Avaliação do papel da matriz de biofilmes de Candida glabrata na sua resistência ao voriconazol

outubro de 2013

Universidade do Minho

Escola de Engenharia

Bruna Fernandes Gonçalves

Avaliação do papel da matriz de biofilmes

de Candida glabrata na sua resistência

ao voriconazol

aliação do papel da matriz de biofilmes de

Candida glabrata

na sua resis

Dissertação de Mestrado

Ramo: Tecnologia Química e Alimentar

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica

Trabalho realizado sob a orientação da

Doutora Mariana Henriques

e da

Doutora Sónia Silva

Universidade do Minho

Escola de Engenharia

Bruna Fernandes Gonçalves

Avaliação do papel da matriz de biofilmes

de Candida glabrata na sua resistência

ao voriconazol

DECLARAÇÃO

Nome: Bruna Fernandes Gonçalves

Endereço eletrónico: a56431@alunos.uminho.pt Número do bilhete de identidade: 12995043

Título da dissertação: Avaliação do papel da matriz de biofilmes de Candida glabrata na sua resistência ao voriconazol

Orientadores:

Doutora Mariana Henriques Doutora Sónia Silva

Ano de conclusão: 2013

Designação do Mestrado: Mestrado Integrado em Engenharia Biológica

É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE.

Universidade do Minho, 1/10/2013

Agradecimentos

Por trás do sucesso na realização deste trabalho, estão determinadas pessoas cuja contribuição foi fundamental. Gostaria de expressar o meu profundo reconhecimento aos que me acompanharam nesta etapa, pela amizade, apoio, elucidação, disponibilidade, prontidão e transmissão de conhecimentos que foram fulcrais para mim. A todos, muito obrigada.

À professora Mariana, quero agradecer a excelente orientação, disponibilidade e transmissão de conhecimento que foi essencial. Mas há muito mais a agradecer à professora Mariana… a amizade, auxílio e constante preocupação nos momentos menos fáceis, é pouco do muito que tenho a agradecer.

À Sónia agradeço a simpatia, disponibilidade e orientação excelente. A alegria que demonstra no laboratório é contagiante e incentivadora. Obrigada pelo apoio e auxílio constantes.

À Célia, com quem tive o privilégio de aprender e trabalhar, agradeço toda a ajuda prestada literalmente do primeiro ao último dia. Obrigada por todo o conhecimento transmitido, ajuda na execução laboratorial e total disponibilidade para auxílio. Além disso, muito obrigada pela simpatia constante que me fez sentir bem-vinda.

A todos do grupo das “Candidas” e dos “Fagos”, obrigada por me fazerem sentir “em casa”.

Também agradeço aos meus amigos Mito e Carla pela amizade e companhia mesmo nas imensas horas a verem-me escrever este trabalho.

À minha mãe pela transmissão de sabedoria e constante incentivo dos estudos académicos, à minha irmãzinha pelo carinho e ao pai dela por tudo (que é tanto…), e já agora à kuska pela companhia e alegria.

Ao Ricardo, agradeço o carinho, apoio constante e compreensão por todo o tempo que não lhe dediquei como merecia e acima de tudo obrigada pelo amor essencial para o sucesso de qualquer trabalho científico…”Se tu passares energias positivas àqueles que te

rodeiam a possibilidade de te retribuírem da mesma forma é imensa”…(Valete)

Resumo

As infeções causadas por espécies de Candida (candidíases) têm aumentado consideravelmente nas últimas décadas. Apesar da principal espécie causadora ser Candida

albicans, recentemente, outras espécies de Candida têm surgido como patogénicos comuns,

como Candida glabrata que é atualmente a segunda espécie mais frequente. Esta espécie é de elevada importância clínica uma vez que possui elevada resistência aos antifúngicos mais usados em prática clínica, como o fluconazol. Por tal, têm emergido triazóis de segunda geração como o voriconazol, com maior potência e atividade. A formação de biofilmes é um dos fatores de virulência que mais contribui para a patogenicidade das espécies de Candida, sendo aceite que a sua matriz desempenha um papel essencial na elevada resistência apresentada pelos mesmos. No entanto, há falta de conhecimento sobre a composição da matriz de biofilmes de C.

glabrata e sobre o papel dessa composição na resistência antifúngica.

O objetivo deste trabalho foi então, o estudo de compostos presentes na matriz de biofilmes de C. glabrata expostos ao voriconazol, contribuindo assim para um melhor esclarecimento da sua elevada resistência. Para tal, foi inicialmente testada a suscetibilidade ao voriconazol de células plantónicas e de biofilmes de três estirpes de C. glabrata, em termos de viabilidade celular e biomassa. Posteriormente analisaram-se as matrizes de biofilmes expostos ao voriconazol, após a sua extração por sonicação, sendo o conteúdo proteico quantificado por um kit BCA®, o de polissacarídeos pelo método fenol-sulfúrico e o de ergosterol por HPLC.

Os resultados mostraram diferente resistência ao voriconazol por parte dos biofilmes das três estirpes estudadas, o que não foi verificado em células plantónicas (CMI50 semelhante).

Além disso, os resultados sugeriram maior produção de matriz pelos biofilmes mais resistentes e menor pelos menos resistentes. A análise das matrizes mostrou diminuição de proteínas e aumento de polissacarídeos nos biofilmes de todas as estirpes mas com extensão diferente. O aumento de polissacarídeos foi tanto maior quanto maior a perda de proteína, sugerindo uma possível compensação de conteúdo da matriz. O ergosterol, nunca antes referenciado como componente da matriz de biofilmes de Candida, apresentou aumento na presença de voriconazol, tanto maior quanto mais resistente se mostrou o biofilme dessa estirpe. O aumento de ergosterol e polissacarídeos nas matrizes dos biofilmes tratados com voriconazol poderá ser um indicativo de resposta pelos biofilmes para aumento da resistência antifúngica.

Este trabalho contribuiu assim para uma melhor compreensão da composição da matriz de biofilmes de C. glabrata e possível relação com a resistência antifúngica. É importante que haja continuação do aumento deste conhecimento, o que poderá permitir a identificação de potenciais alvos terapêuticos que possibilitem a melhoria da eficácia antifúngica em biofilmes de C. glabrata e consequente diminuição da elevada mortalidade associada aos mesmos.

Abstract

The infections caused by Candida species (candidiasis) have increased considerably over the last decades. Although the main causative species is Candida albicans, recently, other

Candida species have emerged as common pathogens such as Candida glabrata, which is

currently the second most frequent species. This species is of high clinical relevance as it has high resistance to the most commonly used antifungal agents in clinical practice, such as fluconazole. For such, second generation triazoles have emerged, such as voriconazole, with greater power and activity. Moreover, biofilm formation is a virulence factor with major contribution to the Candida species pathogenicity and it is accepted that the matrix plays an essential role in the high resistance presented by them. However, there is lack of knowledge about the matrix composition of C. glabrata biofilms and about the role of this composition in their antifungal resistance.

The aim of this work was the study of matrix compounds of C. glabrata biofilms exposed to voriconazole, thereby contributing to a better understanding of their high resistance. To this end, the susceptibility to voriconazole of the planktonic and biofilm cells of three C.

glabrata strains was initially tested, in terms of biomass and cell viability quantification.

Subsequently, the matrices were analyzed in biofilms exposed to voriconazole, after their extraction by sonication, and the protein content quantified by a BCA kit ®, the polysaccharide content by the phenol-sulfuric acid method and the ergosterol by HPLC.

The results showed different biofilm resistances to voriconazole for the three strains under study, which was not observed in planktonic cells (similar MIC50). In addition, the results

suggested higher matrix production by more resistant biofilms and lower by less resistant. The matrices analysis showed that biofilms from all strains had a decrease in the total proteins content and an increase in polysaccharides content, but in different extentions. The polysaccharides increase was greater as the greater was protein loss, suggesting a possible compensation of matrix content. Ergosterol, not earlier referred as a matrix component of

Candida biofilms, showed increase in the presence of voriconazole, which was greater in the

most resistant biofilms. The ergosterol and polysaccharides increase in the matrices of biofilms treated with voriconazole may be indicative of antifungal response of biofilms to increase their resistance.

