante hibridação genômica comparativa baseada em array (array-CGH). Foi utilizado o OTO-CGH array, desenvolvido no Departamento de Genética do Hospital Ramón y Cajal, Madri/Espanha, que permite a análise de loci e genes associados à perda auditiva de herança autossômica recessiva. Porém, não foram encontradas alterações patogênicas que pudessem ser relacionadas à surdez nesses casos. A pesquisa de alterações
moleculares em uma amostra de pacientes brasileiros com perdas auditivas hereditárias, mediante a aplicação de tecnologias de nova geração, possibilitou a identificação de mutações em 47,4% dos casos. O OTO-NGS-Panel é eficiente para detectar a etiologia genética em um grupo heterogêneo de pacientes. Além de permitir a identificação de mutações novas, essa abordagem nos possibilitou reportar o envolvimento de genes nunca antes investigados na população brasileira. Já o OTO-CGH array não contribuiu para a elucidação da causa da surdez nos casos analisados. Este trabalho foi importante para introduzir informações a respeito da epidemiologia genética da perda auditiva no Brasil e também para adicionar novos dados referentes à diversidade de mutações que ocorrem nos genes relacionados à surdez.
ABSTRACT
Hearing loss is one of the most common sensory disorders in humans. The identification of genetic variants associated with deafness can contribute to a better understanding of the molecular basis and the pathophysiological mechanisms involved in the different phenotypes of hereditary hearing loss. Moreover, it can provide an accurate diagnosis, development of specific treatments and genetic counseling for patients and families. However, molecular diagnosis has been a challenge, mainly due to clinical and genetic heterogeneity of hearing loss. To date, more than 90 genes and 150 loci have been described for nonsyndromic hearing loss and at least 40 genes have been linked to the main types of syndromic hearing loss. The application of new high-throughput technologies allows an optimization of genetic diagnosis and a comprehensive investigation of hereditary hearing loss. Therefore, the main goal of the present study was to elucidate the genetic etiology in a cohort of Brazilian subjects with hearing loss associated with different inheritance patterns, using next-generation technologies (array-CGH and next-generation sequencing). We investigated unrelated sporadic or familial patients with bilateral sensorineural hearing loss, for whom environmental factors and the most frequent mutations associated with genetic hearing loss have been excluded. Nineteen patients were screened using the OTO-NGS-Panel, a targeted next-generation sequencing panel containing 71 genes already known to be involved in hereditary hearing loss, designed by the Genetic Department at the Hospital Ramón y Cajal, Madrid-Spain. Pathogenic variations were identified in nine out of 19 patients (47.4%). Twelve mutations in seven different genes were detected, highlighting seven mutations that are being described for the first time in the present work. The following genes were involved: CDH23 and OTOF, related to autosomal recessive hearing loss; DFNA5, ACTG1, COCH and CRYM, associated with autosomal dominant hearing loss; and PRPS1, responsible for X-linked hearing loss. Deletions and insertions were investigated in six patients with autosomal recessive deafness using array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) technology. The OTO-CGH array, designed by the Genetic Department at the Hospital Ramón y Cajal, Madrid-Spain, which allows the analysis of loci and genes associated with autosomal recessive hearing loss, was employed. However, no pathogenic variations that could explain the etiology of hearing loss for these cases were found. Molecular investigation in a cohort of Brazilian patients with hereditary hearing loss using next-generation technologies allowed the identification of mutations in 47.4% of cases.
Our study demonstrates the usefulness of the OTO-NGS-Panel for detecting the genetic etiology of hearing loss in a heterogeneous group of patients. In addition to the identification of novel mutations, this approach enabled us to report the involvement of genes that had never been investigated before in the Brazilian population. On the other hand, the OTO-CGH array has not been successful in elucidating the cause of deafness in the cases analyzed. This work was important to introduce information to the genetic epidemiology of hearing loss in Brazil and also to add new data to the diversity of mutations occurring in genes related to deafness.
Keywords: deafness, molecular diagnosis, genetic screening, targeted next-generation sequencing.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Ilustração esquemática do sistema auditivo, evidenciando as principais partes da orelha
externa, média e interna (Adaptado de:
<http://audiovoxfonoaudiologia.blogspot.com/2010_05_01_archive.html>). ... 26
Figura 2. Ilustração esquemática da orelha interna. Em destaque, cóclea vista de frente e em secção
transversal. A secção transversal da cóclea mostra a escala média entre as escalas vestibular e timpânica. Em destaque esquema detalhado do órgão de Corti e micrografia dos estereocílios das células ciliadas (Adaptado de: Purves et al., 2001). ... 27
Figura 3. Transdução mecanoelétrica mediada pelas células ciliadas. A deflexão dos estereocílios faz
com que canais se abram nas extremidades dos mesmos, permitindo o influxo de íons potássio, que resulta na despolarização das células ciliadas. Essa despolarização permite a entrada de íons cálcio por meio de canais de cálcio voltagem-dependentes na região basolateral das células ciliadas, provocando a liberação de neurotransmissores para as terminações nervosas do nervo auditivo (Adaptado de: Purves et al., 2001). ... 28
Figura 4. Representação esquemática da membrana basilar da cóclea humana, mostrando o aumento
da largura da membrana basilar a partir da base coclear em direção ao ápice, e evidenciando ainda a escala de frequências ao longo da cóclea. As frequências altas (agudas) estão representadas na extremidade basal da cóclea, enquanto as frequências baixas (graves) estão representadas no ápice (Adaptado de: Moller, 2006). ... 29
Figura 5. Fluxograma de investigação dos indivíduos que fizeram parte do estudo. ... 56 Figura 6. Representação esquemática do protocolo de preparação das amostras utilizando o
HaloPlexTM Target Enrichment System (Adaptado de Agilent Technologies website. Disponível em: <http://www.genomics.agilent.com/article.jsp?pageId=3061>). ... 69
Figura 7. Esquema representativo da distribuição do RE Master Mix (Adaptado do protocolo
HaloPlexTM Target Enrichment System for Illumina Sequencing. Disponível em: <http://www.genomics.agilent.com>). ... 70
Figura 8. Ilustração representativa da distribuição das amostras de DNA (Adaptado do protocolo
HaloPlexTM Target Enrichment System for Illumina Sequencing. Disponível em: <http://www.genomics.agilent.com>). ... 71
Figura 9. Padrão para validação dos resultados da digestão enzimática, utilizando o sistema
Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, Estados Unidos). Coluna 1: Marcador de peso molecular de 50 pb. Colunas 2-9: reações de digestão do DNA controle (filas A-H). Coluna 10: DNA controle sem digerir. ... 72
Figura 10. Padrão do eletroferograma para validação dos resultados do enriquecimento, utilizando o
amplicons deve variar de 175 a 625 pb, com a maioria dos fragmentos entre 225 e 525 pb. Amplicons
variando de 175 a 625 pb devem ser incluídos para quantificação do DNA. Qualquer produto fora desse padrão deve ser excluído da quantificação. ... 77
Figura 11. Fluxograma das etapas empregadas na análise dos dados obtidos após o sequenciamento de
nova geração (NGS), evidenciando os critérios empregados na seleção e confirmação das variantes candidatas. ... 81
Figura 12. Representação esquemática do processo de hibridação genômica comparativa baseada em
array (array-CGH). Adaptado de: <https://roche-biochem.jp/pdf/products/microarray/user_guide/CGH/CGH_brochure.pdf>. ... 82
Figura 13. Imagem ilustrativa da câmara de hibridação e da lâmina com as borrachas que delimitam
cada amostra. Essa imagem mostra o layout 4×180K (Adaptado de: <http://www.genomics.agilent.com/files/ProductImages/Cmbr_Backing_213.png>). ... 86
Figura 14. Representação esquemática da estrutura da caderina 23. N: região N- terminal. SP:
peptídeo sinal. EC: domínios extracelulares. TM: domínio transmembrânico. CT: domínio citoplasmático. C: região C-terminal... 94
Figura 15. Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.2968G>A – p.D990N em
heterozigose no éxon 25 do gene CDH23. ... 95
Figura 16. Resultados do sequenciamento do éxon 17 do gene CDH23 após clonagem dos
fragmentos. A: Eletroferograma mostrando a sequência sem a mutação. B: Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.1880delT – p.L627Rfs*10. ... 96
Figura 17. Heredograma da Família 1 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type
(alelo normal). ... 97
Figura 18. Análise do DNA do probando da Família 7. A: Eletroferograma mostrando em destaque a
mutação c.7558G>A – p.E2520K em heterozigose no éxon 53 do gene CDH23. B: Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.7909G>C – p.A2637P em heterozigose no éxon 55 do gene
CDH23. ... 97
Figura 19. Heredograma da Família 7 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type
(alelo normal). ... 98
Figura 20. Esquema representativo da estrutura dos éxons e íntrons do gene da otoferlina (topo),
destacando as regiões genômicas compreendidas entre os éxons 18-22 nas diferentes isoformas, em humanos e camundongos (abaixo). As regiões codificantes dos éxons estão representadas por retângulos pretos e as regiões não traduzidas estão representadas em branco (Adaptado de: Yasunaga et al., 2000). ... 99
Figura 21. Representação ilustrativa da estrutura da otoferlina (isoforma longa), evidenciando os seis
domínios C2 (C2A-C2F). N: região N- terminal. TM: domínio transmembrânico. C: região C-terminal. ... 99
Figura 22. Resultados do sequenciamento para confirmação da mutação no éxon 39 do gene OTOF.
