Análise da composição da matriz

3.1 Formação dos biofilmes

A análise da matriz foi efetuada em biofilmes das três estirpes de C. glabrata em estudo com tratamento terapêutico de voriconazol. Usaram-se soluções de voriconazol com a concentração mais baixa e mais alta das testadas na suscetibilidade dos biofilmes, ou seja de 10 e 1000 µg/ml, igualmente preparadas com o dobro da concentração.

Efetuaram-se também controlos positivos para as três estirpes com a formação de biofilmes sem a presença de antifúngico. A preparação das suspensões celulares a usar neste caso foi a mesma que no ensaio da suscetibilidade de biofilmes. Assim, os inóculos, a centrifugação e as lavagens das suspensões foram efetuados tal como descrito na secção 2.3, assim como a determinação da concentração com a câmara de

Neubauer e ajuste final para 1x105 cel/ml. É de salientar apenas a diferença do meio

usado na preparação das suspensões celulares que neste caso foi SDB em vez do RPMI usado no estudo da suscetibilidade, assim como na preparação das soluções de antifúngico.

Neste ensaio foram usadas placas de cultura de tecidos de 24 poços. Para cada estirpe usaram-se quatro placas para que se obtivesse volume de suspensão de biofilme final suficiente para as posteriores análises à matriz. Assim, para cada estirpe foi reservada uma placa para o controlo positivo e nas outras três placas foram reservados em cada uma, 4 poços para o controlo negativo e 8 para cada uma das duas concentrações de antifúngicos usadas. Nos poços relativos ao controlo negativo adicionaram-se 500 µl de SDB e nos reservados para as duas concentrações de antifúngico e controlo positivo 500 µl das suspensões celulares preparadas. Incubaram- se todas as placas durante 24 h a 37ºC com agitação de 120 rpm. Após as 24 h de incubação removeu-se o meio dos poços reservados para adição de antifúngico e adicionaram-se a todos 250 µl de meio SDB fresco e mais 250 µl da solução de antifúngico. Nas placas do controlo positivo removeu-se metade do meio em todos os poços e adicionaram-se 250 µl de SDB fresco. Todas as placas foram novamente colocadas na incubadora orbital a 120 rpm e 37º durante 24 h. Assim, tal como no caso da suscetibilidade, obtiveram-se no controlo positivo biofilmes maduros com 48 h de crescimento, e nos poços com antifúngico biofilmes com 24 h de crescimento sem antifúngico e mais 24 h na presença do mesmo. Após a segunda incubação, removeu-se o meio de todos os poços e lavaram-se os biofilmes com 500 µl de PBS 1x para remover as células não aderidas. Seguidamente, rasparam-se os biofilmes de todos os poços duas vezes com 250 µl de PBS 1x e transferiram-se essas suspensões para tubos, juntando-se no mesmo todo o volume correspondente às mesmas condições (igual estirpe e igual concentração de antifúngico). Vortexaram-se as suspensões obtidas e filtrou-se 1 ml de cada uma a vácuo para determinação do peso seco. Os filtros usados foram previamente pesados e após a filtração colocados na estufa a 37ºC durante 24 h e novamente pesados. A diferença na massa dos filtros permitiu então o cálculo do peso seco de um 1

ml de cada suspensão. As suspensões foram de seguida usadas para extração da matriz e subsequentes análises da mesma, como será descrito nas secções seguintes. Todo o ensaio descrito e respetivas análises foram efetuados em quadruplicado para cada estirpe estudada, em momentos diferentes.

3.2 Extração da matriz

Para a extração da matriz sonicaram-se as suspensões obtidas durante 30 s a 30% e homogeneizaram-se por vortex durante 30 s. Seguidamente, centrifugaram-se as suspensões a 5000 g durante 5 min (a 4ºC), sendo os pellets descartados e os sobrenadantes (onde se encontra a matriz) filtrados com filtros de 0,2 µm de porosidade. Os sobrenadantes usaram-se de imediato para a quantificação de proteínas (secção 3.3.1) e polissacarídeos (secção 3.3.2) e conservou-se o restante a -20ºC para a posterior quantificação de ergosterol (secção 3.3.3).