Thus, this study contributed to increase the knowledge of the matrix composition of C.

glabrata biofilms and its possible role in antifungal resistance. It is important to continue

increasing this knowledge, which may allow the identification of potential therapeutic targets that enable to improve antifungal efficacy in C. glabrata biofilms and thus reduce the high mortality associated to them.

Índice

Capítulo I: Introdução...1

Revisão bibliográfica... 1

1. _{Género Candida...1}

1.1 _{Classificação taxonómica...1}

1.2 _{Importância nas infeções fúngicas humanas...2}

2. _{Espécies de Candidas não-albicans ...4}

2.1 _{Importância como patogénicos...5}

2.2 _{Identificação e diferenciação de espécies...5}

3. _{Candida glabrata...7}

3.1 _Biologia...8

3.2 _{Epidemiologia e fatores de risco...11}

3.3 _{Resistência a antifúngicos...12}

3.3.1 _{Agentes antifúngicos e mecanismos de resistência...13}

3.3.1.1 _{Voriconazol...17}

3.4 _{Patogenicidade e fatores de virulência...18}

4. _{Biofilmes...20}

4.1 _{Formação de biofilmes ...22}

4.2 _{Mecanismos de resistência dos biofilmes aos antifúngicos...25}

4.2.1 _{Matriz extracelular...28}

Objetivos...31

Capítulo II: Materiais e Métodos...33

1. _{Meios e culturas celulares……...33}

1.1 _{Organismos...33}

1.2 _{Meios de cultura...33}

2. _{Determinação da suscetibilidade ao voricanazol...34}

2.1 _{Preparação de antifúngico...34}

2.2 _{Suscetibilidade de células plantónicas...34}

2.2.1 _{Quantificação de células viáveis...35}

2.3 _{Suscetibilidade de biofilmes...36}

2.3.1 _{Quantificação de células viáveis de biofilmes...37}

2.3.2 _{Quantificação de biomassa total de biofilmes...38}

3. _{Análise da composição da matriz...38}

3.2 _{Extração da matriz...40} 3.3 _{Análises quantitativas...40} 3.3.1 _{Proteínas...40} 3.3.2 _{Polissacarídeos...41} 3.3.3 _{Ergosterol...41} 4. _{Análises estatísticas...42}

Capítulo III: Resultados...43

1. _{Suscetibilidade de células plantónicas e biofilmes de C. glabrata ao voriconazol...43}

2. _{Composição da matriz de biofilmes de C. glabrata na presença de voriconazol...49}

Capítulo IV: Discussão...53

Capítulo V: Conclusões e sugestões futuras...61

Capítulo VI: Bibliografia...63

Lista de Figuras

Figura 1 – Imagem de um doente com candidíase oral...3 Figura 2 – Placa de CHROMagar demonstrando Candida albicans, Candida tropicalis e Candida glabrata...7

Figura 3 – Estruturas microscópicas (em cornmeal Tween 80) e macroscópicas (em SDA) das

espécies C. glabrata, C. parapsolosis e C. tropicalis...9

Figura 4 – Via biossintética de ergosterol a partir do esqualeno com os intermediários e

enzimas que catalisam cada reação individual...11

Figura 5 – Principais mecanismos de resistência antifúngica da Candida glabrata e respetivos

alvos de ação ...17

Figura 6 – Estrutura química do voriconazol...18 Figura 7 – Cateter infetado por um biofilme de Candida...21 Figura 8 – Etapas de formação de um biofilme numa superfície abiótica. (A) Adesão inicial à

superfície; (B) Formação de camadas basais de microcolónias; (C) Biofilme maduro com matriz extracelular...22

Figura 9 – Biofilme de C. glabrata, estirpe BG2, formado em superfície de plástico com meio

YPD a 37ºC (da esquerda para a direita aumento da amplificação da imagem)...24

Figura 10 – Representação gráfica da concentração celular viável logaritmizada de células

plantónicas de três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123) com diferentes concentrações de voriconazol e respetivos desvios-padrão. (*Resultados com diferença significativa em relação ao controlo positivo (P<0,05))...44

Figura 11 – Representação gráfica da concentração celular viável por unidade de área,

logaritmizada, de biofilmes de três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123) com diferentes concentrações de voriconazol e respetivos desvios-padrão. (*Resultados com diferença significativa em relação ao controlo positivo (P<0,05))...45

Figura 12 – Representação gráfica da absorvância por unidade de área de biofilmes de três

estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123) com diferentes concentrações de voriconazol, após a coloração com CV, e respetivos desvios-padrão. (*Resultados com diferenças significativas em relação ao controlo positivo (P<0,05))...47

Figura 13 – Representação gráfica da quantidade de proteína na matriz por grama de peso seco

de biofilme, para biofilmes de três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123) com duas concentrações de voriconazol e controlo positivo, e respetivos desvios-padrão. (*Resultados com diferença significativa em relação ao controlo (P<0,05)...49

Figura 14 – Representação gráfica da quantidade de polissacarídeos na matriz por grama de

peso seco de biofilme, para biofilmes de três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123) com duas concentrações de voriconazol e controlo positivo, e respetivos desvios-padrão. (*Resultados com diferença significativa em relação ao controlo (P<0,05))...50

Figura 15 – Cromatograma de HPLC relativo ao estudo de ergosterol na matriz de um biofilme

de C. glabrata ATCC 2001...71

Lista de tabelas

Tabela 1 – Métodos usados na identificação de espécies de Candida...6 Tabela 2 – Resultados da viabilidade celular e da quantificação de biomassa (após coloração

com CV) de biofilmes de três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123) com 24 h de crescimento...48

Tabela 3 – Resultados da quantidade de ergosterol na matriz, obtida por HPLC, para biofilmes

de três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123) na presença de duas concentrações de voriconazol e o controlo positivo (sem antifúngico)...51

Lista de Abreviaturas

ATCC – “American Type Culture Collection” ATP – Adenosina trifosfato

BCA – Ácido bicinconínico (“Bicinchoninic Acid”)

BSA – Albumina do soro bovino (“Bovine Serum Albumin”) C – Celsius

CDR – “Candida Drug Resistance”

CNA – Candida não-albicans

CMI – Concentração Mínima Inibitória CV – Cristal Violeta

Epa – Adesina epitelial

FISH – Hibridação fluorescente in situ (“Fluorescent in situ Hybridization”) h - hora

HPLC – Cromatografia líquida de elevada eficiência (“High-performance/pressure liquid

chromatography”)

LIP – Lipase

MDR – “Multidrug resistance”

MFS – “Major Facilitator Superfamily” mg – miligrama

min - minuto ml – mililitro mm – milímetro

NCCLS – “National Committee for Clinical Laboratory Standards” nm – nanómetro

PBS – Tampão fosfato-salino (“Phosphate Buffered Saline”)

PCR – Reação em cadeia da polimerase (“Polymerase Chain Reaction”) pH – potencial de hidrogénio

rpm – rotações por minuto

RPMI – “Roswell Park Memorial Institute” s - segundo

Sap – Aspartil proteinase

SDA – Meio Sabouraud sólido (“Sabouraud Dextrose Agar”) SDB – Meio Sabouraud líquido (“Sabouraud Dextrose Broth”) SIDA – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

UDP – Uridina difosfato (“Uridine diphosphate”) UFC – Unidades Formadoras de Colónias VIH – Vírus da Imunodeficiência Humana µg – micrograma

Capítulo I: Introdução

Revisão bibliográfica

1. Género Candida

Os fungos são caracterizados como eucariotas, sendo organismos unicelulares ou pluricelulares, heterotróficos com nutrição por absorção, em que a maioria é aeróbia, embora possam também ser anaeróbios facultativos ou estritos. Podem crescer em meios ricos ou pobres em nutrientes, com pH entre 2,3 e 7,5 e temperatura entre 20 e 38ºC (a ideal da maioria é de 25 a 30ºC), conseguindo suportar de 10 a 40ºC [1-3].