A: Análise do DNA do pai do probando da Família 3. Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.4718T>C – p.I1573T em heterozigose. B: Análise do DNA do probando. Eletroferograma mostrando a mutação em homozigose... 101
Figura 23. Heredograma da Família 3 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type
(alelo normal). ... 101
Figura 24. Análise do DNA do probando da Família 17. A: Eletroferograma mostrando em destaque a
mutação c.2153G>A – p.W718X em heterozigose no éxon 19 do gene OTOF. B: Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.5127delC – p.D1709Efs*54 em heterozigose no éxon 42 do gene
OTOF. ... 102
Figura 25. Heredograma da Família 17 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type
(alelo normal). ... 103
Figura 26. Esquema ilustrativo da estrutura dos éxons e íntrons do gene DFNA5, evidenciando as
mutações descritas até o momento. Os éxons estão representados por retângulos, sendo que as regiões codificantes estão marcadas em azul e as regiões não traduzidas em branco. ... 104
Figura 27. Resultados do sequenciamento para confirmação da mutação c.991-2A>G no gene
DFNA5. A: Análise do DNA do probando da Família 8. Eletroferograma mostrando em destaque a
mutação em heterozigose. B: Análise do DNA do indivíduo IV:2. Eletroferograma mostrando a sequência sem a mutação. ... 105
Figura 28. Heredograma da Família 8 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type
(alelo normal). ... 105
Figura 29. Ilustração da estrutura dos éxons e íntrons do gene ACTG1. Os éxons estão representados
por retângulos, sendo que as regiões codificantes estão marcadas em cinza e as regiões não traduzidas em branco. ... 106
Figura 30. Resultados do sequenciamento para confirmação da mutação c.353A>T – p.K118M no
éxon 3 do gene ACTG1. A: Análise do DNA do probando da Família 13. Eletroferograma mostrando em destaque a mutação em heterozigose. B: Análise do DNA do indivíduo III:6. Eletroferograma mostrando a sequência sem a mutação. ... 107
Figura 31. Heredograma da Família 13 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type
(alelo normal). ... 108
Figura 32. Representação esquemática da estrutura da coclina, mostrando o pepitídeo sinal (SP) na
região N- terminal (N), o domínio LCCL (Limulus factor C, cochlear protein Coch-5b2, late gestation
lung protein Lgl1), os dois domínios curtos intermediários (ivd 1 e 2) e os dois domínios von Willebrand factor A-like (vWFA1 e vWFA2). C: região C- terminal. O domínio LCCL se extende do
éxon 4 ao 6, o vWFA1 do éxon 8 ao 10 e o vWFA2 do éxon 11 ao 12. ... 109
Figura 33. Análise do DNA do probando da Família 15. Eletroferograma mostrando em destaque a
Figura 34. Heredograma da Família 15 mostrando o genótipo do probando analisado. wt: wild type
(alelo normal). ... 111
Figura 35. Esquema representativo da estrutura dos éxons e íntrons do gene CRYM, evidenciando as
mutações descritas até o momento. Os éxons estão representados por retângulos, sendo que as regiões codificantes estão marcadas em laranja e as regiões não traduzidas em branco. ... 112
Figura 36. Resultados do sequenciamento para confirmação da mutação c.679G>T – p.G227X no
éxon 8 do gene CRYM. A: Análise do DNA do probando da Família 19. Eletroferograma mostrando em destaque a mutação em heterozigose. B: Análise do DNA da irmã do probando. Eletroferograma mostrando a sequência sem a mutação. ... 112
Figura 37. Heredograma da Família 19 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type
(alelo normal). ... 113
Figura 38. Representação ilustrativa da estrutura do gene PRPS1. Os éxons estão representados por
retângulos, sendo que as regiões codificantes estão marcadas em roxo e as regiões não traduzidas em branco. ... 114
Figura 39. Análise do DNA do probando da Família 14. Eletroferograma mostrando em destaque a
mutação c.419T>G – p.I140S em heterozigose no éxon 4 do gene PRPS1. ... 114
Figura 40. Heredograma da família 14 mostrando o genótipo do probando analisado. wt: wild type
(alelo normal). ... 115
Figura 41. Análise do DNA do indivíduo 2. A: Eletroferograma mostrando em destaque a mutação
c.5287C>T – p.R1763W em heterozigose no éxon 20 do gene MYO15A. B: Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.10573A>G – p.S3525G em heterozigose no éxon 66 do gene
MYO15A. ... 116
Figura 42. Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.3624_3625delAG – p.A1210Sfs*31
em heterozigose no éxon 27 do gene DIAPH1. ... 120
Figura 43. Imagem representativa da lâmina de microarray, evidenciando a diferença das intensidades
de fluorescência para cada região. ... 122
Figura 44. Análise dos resultados de hibridação genômica comparativa baseada em array
(array-CGH). A: Amostra utilizada como controle positivo. Visualização com o Genomic Workbench Software (Agilent Technologies, Santa Clara, Estados Unidos), mostrando em destaque exemplo de deleção próxima à região cromossômica 8q13.2., representada pela região com valores de log2 próximos de -1. B: Exemplo da mesma região do cromossomo 8 sem deleções ou inserções (valores próximos de zero). No gráfico, X= log2 da razão teste/referência; Y= sondas de acordo com a posição genômica. Os genes presentes em cada região estão identificados em cinza. ... 123
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais síndromes que apresentam a surdez como sinal clínico e os genes envolvidos.
