Perdas auditivas de herança autossômica recessiva

3.1.1. Gene CDH23 (Locus DFNB12)

O gene CDH23 apresenta 69 éxons e está localizado na região cromossômica 10q21- q22 (Chaib et al., 1996b; Bolz et al., 2001). Codifica a proteína caderina 23, uma glicoproteína de adesão celular dependente de cálcio, expressa nos estereocílios das células ciliadas (internas e externas), membrana de Reissner e nas células fotorreceptoras da retina (Siemens et al., 2002). A estrutura da caderina 23 é formada por 3354 aminoácidos, sendo composta por um peptídeo sinal na região amino terminal, 27 domínios extracelulares (de

ligação de cálcio), um único domínio transmembrânico e um domínio citoplasmático curto na região carboxi terminal (Bolz et al., 2001). A Figura 14 ilustra a estrutura da caderina 23.

Figura 14. Representação esquemática da estrutura da caderina 23. N: região N- terminal. SP: peptídeo sinal. EC: domínios extracelulares. TM: domínio transmembrânico. CT: domínio citoplasmático. C: região C-terminal.

Mutações no gene CDH23 podem ser responsáveis tanto por perda auditiva não- sindrômica autossômica recessiva (DFNB12), quanto por síndrome de Usher tipo 1D (USH1D) (Bork et al., 2001). Até o momento já foram descritas mais de 210 alterações patogênicas nesse gene (Stenson et al., 2003. HGMD. <http://www.hgmd.org>).

Indivíduos com perda auditiva não-sindrômica (DFNB12) apresentam deficiência auditiva neurossensorial bilateral, pré-lingual, de grau moderado a profundo, com função vestibular normal e sem outros sinais clínicos. Já indivíduos com síndrome de Usher (USH1D) apresentam perda auditiva neurossensorial profunda, retinitis pigmentosa e disfunção vestibular. O início da degeneração na retina geralmente ocorre durante a primeira década de vida, com perda progressiva da visão periférica e, em alguns casos, evolui para uma perda total da visão.

Correlações genótipo-fenótipo sugerem que mutações missense ou in-frame no gene CDH23 levam à perda auditiva não-sindrômica, enquanto mutações nonsense ou frameshift causam síndrome de Usher, embora essa relação não seja absoluta (Bork et al., 2001).

Foi sugerido que a síndrome de Usher é causada por defeitos no desenvolvimento do feixe de esterecílios, enquanto a perda auditiva não-sindrômica por defeitos nos tip-links (Schwander et al., 2009).

O diagnóstico molecular pode auxiliar na identificação precoce da síndrome de Usher, o que é importante para fornecer informações para a escolha das modalidades de comunicação e acompanhamento das perdas auditiva e visual.

3.1.1.1. Família 1

Para probando da Família 1 foram encontradas as mutações p.L627Rfs*10 e p.D990N em heterozigose nos éxons 17 e 25, respectivamente, do gene CDH23.

Após o sequenciamento do éxon 25 foi confirmada a alteração c.2968G>A, que resulta ns substituição do aminoácido ácido aspártico por asparagina no códon 990 (p.D990N). A alteração foi descrita previamente por Bork e col. (2001), associada à perda auditiva não sindrômica de herança autossômica recessiva. Essa mutação afeta um resíduo altamente conservado do domínio extracelular 9 (domínio de ligação de cálcio) da caderina 23. A Figura 15 mostra o resultado do sequenciamento.

Figura 15. Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.2968G>A – p.D990N em heterozigose no éxon 25 do gene CDH23.