Nos últimos 30 anos verificou-se um aumento significativo na incidência das infeções fúngicas humanas, sendo as invasivas reconhecidas como causas importantes de morbidez e mortalidade [4]. De facto, doentes terminais e com doenças imunocomprometedoras que sobrevivem à custa de tratamentos específicos, muitas vezes acabam por morrer devido a infeções fúngicas e não da doença que realmente padecem [5].

Dos fungos considerados como patogénicos para os humanos, os do género

Candida são aqueles que mais frequentemente são recolhidos de infeções fúngicas

humanas [6]. Resultados de autópsias de doentes imunocomprometidos revelam que pelo menos metade foi alvo de infeção por espécies de Candida, um terço por espécies de Aspergillus e os restantes por espécies de Cryptoccocus e outros fungos [7].

As espécies do género Candida são leveduras que se caracterizam por serem seres unicelulares, que se reproduzem normalmente por gemulação e que possuem tanto capacidade fermentativa quanto assimilativa, sendo capazes de crescer em diversos substratos orgânicos [1].

1.1 Classificação taxonómica

O género Candida é classificado taxonomicamente no Reino Fungi, Filo Ascomycota, Classe Saccharomycetes, Ordem Saccharomycetales, Família Saccharomycetaceae [8].

Este género foi criado por Christine Berkhout na sua tese publicada em 1923, para nove espécies até então incluídas no género Monilia. Em 1937, Martin fez esforços

para denominar as leveduras inseridas neste género [9]. Atualmente, o género Candida compreende mais de 350 espécies heterogéneas mas apenas uma minoria tem sido implicada nas infeções fúngicas [10].

1.2 Importância nas infeções fúngicas humanas

O aumento significativo, nas últimas décadas, de infeções fúngicas humanas causadas por espécies de Candida tem sido atribuído a diversos fatores. Para tal, contribuiu o aumento da epidemia da SIDA (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida), uma população cada vez mais envelhecida, aumento de pacientes imunocomprometidos e maior uso de dispositivos médicos internos [11-13]. Assim, tratamentos de quimioterapia e radioterapia, uso de antibióticos de largo espetro, transplantes de órgãos ou de medula óssea, intervenções cirúrgicas, necessidade de cuidados intensivos, [12-14] e uso de dispositivos médicos como cateteres intravenosos, implantes, lentes de contacto e próteses dentárias entre outros [10,15], são fatores de risco que contribuem

para este tipo de infeções. Além disso, o aumento da resistência aos agentes

antifúngicos por parte dos microrganismos e o restrito número de agentes disponíveis (possuindo diversos efeitos secundários), também contribuiu para o aumento destas infeções [16].

As leveduras do género Candida possuem uma distribuição ampla na natureza, podendo ser encontradas em humanos, animais domésticos e selvagens, solos, água e alimentos, assim como em diversos ambientes incluindo hospitalares [17,18]. Estas leveduras pertencem à microbiota normal dos humanos, podendo colonizar as superfícies das mucosas da cavidade oral, dos tratos vulvovaginal, urinário e gastrointestinal além de unhas, couro cabeludo e pele [19,20]. Na cavidade oral podem ser detetadas logo após o nascimento (com parto vaginal) e no trato gastrointestinal após duas a três semanas. Neste trato são encontradas em 20 a 80% da população adulta saudável e no vulvovaginal em 20 a 30% das mulheres adultas saudáveis. De forma geral, as espécies de Candida são detetadas em aproximadamente 31 a 55% dos indivíduos saudáveis [20,21].

Embora as leveduras do género Candida sejam organismos comensais e colonizem a superfície das mucosas e da pele em indivíduos saudáveis de forma assintomática, podem tornar-se uma das causas mais importantes de uma infecção letal

ou incapacitante [22,23]. Assim, estas espécies são caracterizadas como oportunistas, em que alterações no hospedeiro são necessárias para que estes microrganismos comensais inofensivos se tornem patogénicos, podendo colocar a vida em risco [16]. Estas alterações estão relacionadas com fatores internos e externos que modificam as defesas do hospedeiro, estando então os pacientes imunocomprometidos mais predispostos a desenvolver infeções de Candida, tanto superficiais como disseminadas pela corrente sanguínea [16,18]. Esta passagem endógena, de comensais a patogénicos devido a situações imunocomprometedoras, é considerada a principal forma de desenvolver infeções de Candida. No entanto, a transmissão a partir das mãos dos profissionais de saúde e de dispositivos como cateteres ou soluções intravenosas contaminadas, têm sido considerados mecanismos de transmissão exógena importantes nas infeções nosocomiais [22, 24].

Uma infeção causada por leveduras do género Candida é normalmente designada de candidíase ou candidose. Ambos os termos são usados na literatura e por isso a controvérsia sobre a nomenclatura persiste, sendo que candidíase é o termo aceite nos Estados Unidos e candidose o preferido no Canadá, Reino Unido, França e Itália [25]. As infeções causadas por estes fungos podem ser desde superficiais até sistémicas com elevada severidade tal como a candidíase invasiva, normalmente denominada de

candidemia [18]. As manifestações clínicas destas infeções podem então ser variadas,

sendo agrupadas em: candidíases cutâneo-mucosas, sistémicas e alérgicas [18].

A maioria das infeções causadas por Candida são superficiais afetando as unhas, a pele e mucosas, principalmente as da vagina e cavidade oral e são as denominadas candidíases cutâneo-mucosas [10,18]. Destas fazem parte a candidíase oral (figura 1), vulvovaginite e onicomicose [18]

Estas infeções superficiais devem-se essencialmente a alterações no pH, na hidratação, nas concentrações de nutrientes e na microbiota normal devido a

deficiências nas resistências do hospedeiro [18]. Normalmente provocam lesões que

inicialmente são vesículas brancas que rebentam e originam superfícies de cor vermelha viva, com sensação acentuada de ardor e prurido [26].

A candidíase sistémica ou disseminada (candidemia) é mais rara, mas tem efeitos muito mais graves quando ocorre, apresentando taxas de mortalidade até 60% [27,28]. A elevada mortalidade associada a estas infeções é em parte devida à falta de ferramentas de diagnóstico rápidas e precisas e a terapias antifúngicas ineficientes [28]. Este tipo de infeção tem um início localizado, em que em algum momento da sua evolução se disseminou para outros órgãos pela corrente sanguínea, ou tem origem exógena através de soluções intravenosas contaminadas ou cateterismo [18]. As candidemias estão normalmente associadas a pacientes imunosuprimidos, principalmente os internados em unidades de tratamento ou infetados pelo VIH (Vírus da Imunodeficiência Humana), sendo raras em pacientes que não tenham fatores de risco associados à infeção invasiva [29]. Apresentam quadros clínicos de febre, colapso, coma e morte com sintomas diversos tais como cardíacos, respiratórios, digestivos, renais e hepáticos [26].

A candidíase alérgica está normalmente associada a lesões cutâneas nos espaços interdigitais das mãos ou pés que desaparecem com o tratamento da infeção [18].

Recentemente as espécies de Candida têm sido sugeridas com causadoras de outras doenças além de candidíases como por exemplo na boca, onde poderão estar associadas a cancro oral, síndrome de ardência bucal e distúrbios de paladar, embora a base destas associações ainda se mantenha incerta [30-32].

