MATERIAL E MÉTODOS

1 - MATERIAL

1.1 - Aguardente de cana

Foram usados 120 litros de aguardente de cana-de-açúcar recém-destilada, de um mesmo lote, fornecida pela Destilarias Brasileiras Reunidas de Belo Horizonte, Minas Gerais, e caracterizada quanto aos parâmetros físico-químicos estabelecidos pela legislação brasileira (BRASIL, 1986).

1.2 - Madeiras

Foram utilizados seis tipos de madeiras: carvalho - Quercus sp; amburana - Amburana cearensis (Fr. All.) A.C. Smith; bálsamo - Myroxylon peruiferum L.F.; jequitibá - Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze; jatobá - Hymenaea spp e ipê - Tabebuia spp. Tanto as madeiras usadas para os testes de infusão como para a confecção dos barris foram secas previamente ao ar livre durante três a quatro anos. As madeiras e os barris foram fornecidos pela Indústria e Comércio Aguardentes Seleta e Boazinha de Salinas, Minas Gerais.

1.2.1 - Barris

Foram empregados seis barris de 20 litros, sendo um de cada madeira, com as seguintes dimensões: 106 cm de diâmetro da base, 95 cm de diâmetro de topo, 44 cm de altura (Figura 16). Os barris de amburana, jequitibá, jatobá, ipê e bálsamo eram novos e não sofreram tratamento térmico durante a confecção. O barril de carvalho foi confeccionado a partir de pranchas recuperadas de barris importados, usados.

Figura 16

1.2.2 - Pedaços de madeira

Pedaços das diferentes madeiras com 5 cm de largura, 2 cm de espessura e 12 cm de comprimento foram usados para o preparo dos extratos hidroalcoólicos. Peças de carvalho foram obtidas da região de Tronçois, na França, com as mesmas dimensões das outras madeiras.

2 - MÉTODOS

2.1 - Caracterização das madeiras

As madeiras foram identificadas pelo gênero e/ou espécie no Laboratório de Análise de Madeira do Departamento de Ciências Florestais da Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais.

O teor de umidade das madeiras foi medido nos pedaços das madeiras e diretamente nos barris, antes de se adicionar a aguardente de cana a ser envelhecida, usando o medidor de umidade marca TCS 75-Projetos Eletrônicos Ltda.

2.2 - Preparo dos extratos das madeiras

Foram preparados dois tipos de extratos de madeira, um ao natural, em que as peças foram raladas manualmente (ralador caseiro), homogeneizadas e passadas em tamis com malha 0,84 mm. No segundo tipo, as peças de madeiras foram submetidas a aquecimento prévio de 180 ºC, durante 2 h, antes de serem raladas e passadas em tamis. Duas gramas das madeiras assim preparadas, ao natural e aquecidas, foram maceradas em 100 mL de solução

hidroalcoólica a 50 ºGL sob agitação (Agitador/Incubadora, New Brunswick Scientific Co. Inc, N.J. - EUA) a 150 rpm durante 24 horas (SARNI et al., 1990b). Em seguida, os extratos foram filtrados em papel de filtro e armazenados em frascos de vidro à temperatura ambiente até serem submetidos às análise cromatográfica e de intensidade de cor.

2.3 - Estocagem da aguardente em barris de madeira

Os barris utilizados para o envelhecimento tiveram como tratamento prévio, o armazenamento, durante cinco meses, de uma aguardente de cana que foi posteriormente desprezada. Após este período, foram esvaziados e secos com ar comprimido e a aguardente recém-destilada foi adicionada.

A aguardente foi armazenada durante seis meses, nos diferentes barris, em cômodo com pouca iluminação e temperatura entre 19 e 25 ºC. A umidade relativa do ar variou de 67 a 80 %.

Aos cinco meses de envelhecimento, alíquotas de aguardente de cada barril foram coletadas para a realização das análises físico-químicas, as mesmas realizadas na aguardente recém-destilada antes de ser armazenada em barris de madeira (item 2.6).

Aos dois, quatro e seis meses de armazenamento, coletaram-se alíquotas da aguardente dos diferentes barris e foram determinados os teores de compostos fenólicos presentes.

2.4 - Análise físico-química da aguardente

Amostras de aguardente de cana recém-destilada e após cinco meses de estocagem em barris de madeira foram analisadas quanto aos parâmetros físico-químicos, abaixo relacionados, de acordo com os métodos recomendados pelo Ministério da Agricultura (BRASIL, 1986).

A precisão dos métodos utilizados foi avaliada pelo desvio padrão e coeficiente de variação para os resultados das análises realizadas em triplicata, na aguardente recém-destilada. Nas demais amostras as determinações foram realizadas em duplicata e os resultados expressos pela média.

