1 - Otimização das condições cromatográficas
Os estudos investigando a influência de diferentes concentrações de ácido na fase móvel e programação (gradiente e fluxo da fase móvel) na separação dos compostos fenólicos indicaram que a melhor resolução foi obtida a um fluxo de 1,1 mL/min, concentração de ácido a 2 % e gradiente, conforme ilustrado na Tabela 20. O retorno às condições iniciais de gradientes e seu equilíbrio antes da injeção de nova amostra foi de fundamental importância, considerando que as concentrações das fases móveis variaram acentuadamente (de 0 a 100 %), o que exigiu maior estabilidade do aparelho. A concentração de 100 % de metanol permaneceu em sistema isocrático durante 10 minutos para melhor segurança de que todos os compostos presentes na amostra tivessem sido eluídos.
Tabela 20 -
Gradiente de eluição das fases móveis para a determinação decompostos fenólicos TEMPO
(min) FASES MÓVEIS
1 (%) A B Período de eluição 0,01 90 10 15 67 33 30 67 33 40 45 55 52 0,0 100 62 0,0 100 Retorno 78 90 10 Equilíbrio 93 90 10
1 Fases móveis - A: ácido acético a 2 % e B: metanol a 2 % de ácido acético.
Na Figura 44 mostra-se o cromatograma da solução-padrão de compostos fenólicos. Observa-se uma boa resolução entre os picos. As médias dos coeficientes de variação do
tempo de retenção, calculados pela injeção de solução padrão em triplicata, variaram de 0,17 a 0,79 % (Tabela 21).
Figura 44
- Separação cromatográfica dos compostos fenólicos em solução-padrão - ácido gálico (3,0 mg/L); ácido vanílico (3,5 mg/L); ácido siríngico (1,5 mg/L);siringaldeído
(2,5 mg/L); vanilina (5,0 mg/L); coniferaldeído (10,0 mg/L); sinapaldeído (10 mg/L) e ácido
elágico (14 mg/L). Condições cromatográficas: solventes A (ácido acético 2%); B (metanol
em ácido acético a 2%); detecção (280/313 nm); fluxo (1,1 mL/min.); coluna Shimadzu, HRC,
C 18, 5 µm, 250 x 4,6 mm.
Tabela 21 -
Parâmetros cromatográficos dos padrões de compostos fenólicosCOMPOSTOS
FENÓLICOS SOLUÇÃO PADRÃO
TR1 (min) Variação TR2 (min) K’3 CV%4 Ácido gálico 5,19 0,041 0,87 0,79 Ácido vanílico 16,60 0,03 5,02 0,17 Ácido siríngico 18,19 0,06 5,58 0,31 Siringaldeído 20,30 0,06 6,35 0,29 Vanilina 24,78 0,09 7,87 0,38 Coniferaldeído 26,86 0,14 8,72 0,51 Sinapaldeído 27,18 0,12 8,99 0,46 Ácido elágico 40,20 0,16 13,56 0,40
1 TR: tempo de retenção; 2 Calculado a partir de 6 injeções;
3 K’: fator de capacidade (K’= TR - To/ To, em que To = tempo morto); 4 CV: coeficiente de variação.
Os fatores de capacidade K’ variaram de 0,87 a 13,56. Embora o ácido gálico tenha apresentado um K’ pouco menor que 1,0, não ocorreram dificuldades em sua identificação na mistura de padrões e amostras.
Apesar de terem sido testados vários gradientes e diferentes concentrações de ácido das fases móvel, a resolução entre os compostos coniferaldeído e sinapaldeídos foi menor que 1,0 min. Estes aldeídos são derivados do ácido cinâmico e se diferenciam por um grupo metóxi a mais na estrutura do sinapaldeído (Figura 13, Revisão da Literatura, p. 48). Devido à pequena diferença entre as polaridades dos dois compostos, possivelmente outros tipos de colunas proporcionassem melhores resoluções (MEYER, 1993; ROGGERO et al., 1991). Diferenças de tempos de retenção menores que 1,0 min foram também encontradas por SARNI et al. (1990a) entre ácido siríngico e vanilina, ao usarem como fase móvel o ácido trifluoracético 0,15 % em água/metanol, coluna Knauer e comprimento de onda 280/320 nm. O ácido siríngico e a vanilina são derivados do ácido benzóico.
O ácido siríngico possui em sua estrutura um grupamento -CO a mais que a vanilina, além do grupo ácido em substituição ao aldeído (Figura 13, p. 48). Assim, como na resolução do coniferaldeído e sinapaldeído, possivelmente a coluna, a fase móvel, a concentração de ácido, ou mesmo o gradiente, tenham influenciado na obtenção de melhor resolução para estes compostos.