2. Espécies de Candida não-albicans

Em 1963 eram conhecidas apenas cinco espécies do género Candida como causadoras de candidíases em humanos [33], mas atualmente mais de dezassete espécies são consideradas agentes etiológicos nas infeções humanas [16,34]. No entanto, mais de 90% das infeções invasivas são causadas por Candida albicans, Candida glabrata,

Candida parapsilosis, Candida tropicalis e Candida krusei [16]. As espécies de

Candida não-albicans (CNA), tais como as últimas quatro, têm emergido como

2.1 Importância como patogénicos

Candida albicans é a espécie mais frequentemente encontrada tanto em

indivíduos saudáveis como infetados. Apesar de estudos micológicos mostrarem que C.

albicans representava cerca 80% dos isolados de todas as formas de candidíases

humanas, nas últimas décadas o número de infeções devidas as espécies de CNA aumentou significativamente [6,36], havendo até estudos recentes a demonstrarem predominância destas espécies nas candidíases [37,38]. Entre as espécies de CNA, as três mais frequentemente causadoras de candidíases são C. glabrata, C. parapsilosis e

C. tropicalis [35].

Esta mudança na epidemiologia pode estar relacionada com o aumento de pacientes com imunosupressão severa, prematuridade na exposição a antibióticos de largo espetro, pacientes mais idosos, assim como com novos tipos de intervenções a que os pacientes são sujeitos e os fármacos utilizados [37]. O aumento do predomínio de espécies de CNA nas infeções fúngicas também tem sido atribuído ao facto de algumas apresentarem um nível de resistência aos agentes antifúngicos inerentemente superior ao de C. albicans, promovendo a sua persistência possivelmente em detrimento desta espécie, em infeções mistas tratadas com agentes antifúngicos tradicionais [39].

Além disto, este aumento de espécies de CNA nas candidíases poderá ser em parte um incremento aparente relacionado com melhorias nos métodos de diagnóstico, tais como o uso de agáres com a habilidade de diferenciar espécies de Candida e a introdução de técnicas moleculares de diagnóstico de rotina [40].

2.2 Identificação e diferenciação de espécies

Os sintomas clínicos de uma infeção fúngica não são indicativos de espécies particulares de Candida e podem até ser induzidos por outros microrganismos. Assim, a identificação e diferenciação laboratorial de espécies de Candida é essencial para estabelecer um diagnóstico definitivo. Normalmente, o diagnóstico laboratorial envolve métodos não moleculares, mas métodos baseados em PCR (“Polimerase Chain

Reaction”) têm sido cada vez mais usados [35,41]. A tabela 1 apresenta alguns dos

métodos usados na identificação de espécies, assim como o tempo necessário para a sua concretização e a relevância do custo e da precisão do método.

Tabela 1 – Métodos usados na identificação de espécies de Candida (adaptado de [41])

Métodos Tempo Custo Precisão Referência

Métodos não moleculares

CHROMagar Candida 24 – 48 h baixo média [42-44]

Teste “germ tube” 2 – 4 h baixo alta [45]

Assimilação de carbono e azoto 24 – 48 h baixo baixa [46]

Fermentação de hid. de carbono 24 – 48 h baixo baixa [47]

API 20C Aux 24 -72 h alto alta [48]

Auxacolor 24 -72 h médio alta [49,50]

RapID yeast plus 4 – 5 h médio alta [51]

Vitek 2 ID-YST 15 h alto alta [52]

Abbott quantum II 24 h alto média [53]

Métodos moleculares

Multiplex-PCR < 2 h alto alta [54]

Nested PCR 4 – 6 h alto alta [55,56]

Real-time PCR 4 – 5 h alto alta [57-59]

O PCR foi a tecnologia molecular que teve maior impacto na identificação de espécies nas infeções por Candida. Técnicas moleculares não baseadas em PCR têm também surgido como apropriadas para a identificação de leveduras, como por exemplo

FISH [61,62]. No entanto, apesar do crescente desenvolvimento de tecnologias

moleculares, a grande maioria dos diagnósticos clínicos são baseados em métodos não moleculares. Isto deve-se à reduzida quantidade de equipamento de PCR nos laboratórios hospitalares, principalmente porque o uso destes métodos é muito dispendioso, além de problemas com a preparação da amostra e contaminações, assim como a falta de protocolos padrão para métodos de PCR [35].

Em relação aos métodos não moleculares, há uma grande variedade destes, incluindo métodos tradicionais como o teste “germ-tube” baseado em características morfológicas, ou a análise da assimilição ou fermentação de hidratos de carbono, baseada em características fisiológicas. Talvez os métodos mais usados sejam os kits comercialmente disponíveis para a identificação baseada na assimilação de hidratos de carbono e/ou deteção de enzimas, como por exemplo o API 20C Aux (API Candida) e o Auxacolor (Bio-Rad) [35,41]. Outros métodos usados incluem métodos rápidos como o RapID yeast plus (Innovative Diagnostic Systems, Norcross), assim como abordagens baseadas em equipamentos especializados tal com o sistema Vitek 2 ID-YST

(bioMerieux Vitek, Inc., Hazelwood, MO, USA), geralmente o mais usado, e o sistema Abbott quantum II (Abbott Laboratories, Irving, Tex., USA) [41]. Em relação ao sistema CHROMagar Candida (CHROMagar Company, Paris, França), este é um meio de agár seletivo e diferencial que tem a vantagem de possibilitar a identificação de co-infeção por diferentes espécies. É possível diferenciar por exemplo, C. albicans, C.

tropicalis e C. glabrata, sendo que a primeira apresenta colónias verde-azuladas, C.

tropicalis azuis escuras e C. glabrata colónias rosa ou púrpura [63] (figura 2).

Figura 2 – Placa de CHROMagar demonstrando C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata [41]

3. Candida glabrata

Tal como já referido, as espécies de Candida não-albicans (CNA) têm emergido como importantes patogénicos nas candidíases humanas. Nas últimas duas décadas as infeções atribuídas a C. glabrata aumentaram significativamente, correspondendo atualmente entre 5 a 40% de todas as formas clínicas de candidíase [64], sendo a maior causa depois de C. albicans [64,65]. Em infeções mistas, a combinação mais frequente é de C. glabrata e C. albicans, que é encontrada em aproximadamente 70% dos pacientes com candidíase oral [66].

Candida glabrata, normalmente comensal do trato digestivo, é um importante

fungo patogénico oportunista que causa infeções tanto superficiais como sistémicas [65,67]. Durante muitos anos esta espécie foi considerada uma saprófita da flora normal de indivíduos saudáveis, relativamente não patogénica e por isso não causadora de infeções sérias em humanos. No entanto, o facto de estar associada a uma elevada taxa

de mortalidade e de ter a capacidade de disseminar rapidamente pelo organismo confirma o oposto [68].

Candida glabrata tem a particularidade de ser geneticamente mais próxima da

Saccharomyces cereviseae que qualquer outra espécie de Candida, tendo tal como essa

um genoma haplóide e incapacidade de produzir filamentos sob condições de cultura

normais [65,67]. Uma característica importante de C. glabrata é a sua baixa

suscetibilidade aos antifúngicos, em particular aos azóis [68,69]. Além disso, alguns estudos têm mostrado que esta espécie tem duas vezes mais tendência para aderir a superfícies acrílicas do que C. albicans [70], assim como maior adesão a células epiteliais urinárias do que as outras espécies de CNA [71].

Apesar de C. glabrata ser frequentemente identificada como a causadora de diversas candidíases e das infeções provocadas por ela serem difíceis de tratar e associadas a elevada mortalidade, os estudos publicados relativamente a esta espécie são muito poucos quando comparado com outras espécies de Candida. Pouco se sabe sobre a virulência de C. glabrata e defesa do hospedeiro relativamente a ela [68].