• Grau alcoólico: por densimetria, sendo o resultado expresso em % em volume. As amostras foram destiladas em macrodestilador de Kjeldahl e injetadas diretamente no densímetro digital marca DMA 48 AP-PAAR, Áustria.

• Acidez volátil: por destilação com arraste de vapor, utilizando o aparelho Kazenave-Ferré, seguida de titulação com hidróxido de sódio 0,025 N em presença de fenolftaleína a 0,5% como indicador.

• Álcoois superiores: por espectrofotometria no visível. As amostras foram acidificadas com ácido sulfúrico concentrado e após adição de p-dimetil-amino-benzaldeído - DMAB, a intensidade da cor foi determinada a 540 nm, no espectrofotômetro UV-Visível, CG 8000. • Furfural: por espectrofotometria no visível. As amostras foram colocadas em presença de

anilina, em meio acidificado com ácido acético glacial. A intensidade da cor foi determinada a 520 nm.

• Aldeídos: método titulométrico direto com iodo 0,05 N, em meio alcalino. Adicionou-se metabissulfito de potássio, em excesso, em meio tamponado a pH neutro (7,0). O excesso de bissulfito foi eliminado na reação com iodo-amido em pH 2,0. O bissulfito combinado foi liberado em meio alcalino (pH 9,0), sendo titulado com solução de iodo em presença de amido.

• Ésteres: por titulometria. As amostras permaneceram sob refluxo durante uma hora em presença de excesso de hidróxido de sódio 0,1 N; após resfriamento, foram neutralizadas estequiometricamente com ácido sulfúrico 0,1 N e o excesso de ácido foi titulado com hidróxido de sódio 0,025 N.

• Álcool metílico: por espectrofotometria no visível. As amostras foram adicionadas de permanganato de potássio 3% e, após resfriamento em banho de gelo, adicionou-se ácido cromotrópico. A intensidade da cor desenvolvida foi medida a 575 nm.

• Cobre: método espectrofotométrico no visível. Adicionou-se 2,2-diquinolilo na amostra contendo cloridrato de hidroxilamina e acetato de sódio. A intensidade da cor desenvolvida foi determinada a 546 nm.

2.5 - Avaliação da cor

A intensidade da cor nos extratos de madeira e nas aguardentes estocadas durante dois e seis meses foi determinada utilizando colorímetro Héllege, usando discos padrão EBC

-

Foram dosados taninos (ácidos gálico e elágico) e produtos da degradação da lignina: aldeídos (siringaldeído, sinapaldeído, vanilina e coniferaldeído) e ácidos (vanílico e siríngico) na aguardente estocada durante 2, 4 e 6 meses nos barris das diferentes madeiras, nos extratos ao natural e com madeira aquecida e nas aguardentes adicionadas de caramelo ou baunilha. As análises foram realizadas em duplicata. A metodologia empregada foi baseada nos trabalhos desenvolvidos por DELGADO et al. (1990), SARNI et al. (1990b) e OIV (1994). A otimização da técnica acha-se detalhada no Apêndice B.

2.6.1 - Procedimento

Utilizou-se cromatógrafo a líquido de alta eficiência marca Shimadzu, modelo LC-10AD, com duas bombas Shimadzu LC-LC-10AD, detector UV-Visível Shimadzu SPD-10AV, e processador de dados C-R7A Cromatopac Shimadzu, coluna HRC-ODS C18, 5 µm, 250 x 4,6 mm Shimadzu e pré-coluna C18 (Shimadzu). O sistema de injeção foi manual com loop de 20 µL, fluxo de 1,1 mL/min e sistema gradiente de eluição (Apêndice B) à temperatura ambiente (23,0 ± 1 ºC). As fases móveis foram A: ácido acético a 2 % em água e B: ácido acético a 2 % em metanol. Usou-se sistema dual para detecção no ultravioleta a 280 e 313 nm no qual os valores de comprimento de onda e absorvância foram monitorados independentemente. Os dados do cromatograma são emitidos em ambos os comprimentos de onda, por meio das relações em que, se obtém uma média das absorvâncias (SHIMADZU ..., 1991).

R (t) = Aλ1 (t) - 1 (quando Aλ1 (t) > Aλ2 (t)

Aλ2 (t) R (t) = relação cromatográfica Aλ1 (t) = absorvância a 280 nm R (t) = 1 - Aλ2 (t) (quando Aλ1 (t) ≤ Aλ2 (t) Aλ2 (t) = absorvância a 313 nm

Aλ1 (t)

Os compostos fenólicos foram identificados pelo tempo de retenção e/ou pela adição de solução padrão na amostra; a quantificação foi realizada por meio da curva-padrão.