Para confirmação da mutação c.1880delT (p.L627Rfs*10) no éxon 17 do gene CDH23 foi realizada a clonagem do produto de PCR em plasmídeos para separação dos dois alelos e posterior sequenciamento. A clonagem foi realizada utilizando o The Original TA Cloning Kit pCR® 2.1 Vector (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) e os plasmídeos foram amplificados com XL1-Blue Competent Cells (Agilent Technologies, Santa Clara, Estados Unidos), de acordo com protocolo recomendado pelo fabricante. Após obtenção das colônias de bactérias transformadas com os plasmídeos recombinantes, foi realizada purificação com QIAprep Miniprep Kit (Qiagen, Valencia, Estados Unidos). Posteriormente as amostras foram sequenciadas e os resultados obtidos estão apresentados na Figura 16. Essa mutação está sendo descrita pela primeira vez no presente estudo. Trata-se da deleção de um nucleotídeo timina na posição 1880 do gene, levando à alteração no quadro de leitura. Com isso, o aminoácido leucina é convertido à arginina no códon 627, e um códon de terminação prematura é formado na posição 637 (p.L627Rfs*10). Essa mutação afeta um resíduo altamente conservado do domínio extracelular 6 (domínio de ligação de cálcio) da proteína caderina 23.

A

B

Figura 16. Resultados do sequenciamento do éxon 17 do gene CDH23 após clonagem dos fragmentos. A: Eletroferograma mostrando a sequência sem a mutação. B: Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.1880delT – p.L627Rfs*10.

O paciente é um caso esporádico, que apresenta perda auditiva profunda pré-lingual. Os testes audiológicos mostraram ausência de potenciais evocados auditivos de tronco encefálico (PEATE) e de emissões otoacústicas (EOAs). Apesar de mutações frameshift no gene CDH23 estarem associadas à síndrome de Usher (Bork et al., 2001), o mesmo não apresenta sintomas oftalmológicos até o momento. Porém, como o paciente é bastante jovem e o desenvolvimento da retinitis pigmentosa pode ocorrer tardiamente, os resultados moleculares podem estar contribuindo para o diagnóstico precoce da síndrome de Usher. Dessa forma, o mesmo foi encaminhado para acompanhamento oftalmológico.

As alterações genéticas também foram investigadas nos pais, que apresentavam audição normal. A mutação p.L627Rfs*10 foi detectada em heterozigose no pai e a mutação p.D990N foi identificada em heterozigose na mãe, confirmando assim a segregação das mutações com o fenótipo da perda auditiva na família. A Figura 17 mostra o heredograma da Família 1 com o genótipo dos indivíduos analisados.

Figura 17. Heredograma da Família 1 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type (alelo normal).

3.1.1.2. Família 7

Para o probando da Família 7 foram encontradas as mutações p.E2520K e p.A2637P em heterozigose nos éxons 53 e 55, respectivamente, do gene CDH23. Após o sequenciamento do éxon 53 foi confirmada a alteração c.7558G>A, que resulta na substituição do aminoácido ácido glutâmico por lisina no códon 2520 (p.E2520K). E no éxon 55 foi confirmada a c.7909G>C, que leva à substituição do aminoácido alanina por prolina no códon 2637 (p.A2637P). A Figura 18 mostra os resultados do sequenciamento para confirmação das mutações no gene CDH23.

A

B

Figura 18. Análise do DNA do probando da Família 7. A: Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.7558G>A – p.E2520K em heterozigose no éxon 53 do gene CDH23. B: Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.7909G>C – p.A2637P em heterozigose no éxon 55 do gene CDH23.

As duas mutações estão sendo descritas pela primeira vez no presente estudo. Ambas afetam resíduos funcionais altamente conservados de domínios de ligação de cálcio (domínio extracelular 24 e domínio extracelular 25, respectivamente).

As alterações foram investigadas no irmão e nos pais do probando. A mutação p.E2520K foi detectada em heterozigose na mãe e a p.A2637P foi identificada em heterozigose no pai, sendo o irmão heterozigoto composto. Tanto o probando quanto o irmão apresentam síndrome de Usher (perda auditiva profunda e retinitis pigmentosa de início tardio), já os pais não apresentam nenhuma manifestação clínica. Dessa forma, foi confirmada a segregação das mutações com o fenótipo na família. A Figura 19 mostra o heredograma da Família 7 com o genótipo dos indivíduos analisados.

Figura 19. Heredograma da Família 7 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type (alelo normal).