(Adaptado de van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage.
<http://hereditaryhearingloss.org>). ... 33
Tabela 2. Genes e loci relacionados à perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica recessiva (Adaptado de van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage. <http://hereditaryhearingloss.org>). ... 38
Tabela 3. Genes e loci relacionados à perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica dominante (Adaptado de van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage. <http://hereditaryhearingloss.org>). ... 42
Tabela 4. Genes e loci relacionados com a perda auditiva não-sindrômica de herança ligada ao cromossomo X (Adaptado de van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage. <http://hereditaryhearingloss.org>). ... 44
Tabela 5. Sequência dos primers utilizados para amplificação do gene GJB2. ... 58
Tabela 6. Programa para amplificação do éxon codificante do gene GJB2. ... 58
Tabela 7. Programa de amplificação para sequenciamento. ... 59
Tabela 8. Sequência dos primers utilizados para o rastreamento da mutação IVS1+1G>A. ... 60
Tabela 9. Programa para o rastreamento da mutação IVS1+1G>A no gene GJB2. ... 60
Tabela 10. Sequência dos primers utilizados para rastreamento das deleções del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene GJB6. ... 61
Tabela 11. Programa para detecção das deleções del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene GJB6. ... 62
Tabela 12. Sequência dos primers utilizados para amplificação do gene MTRNR1. ... 62
Tabela 13. Programa para amplificação do gene MTRNR1. ... 63
Tabela 14. Lista de genes associados à perda auditiva incluídos no painel de captura (OTO-NGS-Panel). ... 64
Tabela 15. Preparação da mistura tampão RE/BSA. ... 70
Tabela 16. Programa do termociclador para digestão enzimática. ... 71
Tabela 17. Preparação do Master Mix de hibridação. ... 72
Tabela 18. Programa do termociclador para hibridação das sondas HaloPlex. ... 73
Tabela 19. Solução HaloPlex Magnetic Bead. ... 73
Tabela 20. Solução de captura. ... 73
Tabela 21. Preparação do Master Mix de ligação do DNA. ... 74
Tabela 22. Preparação do PCR Master Mix. ... 75
Tabela 24. Sequência dos primers utilizados, temperatura de anelamento e tamanho dos fragmentos
gerados para confirmação das variantes candidatas e verificação da segregação nas famílias. Em destaque estão as variantes que não foram validadas pelo sequenciamento Sanger (a), consideradas não patogênicas após estudos detalhados (b) ou para as quais o fenótipo do paciente não estava de acordo
com a perda auditiva típica para mutações naquele gene (c). ... 79
Tabela 25. Enzimas utilizadas para o rastreamento no grupo controle das mutações não descritas na literatura. ... 80
Tabela 26. Preparação do Master Mix de digestão. ... 83
Tabela 27. Programa do termociclador para digestão. ... 84
Tabela 28. Programa do termociclador para desnaturalização e fragmentação do DNA. ... 84
Tabela 29. Preparação do Master Mix de marcação. ... 84
Tabela 30. Programa do termociclador para marcação do DNA. ... 84
Tabela 31. Preparação do Master Mix de hibridação. ... 85
Tabela 32. Programa do termociclador para hibridação. ... 85
Tabela 33. Dados clínicos dos pacientes envolvidos no estudo. ... 89
Tabela 34. Resultados obtidos no rastreamento das principais alterações moleculares associadas à perda auditiva de origem genética. ... 90
Tabela 35. Mutações encontradas após sequenciamento massivo (NGS), utilizando o painel de captura de sequências dirigido a 71 genes associados à perda auditiva hereditária. ... 92
Tabela 36. Análise computacional das mutações novas reportadas no presente estudo. ... 93
Tabela 37. Variantes candidatas detectadas no indivíduo 2 após sequenciamento massivo (NGS), utilizando o OTO-NGS-Panel. ... 116
Tabela 38. Variante candidata detectada no indivíduo 4 após sequenciamento massivo (NGS), utilizando o OTO-NGS-Panel. ... 117
Tabela 39. Variantes candidatas detectadas no indivíduo 16 após sequenciamento massivo (NGS), utilizando o OTO-NGS-Panel. ... 119
Tabela 40. Variantes candidatas detectadas no indivíduo 18 após sequenciamento massivo (NGS), utilizando o OTO-NGS-Panel. ... 120
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
array-CGH Array-based comparative genomic hybridization (hibridação genômica comparativa baseada em array)
ATP Adenosine triphosphate (trifosfato de adenosina)
cDNA DNA complementar
CNV Copy number variation (variação no número de cópias)
Cx Conexina
dB Decibel
DFNA Locus de surdez não-sindrômica autossômica dominante DFNB Locus de surdez não-sindrômica autossômica recessiva DFNX Locus de surdez não-sindrômica ligada ao cromossomo X
DFNM Locus modificador de surdez
DNA Ácido desoxirribonucléico
DNAmt DNA mitocondrial
dNTP Desoxinucleotídeo trifosfato
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
g Grama
kb Kilobase
M Massa molar
MAF Minor allele frequency (alelo de menor frequência)
mL Mililitro
mM Milimolar
ng Nanograma
NGS Next-generation sequencing (sequenciamento de nova geração)
OMS Organização Mundial de Saúde
pb Par de base
PCR Polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase) PEATE Potenciais Evocados Auditivos de Tronco Encefálico
pH Potencial de hidrogênio iônico
pmol Picomol
RNA Ácido ribonucleico
RNAr RNA ribossômico
RNAt RNA transportador
rpm Rotações por minuto
SNP Single nucleotide polymorphism (polimorfismo de nucleotídeo
único)
Taq Thermus aquaticus (enzima polimerase)
TBE Tris, base, ácido bórico, EDTA
TE Tris EDTA
U Unidade
UTR Untranslated region (região não traduzida)
μL Microlitro
g Micrograma
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 25
1. Anatomia e fisiologia do sistema auditivo ... 25
2. Aspectos gerais das perdas auditivas ... 29
3. Genética das perdas auditivas ... 32
3.1. Perdas auditivas sindrômicas ... 33
3.2. Perdas auditivas não-sindrômicas ... 37
3.2.1. Herança autossômica recessiva ... 37
3.2.2. Herança autossômica dominante ... 41
3.2.3. Herança ligada ao cromossomo X ... 44
3.2.4. Herança mitocondrial ... 45
4. Novas tecnologias aplicadas ao diagnóstico da perda auditiva ... 47
JUSTIFICATIVA ... 51 OBJETIVOS ... 53 1. Objetivo geral ... 53 2. Objetivos específicos ... 53 MÉTODOS ... 55 1. Casuística ... 55 2. Estudo genético... 56
2.1. Extração do DNA genômico de sangue periférico ... 56
2.2. Análise de mutações no gene GJB2, deleções D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene GJB6 e mutação mitocondrial m.1555A>G no gene MTRNR1 ... 57
2.2.1. Rastreamento de mutações no gene GJB2 por sequenciamento ... 57
2.2.1.1. Reação para sequenciamento ... 58
2.2.1.2. Análise das sequências obtidas ... 59
2.2.2. Detecção da mutação IVS1+1G>A no gene GJB2 ... 59
2.2.3. Triagem das deleções del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene GJB6 ... 61
2.2.4. Identificação da mutação mitocondrial m.1555A>G no gene MTRNR1 ... 62
2.3. Painel de captura para next-generation sequencing ... 63
2.3.1. Quantificação do DNA genômico ... 69