2.6.2 - Preparo das soluções-padrão

Foram preparadas soluções-estoque individuais dissolvendo os padrões dos ácidos gálico, vanílico e siríngico, de vanilina, siringaldeído, coniferaldeído e sinapaldeído em

álcool etílico a 50 ºGL, grau para cromatografia. As concentrações foram, em mg/L, de 200,0 para os ácidos vanílico e siríngico e o siringaldeído e de 400,0 para o ácido gálico, a vanilina, o coniferaldeído e o sinapaldeído (solução-estoque I).

As soluções-estoque II foram preparadas individualmente a partir das soluções-estoque I, transferindo-se alíquotas adequadas para se obter uma concentração final de 100 mg/L em álcool a 50 ºGL para os ácidos vanílico e siríngico e o siringaldeído e de 200 mg/L para os compostos ácido gálico, vanilina, coniferaldeído e sinapaldeído.

Não foi preparada solução-estoque I de ácido elágico tendo em vista que sua solubilidade torna-se dificultada, quando em concentrações elevadas. Para facilitar a dissolução, utilizou-se de 30% de metanol e posterior diluição em álcool a 50 ºGL. A concentração usada foi de 80 mg/L (solução-estoque II). A solução-padrão de ácido elágico foi preparada sob a orientação, via telefone, do Dr. J. L. PUECH, diretor do Institut National de la Recherche Agronomique, da Universidade de Montpellier, França, considerando que não foram encontrados dados na literatura referentes ao preparo de soluções de ácido elágico.

As soluções de trabalho foram preparadas a partir da solução-estoque II, retirando-se alíquotas para obtenção de uma mistura com as concentrações finais, em mg/L, de 4,0 de ácido siríngico; 5,0 de siringaldeído; 7,0 de ácido vanílico; 6,0 de ácido gálico; 10,0 de vanilina ou coniferaldeído e 28,0 de ácido elágico.

Todas as soluções foram armazenadas sob refrigeração. A estabilidade destas soluções foi monitorada e, quando necessário, novas misturas foram preparadas.

2.6.3 - Curvas-padrão

As curvas-padrão foram elaboradas usando as soluções de trabalho contendo concentrações, em mg/L, de 0,75; 1,5 e 3,0 para ácido siríngico; 1,25; 2,5 e 5,0 para siringaldeído; 1,5; 3,0 e 6,0 para ácido gálico; 1,8; 3,5 e 7,0 para ácido vanílico; 2,5; 5,0 e 10,0 para vanilina e coniferaldeído; 3,0; 6,0 e 12,0 mg/L para sinapaldeído e 7,0; 14,0 e 28,0 para ácido elágico. Foram realizadas duas injeções de cada uma e foram calculados os coeficientes de correlação e de determinação para cada composto.por meio de análise de regressão linear.

2.6.4 - Limites de detecção, quantificação e repetibilidade

Os limites de detecção foram determinados injetando-se diluições da solução-padrão até se obter quantidades detectáveis - área ≥ 2141 e ruído ≤ 200. Os limites de quantificação

foram estabelecidos utilizando-se os critérios da ACS Committee on Environmental Improvement (HORWITZ et al., 1980) em que o limite de detecção é igual a três vezes o ruído da linha de base ou 3,3 vezes o limite de detecção.

A repetibilidade associada às condições de determinação dos compostos fenólicos no cromatógrafo a líquido foi avaliada usando amostras de aguardente envelhecida adicionada de solução padrão de compostos fenólicos e injetadas em triplicata, em um mesmo dia.

2.7 - Preparo das amostras 2.7.1. - Extratos das madeira

Os extratos das madeiras foram filtrados em membrana com diâmetro dos poros de 0,45 µm (Millipore) e as alíquotas foram injetadas diretamente no cromatógrafo.

2.7.2 - Aguardente de cana envelhecida

Alíquotas da aguardente de cana envelhecida foram coletadas com dois, quatro e seis meses de estocagem em barris das diferentes madeiras. As amostras foram previamente filtradas em membrana com diâmetro dos poros de 0,45 µm (Millipore) e injetadas diretamente no cromatógrafo.

2.7.3. - Aguardentes sem envelhecer, adicionadas de caramelo ou de baunilha

Adicionou-se corante caramelo ou extrato de baunilha à aguardente de cana recém-destilada até obtenção da cor âmbar, comumente encontrada em bebidas recém-destiladas envelhecidas. Após filtração em membrana, as amostras foram injetadas diretamente no cromatógrafo. A mesma aguardente foi submetida à análise cromatográfica antes da adição de caramelo ou de baunilha.