3.1 Biologia

As espécies do género Candida podem todas crescer com morfologia de levedura. Macroscopicamente, as colónias de C. glabrata em SDA (“Sabouraud Dextrose Agar”) são lisas, brilhantes, de cor creme e em grande parte indistinguíveis das outras espécies de Candida excepto pela sua dimensão relativa, que pode ser bastante pequena [6,68] (figura 3). As células de C. glabrata têm entre 1 a 4 µm, sendo então consideravelmente menores que as de C. albicans que têm entre 4 a 6 µm, assim como de outras espécies de CNA como C. tropicalis (4 a 8 µm) e C. parapsilosis (2,5 a 4 µm) [68,72].

Em condições de crescimento ótimas, as células de C. glabrata crescem por

gemulação como blastoconídios que são de esféricos a ovais [72]. Contrariamente a

outras espécies de Candida, sob condições normais de cultura, não têm a capacidade de efetuar a transição entre blastoconídios e tipos de crescimento filamentosos, as hifas ou pseudo-hifas, sendo consideradas não polimórficas (figura 3) [73,35]. Espécies como C.

albicans e C. dubliniensis são polimórficas verdadeiras, já que formam tanto hifas como

hifas, e espécies como C. parapsilosis e C. tropicalis formam apenas pseudo-hifas [6]. No entanto, alguns estudos têm relatado que em condições especiais de cultura

como em privação de azoto ou na presença de CuSO4, C. glabrata tem a capacidade de

produzir pseudo-hifas [74,75].

A figura 3 apresenta as estruturas macroscópicas e microscópicas de C. glabrata e outras duas espécies de CNA (C. parapsilosis e C. tropicalis), que permite visualizar as diferenças morfológicas entre C. glabrata e essas [35].

Figura 3 – Estruturas microscópicas (em cornmeal Tween 80) e macroscópicas (em SDA) das espécies

C. glabrata (a e d), C. parapsolosis (b e e) e C. tropicalis (c e f) [35]

Historicamente, C. glabrata foi classificada no género Torulopsis devido à incapacidade de formar pseudo-hifas em condições normais. No entanto, em 1978 foi determinado que a capacidade para formar pseudo-hifas não era um fator de distinção de confiança entre as espécies do género Candida, e foi proposto que a T. glabrata fosse

classificada no género Candida [68, 76]. A incorporação neste género necessitou a

alteração da descrição relativa às pseudo-hifas do género Candida de “pseudomicélios” para “pseudo-hifas: ausentes, rudimentares ou desenvolvidas”. Esta mudança na nomenclatura levou bastante tempo a ser aceite pela comunidade de micologia médica e algumas publicações ainda se referem a C. glabrata como T. glabrata [76].

Relativamente à bioquímica, C. glabrata fermenta e assimila apenas glucose e trealose, o que contrasta com C. albicans que fermenta e assimila diversos açúcares com a exceção da sacarose [35,76]. Este repertório de utilização de açúcar de C. glabrata é único em comparação à maioria das espécies de Candida, sendo usado por diversos kits comerciais de identificação de espécies, como por exemplo o API 20C [68].

A parede celular das leveduras tem um papel essencial na biologia e patogenicidade celular. É responsável pela morfologia final da célula, sendo a sua estrutura que mantém a forma de levedura. Age como barreira permeável, mediando as interações entre a célula e o meio que a rodeia, conferindo também rigidez e proteção. A parede celular das espécies de Candida é constituída por aproximadamente 80 a 90% de hidratos de carbono, 6 a 20% de proteínas e 1 a 7% de lípidos. Os polímeros de manose, ligados covalentemente a manoproteínas representam 40% dos polissacáridos da parede. Os restantes são principalmente polímeros de glucose que contêm ramificações com ligações β-1,3 e β-1,6 e polímeros de N-acetil-D-glucosmina que contêm ligações β-1,4 a moléculas de quitina. A quitina e os β-glucanos constituem os componentes estruturais da parede e conferem rigidez às células, já que formam um esqueleto rígido [77].

A membrana plasmática das leveduras também tem constituintes essenciais para diversas funções celulares. Estes microrganismos apresentam uma membrana plasmática semelhante à dos outros eucariotas, constituída principalmente por lípidos e proteínas [78]. É uma bicamada lipídica intercalada por proteínas globulares transmembranares, contendo proteínas intrínsecas e extrínsecas à membrana, assim

como glicoproteínas [78,79]. Os lípidos têm uma maior capacidade de se

movimentarem através da bicamada lipídica que as proteínas, e a movimentação destas

depende da fluidez conferida pelos lípidos à membrana [80]. A maior classe de lípidos

presente na membrana plasmática é a dos esteróis, que são essenciais para a organização e funções desta estrutura [81]. A forma de esteróis predominante difere entre os vertebrados (colesterol), plantas (fitoesteróis) e fungos onde o esterol principal é o ergosterol [81].

O ergosterol é um constituinte importante da membrana plasmática, essencial para sua integridade, fluidez, permeabilidade e funcionalidade proteica, permitindo que enzimas membranares exerçam a sua função, como a síntese de quitina necessária para a divisão e crescimento celulares [82,83]. Este composto é o produto final de uma longa via biossintética (figura 4) com início no esqualeno, sendo o lanosterol o primeiro

esterol desta via [81,84]. O ergosterol tem aplicações biotecnológicas servindo como

um precursor barato para a síntese de vitamina D e outros fármacos esteróides. Além disso, o facto de ser específico nos fungos e de a sua via biossintética diferir em três etapas da via principal de produção de esteróis em humanos, tem levado a intensas investigações sobre o ergosterol como alvo de agentes antifúngicos, como no tratamento de candidíases humanas [84].

Figura 4 – Via biossintética de ergosterol a partir do esqualeno (“squalene”) com os intermediários e

enzimas que catalisam cada reação individual [84]

3.2 Epidemiologia e fatores de risco

As infeções causadas por C. glabrata, tanto superficiais quanto sistémicas, aumentaram significativamente nos últimos anos, e atualmente esta espécie é considerada a segunda maior causa de candidíases em humanos [85,86]. Estudos recentes na Europa e América do Norte têm indicado C. glabrata como causadora de

aproximadamente 15 a 20 % dessas infeções nesses locais [87,88]. Os casos de

candidemia provocados por esta espécie são de especial importância, já que têm a maior mortalidade entre as espécies de CNA. Esta é de aproximadamente 50% em pacientes com cancro e de 100% em pacientes de transplante de medula óssea [85]. Relativamente à faixa etária de pacientes, tem sido verificada maior incidência de C. glabrata em adultos do que crianças e baixa incidência em recém-nascidos [64].

O facto da aquisição nosocomial de C. glabrata se ter tornado comum, levou a que recentemente se estudassem e avaliassem os fatores de risco associados a essa aquisição e doença subsequente. Assim, embora se saiba que a espécie está presente na

flora do paciente, a transmissão exógena em ambientes hospitalares começou a ser

considerada uma via importante de aquisição [68,89]. Ainda não totalmente

esclarecidas, as fontes destas infeções envolvem interações complexas de reservatórios ambientais e humanos, sendo apontado o transporte nas mãos pelo pessoal hospitalar como possível fonte. Além disso, tal como outros patogénicos nosocomiais, C. glabrata pode ser adquirida direta ou indiretamente a partir de superfícies contaminadas [89]. Também são considerados dois fatores importantes de risco associados à colonização de

C. glabrata, a hospitalização prolongada e uso prévio de antimicrobianos. Estudos

prospetivos são extremamente necessários para definir mais claramente os reservatórios da infecção, bem como o modo de transferência e medidas para prevenir a disseminação da infecção [68].