2.3.2. Digestão do DNA genômico com enzimas de restrição ... 69
2.3.3. Hibridação do DNA às sondas ... 72
2.3.4. Captura do DNA de interesse ... 73
2.3.5. Ligação ... 74
2.3.6. Preparação do PCR Master Mix ... 75
2.3.7. Eluição do DNA capturado ... 75
2.3.8. Amplificação ... 76
2.3.9. Purificação das bibliotecas ... 76
2.3.10. Validação do enriquecimento e quantificação do DNA ... 77
2.3.11. Análise bioinformática e validação das mutações ... 78
2.4. Hibridação genômica comparativa baseada em array ... 81
2.4.1. Análise quantitativa e qualitativa ... 83
2.4.2. Digestão do DNA genômico ... 83
2.4.3. Marcação ... 84
2.4.4. Purificação ... 85
2.4.5. Hibridação ... 85
2.4.6. Aplicação das amostras nas lâminas ... 86
2.4.7. Lavagem ... 86
2.4.8. Leitura das lâminas ... 87
RESULTADOS E DISCUSSÃO... 89
1. Pacientes ... 89
2. Principais alterações moleculares associadas à perda auditiva de origem genética ... 89
3. Next-generation sequencing ... 91
3.1.1. Gene CDH23 (Locus DFNB12) ... 93 3.1.1.1. Família 1 ... 95 3.1.1.2. Família 7 ... 97 3.1.2. Gene OTOF (Locus DFNB9) ... 98 3.1.2.1. Família 3 ... 100 3.1.2.2. Família 17 ... 102 3.2. Perdas auditivas de herança autossômica dominante ... 103 3.2.1. Gene DFNA5 ... 103 3.2.1.1. Família 8 ... 104 3.2.2. Gene ACTG1 ... 106 3.2.2.1. Família 13 ... 107 3.2.3. Gene COCH ... 108 3.2.3.1. Família 15 ... 110 3.2.4. Gene CRYM ... 111 3.2.4.1. Família 19 ... 112 3.3. Perdas auditivas de herança ligada ao cromossomo X ... 113 3.3.1. Gene PRPS1 ... 113 3.3.1.1. Família 14 ... 114 3.4. Etiologia genética não esclarecida ... 115 3.4.1. Indivíduo 2 ... 115 3.4.2. Indivíduo 4 ... 117 3.4.3. Indivíduo 5 ... 118 3.4.4. Indivíduo 6 ... 118 3.4.5. Indivíduo 9 ... 118 3.4.6. Indivíduo 10 ... 118 3.4.7. Indivíduo 11 ... 118 3.4.8. Indivíduo 12 ... 119
3.4.9. Indivíduo 16 ... 119 3.4.10. Indivíduo 18 ... 120 4. Hibridação genômica comparativa baseada em array ... 121 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 125 CONCLUSÕES ... 130 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 132 ANEXO 1 ... 155 ANEXO 2 ... 160
INTRODUÇÃO
1. Anatomia e fisiologia do sistema auditivo
O sistema da audição é um dos mais complexos do nosso organismo. Ele é responsável por captar as diferentes ondas sonoras e dar início ao processo de percepção e interpretação do som.
Uma mistura de ondas sonoras é constantemente gerada no ambiente e alcança nossas orelhas. Esta rica coleção de sons contém um amplo espectro de tons altos e baixos em uma variedade de intensidades. A orelha é um órgão capaz de decifrar precisamente as diferentes frequências e intensidades, enquanto ao mesmo tempo transfere as informações coletadas para o cérebro e nos permite categorizar cada som e identificar sua distância relativa e direção (Dror & Avraham, 2009).
A orelha dos mamíferos é composta por três partes: orelha externa, média e interna (Figura 1). A orelha externa é formada pelo pavilhão auricular e canal auditivo. O pavilhão auricular é uma estrutura flexível, de cartilagem elástica, revestida por tecido epitelial. O canal auditivo é um canal cartilaginoso no primeiro terço externo e ósseo nos dois terços internos (osso temporal). A extremidade externa do canal auditivo está aberta, enquanto a extremidade interior está fechada pela membrana timpânica, que o separa da orelha média. A orelha externa conduz as ondas sonoras do ambiente para a orelha interna, passando pela orelha média. As ondas sonoras são captadas pelo pavilhão auricular da orelha externa e conduzidas pelo canal auditivo até a membrana timpânica (Purves et al., 2001; Moller, 2006). A orelha média é composta pela membrana timpânica e três pequenos ossos (martelo, bigorna e estribo), os ossículos, que são montados em conjunto e servem como um elo entre o tímpano e a janela oval da orelha interna, que é preenchida por fluido. A função básica da orelha média é transmitir a energia sonora da orelha externa (meio aéreo) para a orelha interna (meio líquido). Após o estímulo sonoro, a vibração do tímpano leva ao movimento dos ossículos da orelha média e, posteriormente, dos fluidos da orelha interna, a parte sensorial da orelha (Dror & Avraham, 2009).
A orelha interna contém os órgãos sensoriais que nos permitem ouvir e que controlam o nosso equilíbrio e orientação espacial. Essas estruturas são: a cóclea, responsável pela percepção do som (processamento da informação auditiva), e o vestíbulo, sensível à gravidade
e aceleração. O sistema vestibular é composto por três canais semicirculares, sáculo e utrículo (Dror & Avraham, 2009).
Figura 1. Ilustração esquemática do sistema auditivo, evidenciando as principais
partes da orelha externa, média e interna (Adaptado de:
<http://audiovoxfonoaudiologia.blogspot.com/2010_05_01_archive.html>).
A cóclea é um canal ósseo-membranoso em forma de caracol (helicoidal), rodeado pelo osso temporal. É dividida em três compartimentos preenchidos por fluidos: as escalas média, vestibular e timpânica. A escala média é uma cavidade cheia de endolinfa, localizada entre a escala vestibular e timpânica, cavidades preenchidas por perilinfa (Dror & Avraham, 2009). A perilinfa apresenta alta concentração de sódio e baixa concentração de potássio, enquanto a composição da endolinfa se assemelha a dos fluídos intracelulares, com baixa concentração de sódio e alta concentração de potássio. A escala média é separada da escala vestibular pela membrana de Reissner, e da escala timânica pela membrana basilar (Moller, 2006).
Na escala média está localizado o órgão de Corti, ou órgão Espiral, que é a porção sensorial propriamente dita do sistema auditivo. Esse órgão, situado na membrana basilar, é constituído por células de suporte e células sensoriais especializadas, denominadas células ciliadas. As células ciliadas apresentam uma disposição altamente organizada: uma fila formada por células ciliadas internas e três filas formadas por células ciliadas externas (Dror & Avraham, 2009).
A porção apical das células ciliadas contém projeções especializadas ricas em actina, denominadas estereocílios. As células ciliadas estão cobertas pela membrana tectória, uma matriz extracelular rica em colágeno (Dror & Avraham, 2009). As células ciliadas internas
são capazes de transformar a energia mecânica em sinal elétrico, que é o princípio básico da audição. Elas são os receptores auditivos propriamente ditos, que transmitem os sinais ao nervo auditivo. Por outro lado, as células ciliadas externas contribuem para uma maior sensibilidade e discriminação das frequências, através da amplificação do som, graças à sua característica de eletromotilidade. As células ciliadas externas provocam aumento na amplitude da vibração da membrana basilar, amplificando a energia sonora e aumentando a estimulação das células ciliadas internas (Moller, 2006). A Figura 2 traz uma ilustração esquemática da cóclea e detalhe de suas porções, evidenciando a localização das células ciliadas do órgão de Corti e dos estereocílios.