3.1.2. Gene OTOF (Locus DFNB9)

O gene OTOF está localizado no locus DFNB9, na região cromossômica 2p22-23, e codifica a proteína otoferlina (Chaib et al., 1996a; Yasunaga et al., 1999). Apresenta 48 éxons e codifica múltiplas isoformas da proteína, longas e curtas, por splicing alternativo combinado com o uso de vários sítios de iniciação transcricional (Figura 20) (Yasunaga et al., 2000).

Figura 20. Esquema representativo da estrutura dos éxons e íntrons do gene da otoferlina (topo), destacando as regiões genômicas compreendidas entre os éxons 18-22 nas diferentes isoformas, em humanos e camundongos (abaixo). As regiões codificantes dos éxons estão representadas por retângulos pretos e as regiões não traduzidas estão representadas em branco (Adaptado de: Yasunaga et al., 2000).

A otoferlina é uma proteína citosólica ancorada à membrana por um segmento transmembrânico localizado próximo à região C-terminal. A isoforma longa apresenta 1997 aminoácidos e possui seis domínios C2. Esses domínios têm a capacidade de se ligar a cálcio e fosfolipídeos (Figura 21).

Figura 21. Representação ilustrativa da estrutura da otoferlina (isoforma longa), evidenciando os seis domínios C2 (C2A-C2F). N: região N- terminal. TM: domínio transmembrânico. C: região C-terminal.

A otoferlina é expressa nas células ciliadas e está envolvida na liberação de vesículas contendo neurotransmissores nas termições sinápticas das células ciliadas internas (Yasunaga et al., 1999, 2000; Roux et al., 2006).

Tem sido proposto que a otoferlina é um sensor-chave de íons cálcio, que está diretamente implicado na exocitose e modulação da fusão de vesículas sinápticas cálcio- dependentes. No entanto, a sua função exata nesse processo ainda não é bem compreendida (Roux et al., 2006; Ramakrishnan et al., 2014).

Mutações no gene OTOF são responsáveis por um fenótipo bastante homogêneo de surdez não-sindrômica de herança autossômica recessiva (DFNB9), que consiste em perda auditiva pré-lingual, bilateral, severa a profunda, sem associação com malformações na orelha interna. E ainda, muitos indivíduos afetados apresentam neuropatia auditiva, caracterizada por função normal das células ciliadas externas e alteração na condução neural da via auditiva (Starr et al., 1996; Yasunaga et al., 1999).

Atualmente já foram reportadas cerca de 110 variantes patogênicas nesse gene (Stenson et al., 2003. HGMD. <http://www.hgmd.org>). A maioria dessas mutações é particular, cada uma sendo relatada em apenas uma família. Entretanto, uma exceção notável é a p.Q829X (c.2485C>T), a mutação mais frequente identificada no gene OTOF e a terceira causa mais comum de perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica recessiva, na população espanhola (Migliosi et al., 2002; Rodríguez-Ballesteros et al., 2003; 2008), sendo também identificada em dois franceses, um mexicano, dois argentinos e em um paciente inglês (Reynoso et al., 2004; Rouillon et al., 2006; Varga et al., 2006). Porém, a mutação p.Q829X parece não ser uma causa frequente de surdez na população brasileira (Oliveira et al., 2007; Romanos et al., 2009).

3.1.2.1. Família 3

Para o probando da Família 3 foi encontrada a mutação p.I1573T em homozigose no éxon 39 do gene OTOF. Após o sequenciamento do éxon 39 foi confirmada a alteração c.4718T>C, que leva à substituição do aminoácido isoleucina por treonina no códon 1573 (p.I1573T). A mutação foi descrita previamente por Duman e col. (2011) e Yildirim-Baylan e col. (2014), associada à perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica recessiva e neuropatia auditiva. A alteração foi investigada nos pais e no irmão do paciente, sendo detectada em heterozigose nos pais e, em homozigose no irmão. A Figura 22 mostra os resultados do sequenciamento.

A

B

Figura 22. Resultados do sequenciamento para confirmação da mutação no éxon 39 do gene OTOF. A: Análise do DNA do pai do probando da Família 3. Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.4718T>C – p.I1573T em heterozigose. B: Análise do DNA do probando. Eletroferograma mostrando a mutação em homozigose.