3.3 Resistência a antifúngicos

A resistência a antifúngicos é um fenómeno cada vez mais reconhecido e que pode ser dividido em duas categorias, a resistência clínica e a resistência in vitro. A resistência clínica é definida como a inexistência de resposta clínica ou seja, persistência ou progressão da infeção na presença de um nível de antifúngico tolerável. No entanto, muitas vezes a falha clínica deve-se a baixos níveis de antifúngico no soro e/ou tecidos por várias razões, particularmente o incumprimento da prescrição médica [21,68]. A resistência in vitro pode ser subdividida em resistência primária e secundária. A resistência primária, também designada de resistência intrínseca ou inerente, ocorre quando o organismo é naturalmente resistente ao agente antifúngico, sem qualquer exposição prévia ao mesmo. A resistência secundária ou adquirida é descrita quando o microrganismo que provocou a infeção desenvolve resistência ao antifúngico após algum tempo de exposição ao mesmo [35,68]. Esta forma de resistência rara no passado é agora a mais frequentemente encontrada em pacientes com SIDA, que sofrem recorrentemente de candidíases esofágicas resistentes a azóis [90,91].

Candida glabrata possui elevada resistência aos antifúngicos, tanto inerente

como adquirida, limitando a eficácia de alguns agentes usados na terapia clínica [92]. Esta espécie apresenta uma resistência intrínseca particularmente elevada aos azóis, sobretudo ao fluconazol [16], desenvolvendo facilmente mais resistência, principalmente durante terapias prolongadas e/ou profiláticas [93]. Esta espécie é cerca

de oito vezes naturalmente mais resistente ao fluconazol do que C. albicans [94] e a mais frequentemente resistente ao fluconazol entre as espécies de CNA [95].

Sendo C. glabrata uma causa importante de candidíases em humanos, um melhor entendimento da sua virulência e mecanismos de resistência aos antifúngicos é de elevada importância médica.

3.3.1 Agentes antifúngicos e mecanismos de resistência

Em comparação com os antibióticos, o desenvolvimento de agentes antifúngicos tem sido mais limitado. Isto deve-se a diversos fatores, incluindo a dificuldade do desenvolvimento de um agente que atue em células eucarióticas fúngicas sem ser tóxico

para as células hospedeiras [10,35]. No entanto, desde 1990 a quantidade de agentes

antifúngicos disponíveis tem aumentado, o que levou ao aparecimento de resistência por parte dos microrganismos associada à excessiva exposição aos antifúngicos, já que são usados em tratamentos profiláticos, terapêuticos e enquanto se espera que a doença seja

diagnosticada [96]. Os agentes antifúngicos, por serem substâncias estranhas ao

organismo humano, possuem diversos efeitos secundários com mais ou menos gravidade, que dependem do tipo de agente assim como da via de administração, apresentação farmacêutica, dose e duração do tratamento [97].

Os agentes antifúngicos são classificados de acordo com o seu modo de ação nas células fúngicas. As principais classes de antifúngicos usadas no tratamento de candidíases são azóis, polienos, equinocandinas e análogos de pirimidinas. Estes são responsáveis pela inibição da síntese de ergosterol, rompimento da membrana celular, inibição da síntese de β-1,3-D-glucano e inibição da síntese de proteínas e ADN (Ácido Desoxirribonucleico), respetivamente [10,35]. Os mecanismos de resistência antifúngica envolvem essencialmente interferência com o mecanismo da respetiva classe de antifúngicos e diminuição dos níveis do alvo dos mesmos [34].

A classe de análogos de pirimidinas é representada exclusivamente pela 5-Fluorocitosina, que é um antifúngico que entra nas células fúngicas através de uma permease de citosina sendo convertida em 5-fluorouracilo. Este análogo nucleosídeo incorpora-se nas moléculas de ARN (Ácido Ribonucleico), interferindo com a síntese proteica, além de interferir também com a replicação do ADN [35,98]. Este antifúngico necessita de várias reações enzimáticas intracelulares para atuar o que leva a que as

leveduras apresentem diversos mecanismos de resistência a ele, como alterações nas

enzimas alvo ou diminuição da produção de pirimidinas. Assim, este agente

normalmente só é usado em combinação com outros, como por exemplo a anfotericina B (polieno) ou o fluconazol (azol) [99].

Em relação à classe das equinocandinas, esta tem uso antifúngico relativamente recente e que tem sido limitado sobretudo devido à sua toxicidade para o hospedeiro. As equinocandinas, com destaque para a caspofungina, micofungina e anidulafungina, têm atividade fungicida em espécies de Candida, que é especialmente elevada em C.

albicans, C. glabrata e C. tropicalis, tanto in vitro como in vivo [100]. Estes

antifúngicos lipopeptídicos cíclicos, inibem as Fks1/Fks2 β-1,3-D-glucano sintases que são responsáveis pela síntese de β-1,3-D-glucano, um componente estrutural essencial da parede celular dos fungos que não está presente nas células mamíferas [98]. As equinocandinas exercem então a sua ação perturbando a integridade e organização

estrutural da parede celular, levando à morte do microrganismo [101]. Em relação aos

mecanismos de resistência das espécies de Candida, tem sido relatada resistência inerente por produção insuficiente das enzimas alvo referidas ou produção de formas alternativas das mesmas que reduzem a ligação às equinocandinas [98]. Em particular para C. glabrata, estudos recentes relatam cerca de 11 novas mutações nos genes FKS1 e FKS2, que codificam as subunidades catalíticas das enzimas alvo das equinocandinas, reduzindo a suscetibilidade a estas [102,103]. No entanto, a reduzida atividade enzimática dessas enzimas nestes mutantes, pode afetar a aptidão no hospedeiro promovendo a baixa frequência de resistência às equinocandinas [103].

A classe de antifúngicos denominada de polienos é composta por fungicidas usados há mais de 50 anos, sendo a anfotericina B e a nistatina os seus dois maiores representantes. Estas substâncias desestabilizam a membrana plasmática dos fungos,

ligando-se ao ergosterol presente na mesma [104]. Esta interação com o ergosterol

induz a formação de poros na membrana, causando a perda de componentes celulares, colapso dos gradientes iónico e elétrico, conduzindo à morte celular [10,104]. Infelizmente, os efeitos secundários adversos, como nefrotoxicidade grave para o hospedeiro, têm tornado difícil o uso a longo prazo desta classe, mais do que a resistência por parte dos fungos [104]. Sendo o ergosterol o principal alvo dos polienos, pode surgir resistência por alteração da sua composição na membrana plasmática como consequência de mutações nos genes que codificam algumas das enzimas envolvidas na via biossintética do ergosterol [104,105]. Têm sido descritas mutações nos genes ERG3,

ERG6 e ERG11, que codificam enzimas que atuam na via biossintética do ergosterol

(figura 4), como responsáveis por conferir resistência a espécies de Candida aos polienos, sem afetar a viabilidade celular [106]. Em C. glabrata, alguns estudos têm relatado mutações no gene ERG6, que é necessário para o funcionamento normal da membrana plasmática mas não é essencial para a biossíntese de ergosterol, como responsáveis pela diminuição da suscetibilidade aos polienos [107,108]. Pode-se referir como exemplo um estudo de 2006 [107], que demonstrou menor suscetibilidade de C.

glabrata à anfotericina B devido a uma mutação “missense” no gene ERG6, que leva à

substituição de uma cisteína por uma fenilalanina na proteína correspondente. Esse estudo detetou também sobrexpressão de genes que codificam enzimas envolvidas nas últimas etapas da via biossintética do ergosterol. Um outro estudo de 2008 [108] detetou uma mutação “nonsense” no mesmo gene de um isolado clínico de C. glabrata, também responsável por diminuição da suscetibilidade aos polienos. Há também estudos que associam a resistência aos polienos em espécies de Candida com a resistência aos azóis, tendo já sido verificada resistência cruzada entre essas classes [109,110]. O conhecimento deste tipo de resistência entre agentes antifúngicos é fundamental para que não se substitua, em caso de resistência a um antifúngico, por outro que sofrerá o mesmo mecanismo de resistência [21].