A confirmação da identidade do pico foi realizada adicionando-se compostos fenólicos (padrão) individualmente à amostra e observando o aumento da área correspondente.
2 - Curva-padrão
A linearidade do método foi avaliada utilizando-se diferentes concentrações da solução- padrão (solução de trabalho) em duplicata. A análise da regressão linear forneceu valores de a (interseção) e b (inclinação) conforme registrado na Tabela 22. Os coeficientes de correlação (r) foram maiores que 0,9913 e os de determinação (r2
) superiores a 98,26 % para todos os fenóis. Estes resultados indicam uma relação linear entre a concentração de cada fenol e a resposta do detetor entre 0,75 e 28,0 mg/L.
3 - Limites de detecção, de quantificação e repetibilidade
O limite de detecção, ou seja, a menor concentração dos ácidos e aldeídos fenólicos detectados com confiança utilizando o método adotado, está representado na Tabela 23.
Observa-se que os valores encontrados variaram de 0,004 a 0,070 µL, dependendo do fenol. Esta variação pode ser devida ao fato dos comprimentos de onda utilizados não serem os máximos para todos os fenóis pesquisados (ROGGERO et al., 1991).
Tabela 22
- Linearidade das curvas-padrão para ácidos e aldeídos fenólicosFENÓIS COEFICIENTE DE
REGRESSÃO LINEAR1 COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO COEFICIENTE DE DETERMINAÇÃO COEFICIENTE DE LINEARIDADE a b (r) (r2) (mg/L) Ácido gálico 23,892 x 103 4,884 0,9995 99,00 6,0-1,5 Ácido vanílico 15,478 x 103 4,234 0,9994 99,88 7,0-1,75 Ácido siríngico 29,018 x 103 2,635 0,9995 99,00 3,0-0,75 Siringaldeído 17,046 x 103 3,669 0,9995 99,00 5,0-1,25 Vanilina 15,468 x 103 -1,341 0,9990 99,90 10,0-2,5 Coniferaldeído 12,395 x 103 4,499 0,9995 99,00 10,0-2,5 Sinapaldeído 6,584 x 103 4,584 0,9913 98,26 12,0-3,0 Ácido elágico 16,175 x 103 8,387 0,9999 99,98 28,0-7,0
1 Y: ax + b, em que Y é a área relativa do pico e x a concentração dos fenóis em mg/L.
Tabela 23 -
Limites de detecção e de quantificação dos ácidos e aldeídosfenólicos utilizando a metodologia descrita
FENÓIS LIMITE DE DETECÇÃO LIMITE DE
QUANTIFICAÇÃO (µg/20µL) (mg/L) Ácido gálico 0,007 0,025 Ácido vanílico 0,008 0,028 Ácido siríngico 0,004 0,012 Siringaldeído 0,006 0,041 Vanilina 0,012 0,042 Coniferaldeído 0,012 0,042 Sinapaldeído 0,030 0,099 Ácido elágico 0,070 0,231
Os limites de quantificação (Tabela 23) encontrados variaram de 0,012 a 0,231 mg/L. Não foram encontrados na literatura dados relacionados.
Na Tabela 24 mostram-se os resultados do estudo da precisão do método cromatográfico de análise, determinada pela injeção em triplicata de amostras de aguardentes adicionadas de quantidade conhecida de solução-padrão. Observa-se que os coeficientes de variação variaram de 1,93 a 13,54 %, sendo o mais elevado o da vanilina e o menor o do ácido gálico. De acordo com HORWITZ et al. (1980), os coeficientes de variação encontrados são satisfatórios, considerando-se que os valores de até 20 % são aceitos para analitos presentes em alimentos em parte por milhão (mg/L).
Tabela 24 -
Precisão do método para determinação de compostos fenólicos utilizando a metodologia desenvolvidaCOMPOSTOS
FENÓLICOS TEORES DE COMPOSTOS FENÓLICOS (mg/L) COEFICIENTE DE VARIAÇÃO
MÉDIA DESVIO PADRÃO
Ácido gálico 1,73 0,033 1,93 Ácido vanílico 2,62 0,064 2,44 Ácido siríngico 2,02 0,247 12,23 Siringaldeído 17,68 0,589 3,33 Vanilina 10,89 1,462 13,54 Coniferaldeído 4,11 0,459 11,17 Sinapaldeído 6,09 0,212 3,48 Ácido elágico 7,91 0,727 9,19