O paciente e o irmão apresentam perda auditiva congênita, de grau moderado a severo. Potenciais evocados auditivos de tronco encefálico (PEATE) estão ausentes nos dois indivíduos, no entanto, emissões otoacústicas (EOAs) estão presentes no probando e ausentes no irmão. Apesar da ausência de EOAs no irmão, o fenótipo é sugestivo de neuropatia auditiva, já que EOAs podem desaparecer ao longo do tempo. Os pais apresentam audição normal e são apenas portadores da mutação, confirmando assim a segregação na família. A Figura 23 mostra o heredograma da Família 3 com o genótipo dos indivíduos analisados.

Figura 23. Heredograma da Família 3 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type (alelo normal).

3.1.2.2. Família 17

O probando da Família 17 é um caso esporádico, que apresenta perda auditiva congênita profunda e diagnóstico clínico de neuropatia auditiva. Para esse paciente foram encontradas as mutações p.W718X e p.D1709Efs*54 em heterozigose nos éxons 19 e 42, respectivamente, do gene OTOF.

Após o sequenciamento do éxon 19 foi confirmada a alteração c.2153G>A, que resulta na substituição do aminoácido triptofano por um códon de terminação prematura na posição 718 (p.W718X). Essa mutação está descrita como patogênica em bases de dados e está associada à perda auditiva (Cunningham et al., 2015. <http://www.ensembl.org>). No éxon 42 foi confirmada a alteração c.5127delC, que está sendo descrita pela primeira vez no presente estudo. Trata-se da deleção de um nucleotídeo citosina na posição 5127 do gene, provocando alteração no quadro de leitura. Com isso, o aminoácido ácido aspártico é convertido a ácido glutâmico no códon 1709 e um códon de terminação prematura é formado na posição 1763 (p.D1709Efs*54). A Figura 24 mostra os resultados do sequenciamento para confirmação das mutações no gene OTOF.

A:

B:

Figura 24. Análise do DNA do probando da Família 17. A: Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.2153G>A – p.W718X em heterozigose no éxon 19 do gene OTOF. B: Eletroferograma mostrando em destaque a mutação c.5127delC – p.D1709Efs*54 em heterozigose no éxon 42 do gene OTOF.

As alterações também foram investigadas na mãe, na irmã e no tio da paciente, que apresentavam audição normal. A mutação p.W718X foi detectada em heterozigose na irmã e a mutação p.D1709Efs*54 foi identificada em heterozigose na mãe, confirmando assim, a segregação das mutações com o fenótipo da perda auditiva na família. A Figura 25 mostra o heredograma da Família 17 com o genótipo dos indivíduos analisados.

Figura 25. Heredograma da Família 17 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type (alelo normal).

Também foi identificada a mutação c.35delG no gene GJB2, que já havia sido encontrada na triagem genética inicial. Como havia sido observado anteriormente, não foi detectada nenhuma alteração no outro alelo do gene GJB2, e dessa forma, não foi possível estabelecer a relação da mutação c.35delG com o fenótipo do paciente. Além disso, a mutação não segregou com a perda auditiva na família.

3.2. Perdas auditivas de herança autossômica dominante

3.2.1. Gene DFNA5

O gene DFNA5 apresenta 10 éxons e está localizado na região cromossômica 7p15.3. Codifica uma proteína indutora de apoptose, expressa na cóclea, mais especificamente na estria vascular, que está envolvida não apenas na via auditiva, mas também na biologia tumoral. Ela apresenta 496 aminoácidos e pertence à família das gasderminas (van Camp et al., 1995; van Laer et al., 1998; Op de Beeck et al., 2011).

Mutações no gene DFNA5 estão associadas à perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica dominante, bilateral, progressiva, de início tardio, atingindo primeiramente as altas frequências e se tornando mais grave com o avanço da idade (Chai et al., 2014; Smith et al., 2014).