Em relação à classe dos azóis, estes são compostos sintéticos usados há algumas décadas e atualmente representam a classe de antifúngicos mais usada, sendo uma boa alternativa ao uso de anfotericina B, já que apresentam menor toxicidade, melhores propriedades farmacêuticas e amplo espectro de ação [19]. Desta classe fazem parte o fluconazol, miconazol, clotrimazol, itraconazol, cetoconazol, voriconazol, posocanazol, ravuconazol e o isavuconazol. Estes têm ação fungistática (inibem o crescimento do fungo) e/ou fungicida (matam o fungo) em espécies de Candida, sendo os mais usados

os três primeiros referidos [35]. Os azóis inibem a enzima lanosterol 14-α-desmetilase

codificada pelo gene ERG11, que é uma enzima do citocromo P-450 responsável pela remoção de um grupo metilo ao lanosterol. Esta enzima é importante na via biossintética do ergosterol (figura 4) e por isso a sua inibição bloqueia a biossíntese desse composto, que é um componente importante da membrana plasmática dos fungos, essencial para a sua integridade, fluidez, permeabilidade e funcionalidade proteica

[19,98]. O desenvolvimento dos azóis aumentou as opções de tratamento para as

extensivo, o que consequentemente levou ao aparecimento da resistência a estes agentes, em particular ao fluconazol [36].

A resistência de espécies de Candida aos azóis pode dever-se a modificações quantitativas e qualitativas das enzimas alvo, acesso reduzido do antifúngico ao alvo ou a combinação de ambos. Estas modificações podem resultar de alterações na via biossintética do ergosterol como sobrexpressão ou mutações do gene ERG11, responsável pela produção da enzima alvo dos azóis. Outro mecanismo muito importante pelo qual espécies de Candida resistem aos efeitos dos azóis envolve o efluxo do antifúngico para fora da célula, através da ativação de dois tipos de bombas de efluxo proteicas codificadas por genes MDR (“Multidrug Resistance”) e CDR (“Candida Drug Resistance”) [106,111]. Os genes CDR codificam transportadores que fazem parte do transporte ativo primário como os da família ABC (“ATP-binding cassete”), que hidrolisam ATP e usam a energia formada para efetuar o transporte de compostos através da membrana plasmática. O gene MDR1 codifica um transportador da família MFS (“Major Facilitator Superfamily”) e está envolvido no transporte ativo secundário, obtendo energia do gradiente eletroquímico transmembranar [106].

Candida glabrata possui uma elevada resistência aos azóis, quando comparada

com outras espécies de Candida e muitas vezes desenvolve resistência durante tratamentos terapêuticos e profiláticos [67,36]. Em C. albicans, um mecanismo importante de resistência aos azóis é a sobrexpressão ou mutação no gene ERG11 [112], no entanto em isolados clínicos de C. glabrata esse mecanismo não parece ser um

importante mediador da resistência [113, 114]. Em C. glabrata, o mecanismo de efluxo

de azóis é considerado como o principal mecanismo de resistência, prevenindo a acumulação intracelular desses antifúngicos, especialmente o efetuado por membros da família de transportadores ABC [115]. Três transportadores ABC estão envolvidos na resistência de C. glabrata aos azóis, o Cdr1, o Cdr2 (Pdh1) e o Snq2 [116, 117]. Também tem sido sugerido que o Aus1, outro transportador ABC, contribui para a baixa suscetibilidade de C. glabrata aos azóis, pela captação de esterol do meio quando em falta de ergosterol na membrana, causada pela inibição da lanosterol 14-α-desmetilase [117, 118].

A figura 5 apresenta um resumo esquemático de todos os mecanismos de resistência aos agentes antifúngicos de C. glabrata relatados nesta secção e respetivos alvos de ação.

Figura 5– Principais mecanismos de resistência antifúngica de C. glabrata e respetivos alvos de ação[67]

Candida glabrata é bastante resistente aos azóis mais usados, sobretudo ao

fluconazol, ativo em espécies de Candida de importância médica, à exceção de C.

glabrata [36]. Por tal, têm emergido triazóis de segunda geração tal como o

posaconazol e o voriconazol, com maior potência e amplo espetro de atividade. Este

último tem tido especial atenção por ser bastante ativo em espécies de Candida [120].

3.3.1.1 Voriconazol

O voriconazol é um novo triazol com atividade fungicida em espécies de

Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Scedosporium apiospermum e outros patogéneos

menos comuns [121]. Este antifúngico pode ser administrado via oral ou intravenosa e

na Europa é aprovado no tratamento de infeções invasivas causadas por espécies de

Aspergillus, Scedosporium e Fusarium, assim como candidemia em pacientes não

neutropénicos e candidíase invasiva provocada por espécies de Candida resistentes ao fluconazol [121].

Figura 6

Este agente é geralmente bastante eficaz em espécies de espécies resistentes ao fluconazol como

mais ativo que o fluconazol

um estudo com diversas estirpes de 32 a 64 vezes mais ativo que

demonstrou que a inibição do crescimento de

da dose e que o tratamento com este agente afeta tanto a mo externa de C. glabrata [123]

valores de concentração mínima inibitória ( o voriconazol de 0,018 a 8 µg/ml

fluconazol de 0,5 a 64 µg/ml de voriconazol em C. glabrata

3.4 Patogenicidade e fatores de virulência As espécies de Candida

versatilidade e capacidade de sobreviver em vários locais anatómicos algumas décadas acreditava

estabelecimento de uma infeção fúngica oportunista, sendo uma fraqueza orgânica ou imunodeficiência do hospedeiro

Atualmente, o conceito foi alterado e há consenso de que estes organismos participam ativamente na fisiopatologia do processo de doença, usando mecanismos de agressão designados de fatores de virulência

Figura 6 – Estrutura química do voriconazol

Este agente é geralmente bastante eficaz em espécies de Candida

resistentes ao fluconazol como C. glabrata [36,122]. De facto, o

mais ativo que o fluconazol em espécies de Candida de importância médica diversas estirpes de C. glabrata [123] determinado que

mais ativo que fluconazol nesta espécie. Além disso

demonstrou que a inibição do crescimento de C. glabrata pelo voriconazol é dependente da dose e que o tratamento com este agente afeta tanto a morfologia interna como

[123]. Outro estudo com estirpes de C. glabrata

entração mínima inibitória (CMI50 - inibição de 50% dos isolados

8 µg/ml, bastante menores que os valores encontrados para 64 µg/ml. De forma geral, os estudos têm demonstrado q

glabrata é normalmente inferior a 1 µg/ml [93,121]

Patogenicidade e fatores de virulência

Candida são consideradas patogénicos importantes devido à sua

e de sobreviver em vários locais anatómicos

algumas décadas acreditava-se que as leveduras participavam passivamente no estabelecimento de uma infeção fúngica oportunista, sendo uma fraqueza orgânica ou imunodeficiência do hospedeiro o único mecanismo responsável pela mesma. Atualmente, o conceito foi alterado e há consenso de que estes organismos participam ativamente na fisiopatologia do processo de doença, usando mecanismos de agressão designados de fatores de virulência [126]. Há ainda um debate sobre o que realmente é o

Candida, incluindo

De facto, o voriconazol é de importância médica [36], tendo que o voriconazol é Além disso, este estudo pelo voriconazol é dependente rfologia interna como [124] encontrou inibição de 50% dos isolados) para encontrados para o

estudos têm demonstrado que a CMI50

[93,121]

são consideradas patogénicos importantes devido à sua

e de sobreviver em vários locais anatómicos [125]. Até há

se que as leveduras participavam passivamente no estabelecimento de uma infeção fúngica oportunista, sendo uma fraqueza orgânica ou responsável pela mesma. Atualmente, o conceito foi alterado e há consenso de que estes organismos participam ativamente na fisiopatologia do processo de doença, usando mecanismos de agressão o que realmente é o

um fator de virulência, já que se pode considerar que todas as características necessárias para o estabelecimento da doença são fatores de virulência. No entanto, estritamente, fatores de virulência são aqueles que interagem diretamente com as células hospedeiras causando danos [127]. Nas espécies de Candida a patogenicidade é mediada por vários fatores de virulência, incluindo adesão e formação de biofilmes em tecidos do hospedeiro ou dispositivos médicos, habilidade para evitar as defesas do hospedeiro e a produção de enzimas hidrolíticas. Comparativamente a C. albicans, há poucos estudos no sentido de identificar fatores de virulência em espécies de CNA como C. glabrata [35,127].