Figura 2. Ilustração esquemática da orelha interna. Em destaque, cóclea vista de frente e em secção transversal. A secção transversal da cóclea mostra a escala média entre as escalas vestibular e timpânica. Em destaque esquema detalhado do órgão de Corti e micrografia dos estereocílios das células ciliadas (Adaptado de: Purves et al., 2001).
Os estereocílios das células ciliadas se organizam em feixes. O extremo apical de cada um dos estereocílios está conectado à lateral do estereocílio adjacente por uniões apicais chamadas tip links. Essas uniões atuam na abertura de canais, permitindo que o potássio da endolinfa entre nas células e despolarize-as (Purves et al., 2001).
Quando o som é captado, fluidos se movem pela escala média e fazem vibrar a membrana basilar, a qual desloca o epitélio sensorial contra a membrana tectória. As vibrações ativam a transdução mecanoelétrica desencadeada pelas células ciliadas, provocando a deflexão dos estereocílios e permitindo o influxo de íons potássio por meio da abertura de canais que despolarizam as células ciliadas (Dror & Avraham, 2009). Por sua vez, essa despolarização permite a entrada de íons cálcio por meio de canais de cálcio voltagem-dependentes, provocando a liberação de vesículas contendo neurotransmissores que desencadeiam o impulso nervoso. Esses impulsos elétricos são transmitidos ao nervo auditivo, que leva a informação ao cérebro, onde são interpretados (Purves et al., 2001) (Figura 3).
Figura 3. Transdução mecanoelétrica mediada pelas células ciliadas. A deflexão dos estereocílios faz com que canais se abram nas extremidades dos mesmos, permitindo o influxo de íons potássio, que resulta na despolarização das células ciliadas. Essa despolarização permite a entrada de íons cálcio por meio de canais de cálcio voltagem-dependentes na região basolateral das células ciliadas, provocando a liberação de neurotransmissores para as terminações nervosas do nervo auditivo (Adaptado de: Purves et al., 2001).
É interessante ressaltar que o deslocamento de fluidos gerado pelas ondas sonoras faz com que a membranda basilar vibre de cima para baixo. A principal característica da membrana basilar é que ela não é uniforme, ocorrendo uma diminuição gradual de sua espessura e rigidez da base em direção ao ápice. Além disso, ela é mais larga no ápice, afinando em direção à base (ao contrário da estrutura da cóclea, que se alarga em direção à
base). Assim, cada estímulo vibratório se propaga pela membrana, causando maior amplitude de movimento em determinado ponto dela. Isso atribui à membrana uma organização tonotópica, ou seja, sons agudos (frequências altas) têm seu pico na base coclear e, sons graves (frequências baixas), no ápice (Moller, 2006) (Figura 4).
Figura 4. Representação esquemática da membrana basilar da cóclea humana, mostrando o aumento da largura da membrana basilar a partir da base coclear em direção ao ápice, e evidenciando ainda a escala de frequências ao longo da cóclea. As frequências altas (agudas) estão representadas na extremidade basal da cóclea, enquanto as frequências baixas (graves) estão representadas no ápice (Adaptado de: Moller, 2006).
2. Aspectos gerais das perdas auditivas
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a surdez refere-se à perda total da audição em uma ou nas duas orelhas. Já os termos deficiência ou perda auditiva referem-se à perda parcial ou completa da capacidade auditiva (OMS, 2015).
Neste trabalho, os termos surdez, perda auditiva e deficiência auditiva serão adotados para se referir a qualquer comprometimento do sistema auditivo significante, independente do tipo, etiologia, grau ou frequência. Essa mesma terminologia pode não se aplicar para outros profissionais, como por exemplo, otorrinolaringologistas e fonoaudiólogos. Entretanto, em publicações científicas relacionadas à genética, esses termos são os mais empregados, já que muitas vezes perdas auditivas que apresentam a mesma etiologia genética podem exibir manifestações bastante variáveis.
A surdez é uma das doenças sensoriais mais prevalentes em humanos. Segundo dados da OMS, cerca de 360 milhões de pessoas (328 milhões de adultos e 32 milhões de crianças)
apresentam algum tipo de perda auditiva, o correspondente a 5% da população mundial. Esse número é ainda maior na população idosa. Aproximadamente um terço das pessoas com mais de 65 anos de idade são acometidas por algum tipo de deficiência auditiva (OMS, 2015).
Dados internacionais apontam que um em cada mil recém-nascidos apresenta perda auditiva (Tekin et al., 2001; Schrijver, 2004). No Brasil, a frequência é estimada em quatro a cada mil nascimentos (Piatto & Maniglia, 2001), podendo variar de dois a sete para cada mil recém-nascidos, dependendo da amostra e região estudadas (Simões & Maciel-Guerra, 1992).
A triagem auditiva neonatal universal tem sido recomendada nacional e internacionalmente. A justificativa para esta iniciativa baseia-se na premissa de que a detecção e intervenção precoce em crianças com perda auditiva maximizam as oportunidades de desenvolvimento da fala e linguagem, facilitando assim a aquisição de competências sociais, cognitivas e motoras. A estimulação do córtex auditivo antes dos seis meses de idade é crucial para o desenvolvimento normal das vias auditivas. Quanto mais precoce a identificação e intervenção, mais significativos e efetivos são os benefícios (ACMG, 2002; JCIH, 2007; Lewis et al., 2010).
As perdas auditivas podem ser classificadas de diferentes formas, como por exemplo, de acordo com a região afetada, podendo ser do tipo condutiva, neurossensorial ou mista. A perda condutiva é causada por problemas na orelha externa e/ou média; a neurossensorial é decorrente de problemas na orelha interna e/ou nervo coclear; e a mista é causada por uma combinação de ambos componentes condutivos e neurossensoriais.
De acordo com o início da perda auditiva, esta pode ser classificada como: pré-lingual, se estiver presente desde o nascimento ou antes da aquisição da linguagem, ou pós-lingual, quando se manifesta após a aquisição da linguagem. É importante observar que a surdez congênita é sempre pré-lingual, porém nem toda deficiência auditiva pré-lingual é congênita.
A deficiência auditiva pode ainda ser definida com base em seu grau, como leve (de 26 a 40 dB), moderada (de 41 a 70 dB), severa (de 71 a 90 dB) ou profunda (acima de 90 dB). A avaliação é feita com base na média dos limiares tonais obtidos na melhor orelha nas frequências que variam de 500 a 4000 Hertz (Hz), que são essenciais para o entendimento da fala. A audição é considerada normal se o limiar for de até 20 dB (Davis & Silverman, 1970).
Outro critério de classificação é quanto à lateralidade, sendo chamada de unilateral quando a perda auditiva está presente em apenas um dos lados, e de bilateral quando ambas as orelhas são afetadas. As perdas bilaterais podem ainda ser divididas em assimétricas, quando o acometimento não é igual dos dois lados, ou simétricas.
Considerando-se sua evolução, a surdez pode ser progressiva ou estacionária. Uma perda é progressiva quando se apresenta primeiramente de forma leve e com o tempo seu grau passa a ser maior, evoluindo também para outras frequências. Caracteriza-se como estacionária, se não houver alterações ao longo do tempo.