Até o momento foram reportadas sete mutações em pacientes com deficiência auditiva (Stenson et al., 2003. HGMD. <http://www.hgmd.org>). A maioria dessas alterações está localizada nos íntrons 7 ou 8 e levam à perda do éxon 8, resultando na terminação prematura da proteína codificada. A Figura 26 mostra a estrutura do gene DFNA5, indicando a localização das mutações descritas até o momento.

Figura 26. Esquema ilustrativo da estrutura dos éxons e íntrons do gene DFNA5, evidenciando as mutações descritas até o momento. Os éxons estão representados por retângulos, sendo que as regiões codificantes estão marcadas em azul e as regiões não traduzidas em branco.

Foi sugerido que a perda auditiva associada a mutações no gene DFNA5 provavelmente é causada por um mecanismo de ganho de função, especificamente relacionado à perda do éxon 8, que resulta em uma nova função deletéria (Gregan et al., 2003; van Laer et al., 2004).

3.2.1.1. Família 8

Para o probando da Família 8 foi encontrada a mutação c.991-2A>G em heterozigose no sítio de splice do gene DFNA5 (íntron 7). Após o sequenciamento dessa região foi confirmada a alteração do nucleotídeo adenina para guanina na posição -2 do íntron 7 do gene DFNA5, levando à alteração no sítio aceptor de splice. Essa alteração leva à perda do éxon 8, resultando na terminação prematura do quadro de leitura. A mutação foi descrita recentemente por Chai e col. (2014), associada à perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica dominante. A alteração foi investigada em outros oito indivíduos da família com perda auditiva e em um familiar com audição normal. A Figura 27 mostra os resultados do sequenciamento.

A:

B:

Figura 27. Resultados do sequenciamento para confirmação da mutação c.991-2A>G no gene DFNA5. A: Análise do DNA do probando da Família 8. Eletroferograma mostrando em destaque a mutação em heterozigose. B: Análise do DNA do indivíduo IV:2. Eletroferograma mostrando a sequência sem a mutação.

Os indivíduos acometidos apresentam perda auditiva progressiva, de grau moderado a severo, inicialmente afetando as frequências altas e com idade de início variando entre 15 e 35 anos. A mutação segregou com o fenótipo da perda auditiva na família. A Figura 28 mostra o heredograma da Família 8 com o genótipo dos indivíduos analisados.

Figura 28. Heredograma da Família 8 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type (alelo normal).

Também foi identificada a mutação p.E147K no gene GJB2, que já havia sido encontrada na triagem genética inicial. Como havia sido observado anteriormente, não foi detectada nenhuma alteração no outro alelo do gene GJB2, e dessa forma, não foi possível estabelecer a relação da mutação p.E147K com o fenótipo do paciente. Além disso, a mutação não segregou com a perda auditiva na família.

3.2.2. Gene ACTG1

O gene ACTG1 apresenta seis éxons (Figura 29) e está localizado na região cromossômica 17q25.3. Codifica a proteína gama-actina 1, que é constituída por 375 aminoácidos (Chou et al., 1987; Erba et al., 1988; Ueyama et al., 1996). Essa proteína é um componente do citoesqueleto e mediadora da motilidade celular interna, predominantemente expressa nas células auditivas, bem como em células epiteliais intestinais (Khaitlina, 2001).

Figura 29. Ilustração da estrutura dos éxons e íntrons do gene ACTG1. Os éxons estão representados por retângulos, sendo que as regiões codificantes estão marcadas em cinza e as regiões não traduzidas em branco.

A perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica dominante DFNA20/26 está associada a mutações missense no gene ACTG1 (Zhu et al., 2003), que apresenta atualmente 21 alterações patogênicas descritas (Stenson et al., 2003. HGMD. <http://www.hgmd.org>).

A deficiência auditiva envolvida é do tipo neurossensorial, bilateral, progressiva, com início nas altas frequências, durante as três primeiras décadas de vida. Conforme o avanço na idade, a progressão da perda auditiva leva à surdez profunda atingindo todas as frequências, normalmente mantendo uma configuração inclinada. Variações fenotípicas na idade de início e nível de progressão podem ser decorrentes de fatores ambientais e genéticos ou do efeito da mutação na proteína.