A adesão das espécies de Candida a células e tecidos humanos ou outro tipo de superfícies expostas a circulação de fluidos é necessária para que haja colonização inicial, contribui para a persistência do microrganismo no hospedeiro e é essencial para o estabelecimento de infeção [10,128] A adesão inicial de células de Candida é mediada por fatores não-específicos (propriedades físico-químicas da superfície celular) [128,129] e promovida por proteínas específicas da parede celular [128,130]. Estas proteínas, designadas de adesinas, ligam-se especificamente a aminoácidos e açúcares da superfície de outras células ou promovem a adesão a superfícies abióticas [131].

Em C. glabrata, um grupo importante de adesinas é codificado pela família de genes EPA (adesinas epiteliais) que compreende até 23 genes, sendo este número dependente da estirpe [132,133]. Apesar dos estudos relativos às proteínas Epa em C.

glabrata serem poucos, a Epa1, Epa6 e Epa7 são consideradas adesinas importantes

[134,135], em que por exemplo, apenas a eliminação da Epa1 já reduz a adesão in vitro [132]. Além desta família de adesinas, outras têm sido descritas em C. glabrata, como adesinas putativas (Awp, Pwp), enzimaticamente ativas e ligadas covalentemente à superfície (Gas) ou de função desconhecida (Cwp, Pir) [133,136]. Além das adesinas, outros parâmetros característicos da parede celular de C. glabrata como a hidrofobicidade têm sido relacionados com a adesão, embora a hidrofobicidade sozinha não constitua um fator previsor do nível de adesão [70,137]. A adesão inicial ao hospedeiro e/ou dispositivos médicos é seguida de divisão celular, proliferação e subsequente desenvolvimento de biofilme [138]. A formação de biofilme é um fator de virulência muito importante em espécies de Candida como C. glabrata e será apresentado detalhadamente na secção 4.

Outro fator de virulência importante é a produção de enzimas hidrolíticas extracelulares, que são importantes na adesão, penetração, invasão e destruição de

tecidos do hospedeiro [16]. As enzimas mais frequentemente implicadas na patogenicidade das espécies de Candida são as aspartil proteinases (Saps), fosfolipases, lipases (LIPs) e hemolisinas [35]. As Saps facilitam a invasão e colonização dos tecidos pelo rompimento das membranas mucosas do hospedeiro e pela degradação de proteínas imunológicas e estruturais importantes [139]. Embora pouco se saiba sobre a produção de proteinases por C. glabrata, um estudo de 1991 [140] mostrou que esta espécie é capaz de produzi-las, mas o tipo não foi especificado e nenhum outro estudo até hoje

comprovou a sua produção nesta espécie. As fosfolipases são enzimas que hidrolizam

os fosfolípidos a ácidos gordos, contribuindo para a danificação da membrana celular do hospedeiro. Embora estas enzimas sejam descritas para espécies de Candida em geral não há estudos específicos sobre a produção delas em C. glabrata [141,142]. As lipases estão envolvidas na hidrólise de triacilgliceróis, possivelmente contribuindo para a

adesão e iniciação da infeção [143]. Em C. albicans foram identificados 10 genes que

codificam lipases (LIP1-10) e sequências similares foram identificadas em C. tropicalis mas não em C. glabrata [144]. As hemolisinas estão relacionadas com a degradação de hemoglobina e aquisição de ferro a partir das células do hospedeiro, sendo então essenciais para a sobrevivência e persistência no hospedeiro [145]. Um estudo de 2004 [146] demonstrou que C. glabrata tem a capacidade de produzir hemolisinas in vitro e que o gene HLP (“haemolysinlike protein”) está associado à atividade hemolítica nesta espécie.

Recentemente outros fatores de virulência têm sido sugeridos para C. glabrata, tais como alteração fenotípica, auxotrofia e presença de pigmentos, embora ainda pouco estudados [67].

4. Biofilmes

As infeções causadas por espécies de Candida iniciam-se pela adesão do microrganismo, seguida de divisão celular, proliferação e subsequente desenvolvimento de biofilme [138]. Os biofilmes são comunidades estruturadas de microrganismos, irreversivelmente ligadas a superfícies, com elevado grau de organização e coordenação, embebidas numa matriz extracelular auto-produzida [147,148].

Estudos revelam que os microrganismos são quase inexistentes na sua forma plantónica livre, sendo os biofilmes o tipo de crescimento predominante na natureza,

estimando-se que pelo menos 65% das infeções microbianas estão relacionadas com

eles [149,150]. Os biofilmes podem crescer tanto em tecidos como em dispositivos

médicos como cateteres ou próteses. De facto, quase todas as infeções relacionadas com dispositivos envolvem o crescimento na forma de biofilme [151]. Os biofilmes estão

associados a 90% das infeções de Candida relacionadas com cateteres. Das infeções

sanguíneas causadas por espécies de Candida, 70 a 80% estão relacionadas com cateteres venosos centrais e a maioria das infeções urinárias estão associadas com cateteres na bexiga [152]. A figura 7 apresenta um cateter infetado por um biofilme de

Candida.

Figura 7 – Cateter infetado por um biofilme de Candida [153]

A associação de microrganismos em biofilmes é uma forma de proteção para o seu desenvolvimento, incentivando as relações simbióticas e permitindo a sobrevivência em ambientes hostis [154]. Os biofilmes exibem características fenotípicas únicas comparadas com os seus congéneres de células plantónicas, como elevada resistência aos agentes antifúngicos, aos mecanismos de defesa do hospedeiro e ao stress físico e químico. Além disso, apresentam cooperação metabólica, regulação da expressão de genes baseada numa comunidade e a capacidade de suportar a pressão competitiva por outros organismos [154,155]. Clinicamente, o fenótipo mais importante dos biofilmes é a sua extraordinária resistência à terapia antifúngica sendo até 1000 vezes mais resistentes que os congéneres de células plantónicas, mesmo sem a acumulação de

genes específicos de resistência a estes agentes [155]. Esta característica torna as

infeções associadas a biofilmes extremamente difíceis, senão impossíveis, de tratar, sendo necessária a remoção dos dispositivos médicos como cateteres no caso de estarem relacionadas com estes e terapia antifúngica a longo-prazo. As infeções causadas por

espécies de Candida associadas a cateteres venosos centrais apresentam mortalidade de aproximadamente 40% [152]. Diversas espécies de Candida têm sido associadas à formação de biofilmes e consequente infeção incluindo C. albicans e espécies de CNA como C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis [138,156]. C. glabrata possui elevada resistência antifúngica inerente, produzindo biofilmes ainda mais difíceis de controlar [156], tendo até já sido observada uma ligeira estimulação ocasional da formação de biofilme na adição de fluconazol ou itraconazol em biofilmes pré-formados desta espécie [157].

4.1 Formação de biofilmes

A formação de um biofilme apresenta três etapas principais (figura 8). Inicia-se pela aproximação dos microrganismos a uma superfície (biótica ou abiótica) e adesão primária, seguida de adesão secundária e finalmente a maturação do biofilme com

produção da matriz extracelular [15,158].

Figura 8 – Etapas de formação de um biofilme numa superfície abiótica. (A) Adesão inicial à superfície;

(B) Formação de camadas basais de microcolónias; (C) Biofilme maduro com matriz extracelular [159]

O processo inicia-se então pela adesão primária, que após aproximação dos microrganismo até à distância crítica (<1nm) vai depender do somatório das forças repulsivas e atrativas entre microrganismo e superfície de adesão. Forças como as de