Em relação às frequências audiométricas, a perda auditiva pode comprometer: frequências baixas ou graves (< 500 Hz), frequências médias (500 a 2000 Hz), e frequências altas ou agudas (> 2000 Hz).
Quando os casos de perda auditiva são acompanhados por outras manifestações clínicas são caracterizados como sindrômicos, ao contrário dos não-sindrômicos, onde a perda auditiva é o único sinal clínico presente.
A surdez pode ser causada por uma série de fatores ambientais ou genéticos. Os fatores ambientais incluem a exposição frequente a sons de alta intensidade, trauma acústico, infecções, drogas ototóxicas, entre outros. Já os fatores genéticos são causados por mutações em diferentes genes ou em elementos regulatórios que estão envolvidos no desenvolvimento adequado, na estrutura ou na função dos componentes do sistema auditivo (Dror & Avraham, 2009).
A perda auditiva pode ainda apresentar origem multifatorial ou complexa, resultando da interação entre fatores ambientais e genéticos. Um exemplo é a presbiacusia, que é a diminuição da capacidade auditiva relacionada ao envelhecimento. Poucos genes foram associados a esse tipo de surdez e não se sabe ao certo se genes relacionados a formas monogênicas também podem estar envolvidos com perdas auditivas de origem multifatorial (Huyghe et al., 2008; Hilgert et al., 2009a). Além disso, mutações em determinados genes podem não levar à surdez diretamente, em vez disso, aumentam o risco de perda auditiva decorrente de fatores ambientais, como exposição a sons de alta intensidade ou uso de antibióticos ototóxicos (Konings et al., 2008; Lu et al., 2010).
A contribuição de causas ambientais é muitas vezes determinada pelas condições econômicas e sociais que afetam a saúde pública, principalmente no que diz respeito à disponibilidade de cuidados médicos pré-natal, neonatal e pós-natal. Por essa razão, há uma maior prevalência de fatores ambientais nos países em desenvolvimento, ao passo que os fatores genéticos são a principal causa de perda auditiva em países com elevados padrões de cuidados no setor de saúde. Muitas das causas ambientais podem ser reduzidas ou eliminadas por meio de imunizações, melhores terapias para infecções bacterianas e virais, regulamentações no setor de saúde e mudanças na qualidade de vida.
Nos países desenvolvidos, mais de 60% dos casos de perda auditiva resultam de causas genéticas (Rodríguez-Ballesteros et al., 2008). Entretanto, no Brasil, os fatores ambientais ainda superam os de origem genética (Simões & Maciel-Guerra, 1992; Pupo et al., 2008; Calháu et al., 2011; Colella-Santos et al., 2011). À medida que vêm sendo implantadas melhorias na área da saúde, e com o avanço e aprofundamento nos estudos genéticos relacionados às perdas auditivas, a proporção de causas genéticas tende a aumentar.
3. Genética das perdas auditivas
Nas últimas décadas houve um avanço significativo na pesquisa sobre as bases moleculares do sistema auditivo, permitindo a identificação e caracterização de vários genes e proteínas envolvidos no processo de audição. O conhecimento cada vez maior sobre esses genes contribui não só para uma melhor compreensão dos mecanismos da audição, mas também das bases moleculares dos diferentes tipos de perdas auditivas. Esta pesquisa básica é um pré-requisito para o desenvolvimento do diagnóstico molecular e de novas estratégias terapêuticas para a surdez (Stöver & Diensthuber, 2011).
Um dos maiores empecilhos na localização de genes relacionados à perda auditiva é a dificuldade de acesso à cóclea e às demais estruturas da orelha interna. A construção de bancos de cDNA de material coclear possibilitou o mapeamento e identificação de genes candidatos envolvidos com a surdez (Wilcox & Fex, 1992; Robertson et al., 1994). O grande número de genes expressos na cóclea reflete a complexidade dos mecanismos moleculares envolvidos neste órgão de intrincada natureza.
As funções dos genes envolvidos com a audição são diversificadas e a lista inclui genes que codificam componentes da matriz extracelular, proteínas de gap junction e adesão, canais de íons e transportadores, proteínas de superfície das células e receptores, assim como proteínas de citoesqueleto, fatores de transcrição, RNAs transportadores (RNAt), RNAs ribossômicos (RNAr) e outras proteínas (Finsterer & Fellinger, 2005; Friedman et al., 2007).
A heterogeneidade genética das perdas auditivas hereditárias é extremamente elevada. Estima-se que cerca de 300 genes estejam associados à surdez, o correspondente a cerca de 1% do genoma (Nance, 2003; Friedman & Griffith, 2003). Até o momento, já foram descritos cerca de 90 genes envolvidos com perdas auditivas não-sindrômicas e mais de 40 genes relacionados aos principais tipos de surdez sindrômica (van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage. <http://hereditaryhearingloss.org>).
Curiosamente, estudos têm mostrado que um mesmo gene pode estar relacionado tanto com perda auditiva sindrômica quanto não-sindrômica, ou mesmo envolvido em diferentes padrões de herança, autossômico dominante ou recessivo (Kelsell et al., 1997; Liu et al., 1997; Weil et al., 1997; Everett et al., 1997; Li et al., 1998; Grifa et al., 1999).
Mutações nos genes GJB2 e GJB6 e a mutação mitocondrial m.1555A>G no gene MTRNR1 representam a principal causa relacionada à surdez de origem genética em todo o mundo, variando, no entanto, de população para população (del Castillo et al., 2003; Hilgert et al., 2009b). Sendo assim, a análise dessas mutações constitui o primeiro passo do rastreamento genético da perda auditiva não-sindrômica.
3.1. Perdas auditivas sindrômicas
Apesar de existirem mais de 400 síndromes reportadas que apresentam a surdez como sinal clínico, apenas 30% dos casos de perdas auditivas hereditárias são sindrômicos (Hilgert et al., 2009a). Nesses casos a perda auditiva pode estar associada a várias anomalias, como malformações craniofaciais ou cervicais, distúrbios oculares, musculoesqueléticos, cutâneos, renais, metabólicos, nervosos, de pigmentação, entre outros.
Até o momento foram identificados mais de 40 genes envolvidos com as principais síndromes que incluem a surdez como uma de suas manifestações clínicas (van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage. <http://hereditaryhearingloss.org>). A seguir estão destacados esses genes (Tabela 1).
Tabela 1. Principais síndromes que apresentam a surdez como sinal clínico e os genes envolvidos. (Adaptado de van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage. <http://hereditaryhearingloss.org>).