3.3 Análises quantitativas

Nas matrizes analisadas quantificaram-se as proteínas através de um Kit BCA®, os polissacarídeos pelo método fenol-ácido sulfúrico e o ergosterol por HPLC.

3.3.1 Proteínas

Para a quantificação de proteínas usou-se um Kit BCA® (Bicinchoninic Acid, Sigma-Aldrich) destinado a esse efeito. O kit possui dois reagentes, um deles contém carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, ácido bicinconínico e tartarato de sódio em hidróxido de sódio 0,1 M (reagente A) e o outro sulfato cúprico 4% (p/v) (reagente B). Misturaram-se 20 µl de solução B por cada ml de solução A e deixou-se reagir durante 1 min. Transferiram-se 25 µl (em duplicado) de cada uma das soluções a analisar para uma placa de 96 poços e adicionaram-se 200 µl da mistura das soluções do

kit, incubando-se a placa durante 30 min a 37ºC. Foi determinada a absorvância num

branco. A concentração de proteína ([proteína]) foi extrapolada a partir de uma curva de calibração realizada com concentrações padrão de BSA (Abs=0,009[proteína]+0,1685) e normalizada por peso seco de biofilme anteriormente determinado.

3.3.2 Polissacarídeos

Para a quantificação dos polissacarídeos transferiram-se 0,5 ml de cada uma das soluções a analisar para tubos de vidro (em duplicado), aos quais foram adicionados 0,5 ml de fenol (50 g/l) e 2,5 ml de ácido sulfúrico (97% v/v). Homogeneizaram-se as soluções em vortex e deixou-se a reagir a temperatura ambiente durante 15 min. Após esse tempo transferiram-se 200 µl de cada uma das soluções para uma placa de 96 poços (em duplicado para cada solução) e efetuou-se a leitura da absorvância a 490 nm, usando-se PBS (com fenol e ácido sulfúrico) como branco. A concentração de polissacarídeos ([polissac.]) foi extrapolada a partir de uma curva de calibração realizada com concentrações padrão de glucose (Abs=0,2955[polissac.]+0,114) e normalizada por peso seco de biofilme anteriormente determinado.

3.3.3 Ergosterol

Para a quantificação de ergosterol extraíram-se inicialmente os lípidos de cada solução a analisar. O volume das soluções com matriz que restou após as duas análises anteriores (10 ml) foi transferido para tubos de vidro aos quais foram adicionados 2,0 ml de n-hexano (95% v/v). Agitaram-se estes tubos em vortex durante 1 min e removeram-se os sobrenadantes, sendo este processo repetido três vezes. As soluções com os sobrenadantes continham os lípidos em solução com o solvente de extração que foi posteriormente evaporado num Sistema de Evaporação por correntes de azoto. Ressuspendeu-se o resíduo seco obtido em 2,0 ml de metanol e filtrou-se a suspensão com um filtro de 0,45 µm de porosidade. Quantificou-se então o ergosterol em cada uma das soluções por HPLC. A cromatografia líquida de elevada eficiência (HPLC) é uma técnica de separação e análise em que uma amostra é arrastada, depois de colocada no sistema de injeção do aparelho, por um eluente líquido, neste caso o metanol (fase móvel), através da coluna cromatográfica (fase estacionária) que neste caso era uma

coluna C18 (constituída por sílica e radicais alquilo). Na saída da coluna a amostra passa por um sistema adequado de deteção (fluorímetro), que está acoplado a um computador que possui software adequado para a leitura e processamento dos dados. A deteção de ergosterol é efetuada a um comprimento de onda de 282 nm, sendo libertado da coluna após 12 a 14 min de corrida da amostra (corrida total de cada amostra de 20 min). A quantificação é realizada pelo próprio software ao qual foi previamente introduzida uma curva de calibração pela injecção de padrões de quantidades conhecidas de ergosterol. A quantidade de ergosterol determinada foi normalizada por peso seco de biofilme anteriormente determinado.

4. Análises estatísticas

Em todos os estudos realizados os resultados obtidos foram comparados usando- se a análise da variância (ANOVA), pela aplicação dos testes de comparações múltiplas Dunnett e Tukey através do software Graphpad. Todos os testes foram realizados com um nível de confiança de 95%.