Acredita-se que mutações nesse gene interfiram na regulação e dinâmica da actina, e podem causar perda auditiva por dificultar o reparo ou a estabilidade das estruturas celulares cocleares danificadas por ruído excessivo ou envelhecimento (Zhu et al., 2003; Bryan & Rubenstein, 2009; Kruth & Rubenstein, 2012).

3.2.2.1. Família 13

Para o probando da Família 13 foi encontrada a mutação p.K118M em heterozigose no éxon 3 do gene ACTG1. Após o sequenciamento do éxon 3 foi confirmada a alteração c.353A>T, que resulta na substituição do aminoácido lisina por metionina no códon 118 (p.K118M). A mutação foi previamente descrita em associação à perda auditiva progressiva de herança autossômica dominante. A alteração foi investigada em outros sete indivíduos da família com perda auditiva e em sete familiares com audição normal. A Figura 30 mostra os resultados do sequenciamento.

A:

B:

Figura 30. Resultados do sequenciamento para confirmação da mutação c.353A>T – p.K118M no éxon 3 do gene ACTG1. A: Análise do DNA do probando da Família 13. Eletroferograma mostrando em destaque a mutação em heterozigose. B: Análise do DNA do indivíduo III:6. Eletroferograma mostrando a sequência sem a mutação.

A perda auditiva na família é progressiva, de grau moderado a profundo, inicialmente afetando as frequências altas, com idade de início na segunda década de vida, e segregou com a mutação p.K118M no gene ACTG1. A Figura 31 mostra o heredograma da Família 13 com o genótipo dos indivíduos analisados.

Figura 31. Heredograma da Família 13 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type (alelo normal).

Também foi identificada a mutação p.K168R no gene GJB2, que já havia sido encontrada na triagem genética inicial. Como havia sido observado anteriormente, não foi detectada nenhuma alteração no outro alelo do gene GJB2, e dessa forma, não foi possível estabelecer a relação da mutação p.K168R com o fenótipo do paciente. Além disso, a mutação não segregou com a perda auditiva na família.

3.2.3. Gene COCH

O gene COCH está localizado na região cromossômica 14q11.2-q13 e apresenta 12 éxons. Codifica a coclina, uma proteína de matriz extracelular, que apresenta 550 aminoácidos. A coclina é formada por um pepitídeo sinal na extremidade N-terminal, um domínio LCCL (do inglês Limulus factor C, cochlear protein Coch-5b2, late gestation lung protein Lgl1), dois domínios vWFA (do inglês von Willebrand factor A-like) e dois domínios curtos intermediários (ivd, do inglês intervening domain) (Robertson et al., 1997; Bae et al., 2014). A Figura 32 ilustra a estrutura da coclina, evidenciando seus domínios.

Figura 32. Representação esquemática da estrutura da coclina, mostrando o pepitídeo sinal (SP) na região N- terminal (N), o domínio LCCL (Limulus factor C, cochlear protein Coch-5b2, late gestation lung protein Lgl1), os dois domínios curtos intermediários (ivd 1 e 2) e os dois domínios von Willebrand factor A-like (vWFA1 e vWFA2). C: região C- terminal. O domínio LCCL se extende do éxon 4 ao 6, o vWFA1 do éxon 8 ao 10 e o vWFA2 do éxon 11 ao 12.

Mutações no gene COCH são responsáveis por perda auditiva não-sindrômica autossômica dominante com disfunção vestibular (DFNA9). A coclina é expressa em níveis elevados nos fibrócitos do limbo espiral e do ligamento espiral, e na membrana basilar da cóclea, no entanto, seu papel fisiológico na orelha interna não está claro (Robertson et al., 1998, 2001; Kommareddi et al., 2007).

Ate o momento já foram descritas mais de 20 mutações no gene COCH, a maioria do tipo missense (Stenson et al., 2003. HGMD. <http://www.hgmd.org>). A perda auditiva associada a mutações nesse gene geralmente é neurossensorial, progressiva, afetando inicialmente as altas frequências, com início entre a segunda e quarta década de vida. Além do acometimento coclear, os pacientes também apresentam comprometimento vestibular, que