Síndrome Locus Gene Localização cromossômica Alport - COL4A5 Xq22 - COL4A3/COL4A4 2q36-q37 Branquio-oto-renal BOR1 EYA1 8q13.3 BOR2 SIX5 19q13.3 - Desconhecido 1q31 BOS3 SIX1 14q21.3-q24.3 CHARGE - SEMA3E 7q21.11 - CHD7 19q13.3 Jervell e Lange-Nielsen JLNS1 KCNQ1 11p15.5 JLNS2 KCNE1 21q22.1-q22.2 Norrie NDP NDP Xp11.3
Síndrome Locus Gene Localização cromossômica Pendred PDS SLC26A4 7q21-34 FOXI1 5q35.1 KCNJ10 1q23.2 Perrault - HSD17B4 5q23.1 - HARS2 5q31.3 - LARS2 3p21.31 Stickler STL1 COL2A1 12q13.11-q13.2 STL2 COL11A1 1p21 STL3 COL11A2 6p21.3 - COL9A1 6q13 - COL9A2 1p34.2 Treacher Collins TCOF1 TCOF1 5q32-q33.1 POLR1D POLR1D 13q12.2 POLR1C POLR1C 6p21.1 Usher USH1A - 14q32 USH1B MYO7A 11q13.5 USH1C USH1C 11p15.1 USH1D CDH23 10q22.1 USH1E Desconhecido 21q21 USH1F PCDH15 10q21-22 USH1G SANS 17q24-25 USH1H Desconhecido 15q22-23 USH1J CIB2 15q23-q25.1 USH1K Desconhecido 10p11.21-p21.1 USH2A USH2A 1q41 USH2B Desconhecido 3p23-24.2 USH2C VLGR1 5q14.3-q21.3 USH2D WHRN 9q32 USH3 CLRN1 3q21-q25 Waardenburg WS1/WS3 PAX3 2q35 WS2A MITF 3p14.1-p12.3 WS2B Desconhecido 1p21-p13.3 WS2C Desconhecido 8p23 WS2D SNAI2 8q11 WS4 EDNRB 13q22 EDN3 20q13.2-q13.3 SOX10 22q13 Wolfram WFS1 WFS1 4p16 WFS2 CISD2 4q22-q24
A síndrome de Usher é a forma mais comum de perda auditiva sindrômica de herança autossômica recessiva (Smith et al., 2014). Ela é caracterizada por perda auditiva neurossensorial associada à retinitis pigmentosa (degeneração progressiva na retina que provoca perda da visão). Três tipos de síndrome de Usher são reconhecidos. O tipo I é definido pela presença de perda auditiva neurossensorial congênita, de grau severo a
profundo, alteração da função vestibular e retinitis pigmentosa com início na primeira década de vida. O tipo II consiste em perda auditiva neurossensorial congênita, de grau leve a severo, função vestibular normal e retinitis pigmentosa com início na primeira ou segunda década de vida. Já o tipo III é caracterizado por perda auditiva pós-lingual, progressiva, deterioração progressiva da função vestibular e retinitis pigmentosa com idade de início variável.
No total foram reportados 10 genes envolvidos com os distintos tipos de síndrome de Usher. O tipo I está associado a mutações nos seguintes genes: MYO7A (USH1B), USH1C (harmonina ou PDZ73), CDH23 (USH1D), PCDH15 (USH1F), SANS (USH1G) e CIB2 (USH1J) (Smith et al., 1992; Weil et al., 1995; Bork et al., 2001; Ahmed et al., 2001; Alagramam et al., 2001; Weil et al., 2003; Riazuddin et al., 2012). Para o tipo II, três genes foram descritos: USH2A, VLGR1 ou GPR98 (USH2C) e DFNB31 ou whirlina (USH2D) (Eudy et al., 1998; Weston et al., 2004; Ebermann et al., 2007). Apenas um gene, CLRN1, foi identificado como responsável pelo tipo III (Joensuu et al., 2001). Adicionalmente, três outros genes foram relacionados à síndrome de Usher. Foi proposto que o gene PDZD7 poderia contribuir para herança digênica, juntamente com o gene GPR98, modificando a gravidade da doença em pacientes com síndrome de Usher tipo II (Ebermann et al., 2010). Recentemente, uma mutação bialélica no gene HARS foi identificada em dois pacientes com síndrome de Usher tipo III e, o gene CEP250 foi relacionado a uma forma atípica da síndrome de Usher (Puffenberger et al., 2012; Khateb et al., 2014).
A síndrome de Pendred é o segundo tipo mais comum de perda auditiva sindrômica de herança autossômica recessiva (Smith et al., 2014). As características clássicas incluem perda auditiva neurossensorial, congênita, de grau severo a profundo, e disfunção tireoidiana com presença de bócio. Além disso, podem ocorrer malformações na orelha interna como aqueduto vestibular alargado ou displasia de Mondini e, em alguns casos, alteração da função vestibular (Pendred, 1896). Mutações no gene SLC26A4 causam síndrome de Pendred, mas também podem estar associadas à perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva (DFNB4) (Everett et al., 1997; Li et al., 1998). Foi proposto que herança digênica envolvendo o gene SLC26A4 e os genes FOXI1 ou KCNJ10 pode estar relacionada à síndrome de Pendred, porém parece ser bastante rara (Chen et al., 2012; Cirello et al., 2012; Landa et al., 2013).
A síndrome de Jervell e Lange-Nielsen é o terceiro tipo mais comum de perda auditiva sindrômica de herança autossômica recessiva (Smith et al., 2014). Ela consiste de perda auditiva congênita e prolongação do intervalo QT, detectada por eletrocardiograma. Os indivíduos afetados apresentam episódios de síncope e podem ter morte súbita (Jervell &
Lange-Nielsen, 1957). Mutações em dois genes têm sido descritas em indivíduos com síndrome de Jervell e Lange-Nielsen, são eles: KCNQ1 e KCNE1 (Neyroud et al., 1997; Tyson et al.,1997; Schulze-Bahr et al., 1997).
A síndrome de Waardenburg (WS) é a forma mais comum de perda auditiva sindrômica de herança autossômica dominante (Smith et al., 2014). As principais características incluem perda auditiva neurossensorial, congênita, de grau variável, e alterações de pigmentação da pele, cabelo e olhos (Waardenburg, 1951). São reconhecidos quatro tipos clínicos diferentes: síndrome de Waardenburg tipo I (WS1), tipo II (WS2), tipo III (WS3) e tipo IV (WS4) – com base na presença de outras anomalias. Os tipos I e II compartilham muitas características, porém há uma importante diferença fenotípica: WS1 é caracterizado pela presença de telecanto (dystopia canthorum – deslocamento lateral do canto interno do olho), enquanto WS2 caracteriza-se pela sua ausência. Em WS3, estão presentes dystopia canthorum e anormalidades nos membros superiores, e em WS4, ocorre a doença de Hirschsprung, uma desordem digestiva relacionada à diminuição da motilidade intestinal causada pela ausência congênita das células nervosas do sistema nervoso entérico (Read & Newton, 1997). Mutações no gene PAX3 são responsáveis por WS1 e WS3 (Tassabehji et al., 1992; Hoth et al., 1993). Já os genes MITF e SNAI2 (SLUG) estão envolvidos em alguns casos de WS2 (Tassabehji et al., 1994; Sánchez-Martín et al., 2002). E mutações nos genes EDNRB, EDN3 e SOX10 estão associadas à WS4 (Attié et al., 1995; Edery et al., 1996; Pingault et al., 1998).
A síndrome Branquio-oto-renal (BOR) é o segundo tipo mais comum de perda auditiva sindrômica de herança autossômica dominante (Smith et al., 2014). Ela é caracterizada por perda auditiva condutiva, neurossensorial ou mista em associação a cistos ou fístulas da fenda branquial, malformações da orelha externa, média ou interna, e anomalias renais. Mutações no gene EYA1 são encontradas em cerca de 40% dos indivíduos com síndrome de BOR, porém alterações patogênicas nos genes SIX1 e SIX5 também podem estar envolvidas (Abdelhak et al., 1997; Ruf et al., 2004; Hoskins et al., 2007).
A síndrome de Alport consiste em perda auditiva neurossensorial progressiva, de grau variável e manifestação após a primeira década de vida, glomerulonefrite resultando em falência renal progressiva, e alterações oftalmológicas variáveis (Alport, 1927; Kashtan, 1999). Já foram reportadas formas de herança autossômica dominante, autossômica recessiva e ligada ao cromossomo X. Aproximadamente 85% dos casos de síndrome de Alport são de herança ligada ao cromossomo X, causados por mutações no gene COL4A5. Mutações nos
genes COL4A3 e COL4A4 são resonsáveis por herança autossômica recessiva e dominante (Barker et al., 1990; Mochizuki et al., 1994; Lemmink et al., 1997; van der Loop et al., 2000).
3.2. Perdas auditivas não-sindrômicas
A maioria dos casos de perda auditiva hereditária é não-sindrômica, aproximadamente 70% (Hilgert et al., 2009a). Até o momento, já foram descritos cerca de 140 loci e 80 genes envolvidos com perdas auditivas não-sindrômicas (van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage. <http://hereditaryhearingloss.org>).
Os diferentes loci ou regiões candidatas a apresentarem um ou mais genes associados à surdez não-sindrômica recebem o prefixo DFN (oriundo do inglês deafness), seguido de um número que indica a ordem em que foram descobertos. As mutações genéticas conhecidas que levam à surdez podem ser de herança autossômica recessiva (DFNB), autossômica dominante (DFNA), ligada ao cromossomo X (DFNX) ou mitocondrial (Dror & Avraham, 2009). Além disso, dois loci foram identificados como modificadores (do inglês modifiers), sendo denominados DFNM1 e DFNM2 (Riazuddin et al., 2000; Bykhovskaya et al., 2000).
Em relação aos mecanismos de herança, estima-se que aproximadamente 80% dos casos de surdez genética não-sindrômica sejam de herança autossômica recessiva, 20% autossômica dominante e cerca de 1 a 2% ligada ao cromossomo X. Além disso, a frequência da herança mitocondrial é estimada em 1% (Kokotas et al., 2007; Hilgert et al., 2009a; Smith et al., 2014).
3.2.1. Herança autossômica recessiva
A maioria dos casos de perda auditiva hereditária não-sindrômica manifestam-se como formas autossômicas recessivas (80%). As perdas auditivas não-sindrômicas de herança autossômica recessiva normalmente são neurossensoriais, de manifestação pré-lingual, estacionárias, de grau severo a profundo e geralmente atingem todas as frequências (Hilgert et al., 2009a; Smith et al., 2014).
Cerca de 80 loci já foram mapeados e 60 genes foram identificados em associação a esse padrão de herança (van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage. <http://hereditaryhearingloss.org>). Os loci e genes envolvidos com a perda auditiva autossômica recessiva estão listados na Tabela 2.
Tabela 2. Genes e loci relacionados à perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica recessiva (Adaptado de van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage. <http://hereditaryhearingloss.org>).
Locus Gene Localização cromossômica DFNB1A GJB2 13q12 DFNB1B GJB6 13q12 DFNB2 MYO7A 11q13.5 DFNB3 MYO15A 17p11.2 DFNB4 SLC26A4 7q31 DFNB5 Desconhecido 14q12 DFNB6 TMIE 3p14-p21 DFNB7/11 TMC1 9q13-q21 DFNB8/10 TMPRSS3 21q22 DFNB9 OTOF 2p22-p23 DFNB12 CDH23 10q21-q22 DFNB13 Desconhecido 7q34-36 DFNB14 Desconhecido 7q31 DFNB15/72/95 GIPC3 19p13.3 DFNB16 STRC 15q21-q22 DFNB17 Desconhecido 7q31 DFNB18 USH1C 11p14-15.1 DFNB18B OTOG 11p15.1 DFNB19 Desconhecido 18p11 DFNB20 Desconhecido 11q25 DFNB21 TECTA 11q DFNB22 OTOA 16p12.2 DFNB23 PCDH15 10q21-q22 DFNB24 RDX 11q23 DFNB25 GRXCR1 4p13 DFNB26 Desconhecido 4q31 DFNB27 Desconhecido 2q23-q31 DFNB28 TRIOBP 22q13 DFNB29 CLDN14 21q22 DFNB30 MYO3A 10p11.1 DFNB31 WHRN 9q32-q34 DFNB32/82 GPSM2 1p13.3-22.1 DFNB33 Desconhecido 9q34.3 DFNB35 ESRRB 14q24.1-24.3 DFNB36 ESPN 1p36.3 DFNB37 MYO6 6q13 DFNB38 Desconhecido 6q26-q27 DFNB39 HGF 7q21.1 DFNB40 Desconhecido 22q DFNB42 ILDR1 3q13.31-q22.3 DFNB44 ADCY1 7p14.1-q11.22 DFNB45 Desconhecido 1q43-q44 DFNB46 Desconhecido 18p11.32-p11.31 DFNB47/83 Desconhecido 2p25.1-p24.3 DFNB48 CIB2 15q23-q25.1
Locus Gene Localização cromossômica DFNB49 MARVELD2/TRIC BDP1 5q12.3-q14.1 DFNB51 Desconhecido 11p13-p12 DFNB53 COL11A2 6p21.3 DFNB55 Desconhecido 4q12-q13.2 DFNB59 PJVK 2q31.1-q31.3 DFNB61 SLC26A5 7q22.1 DFNB62 Desconhecido 12p13.2-p11.23 DFNB63 LRTOMT/COMT2 11q13.2-q13.4 DFNB65 Desconhecido 20q13.2-q13.32 DFNB66 DCDC2 6p21.2-22.3 DFNB66/67 LHFPL5 6p21.31 DFNB68 Desconhecido 19p13.2 DFNB70 PNPT1 2p16.1 DFNB71 Desconhecido 8p22-21.3 DFNB73 BSND 1p32.3 DFNB74 MSRB3 12q14.2-q15 DFNB76 SYNE4 19q13.12 DFNB77 LOXHD1 18q12-q21 DFNB79 TPRN 9q34.3 DFNB80 Desconhecido 2p16.1-p21 DFNB81 Desconhecido 19p DFNB84 PTPRQ OTOGL 12q21.31 DFNB85 Desconhecido 17p12-q11.2 DFNB86 TBC1D24 16p13.3 DFNB88 ELMOD3 2p12-p11.2 DFNB89 KARS 16q21-q23.2 DFNB90 Desconhecido 7p22.1-p15.3 DFNB91 SERPINB6 6p25 DFNB93 CABP2 11q12.3-q13.2 DFNB94 NARS2 - DFNB96 Desconhecido 1p36.31-p36.13 DFNB97 MET 7q31.2-q31.31 DFNB98 TSPEAR 21q22.3 DFNB99 TMEM132E 17q12 DFNB101 GRXCR2 5q32 DFNB102 EPS8 12p12.3 DFNB103 CLIC5 6p21.1 - FAM65B 6p22.3
O gene GJB2 está localizado na região cromossômica 13q11-12, no locus DFNB1. Este locus foi mapeado em 1994, sendo o primeiro locus relacionado à surdez de herança autossômica recessiva (Guilford et al., 1994). O gene GJB2 foi clonado em 1997, o que representou um marco importante nos estudos genéticos relacionados à surdez. Ele foi o primeiro gene nuclear associado à perda auditiva não-sindrômica (Kelsell et al., 1997).
