O processo de autofagia se inicia com o recrutamento de proteínas específicas para a formação do autofagossomo e progride para a formação dos vacúolos autofágicos, por meio da fusão do autofagossomo com os lisossomos ou vacúolos em plantas e fungos (MORUNO et al., 2012). Para verificar a indução da autofagia nas leveduras cultivadas em diferentes concentrações de glicose e na presença dos moduladores da autofagia, rapamicina e MHY1485, essas células foram submetidas a marcação de suas organelas com acridina orange (AO), um marcador fluorescente seletivo para organelas vesiculares ácidas das células vivas (SHIN; KIM; PARK, 2012) e pela incorporação de monodansilcadaverina (MDC), um agente autofluorescente que se acumula em vacúolos autofágicos, exibindo estruturas pontuais (punctas) distribuídas dentro do citoplasma (KLIONSKY et al., 2008).
As leveduras de Pb18, após 24 horas de cultivo, nas diferentes condições, SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R e SD+M, bem como em meio SD, incubadas com AO ou MDC (Figura 4 e 5, respectivamente), apresentaram marcações pontuais, indicando presença de vesículas ácidas, vacúolos e/ou vacúolos autofágicos.
Após três dias de cultivo (36°C), as leveduras cultivadas em SD-G, SD0,2%
e SD+R, mantiveram marcações pontuais por AO e MDC (Figuras 6 e 7, respectivamente). Na cultura SD4% tanto na marcação por AO quanto por MDC, se tornou difusa, indicando ausência de vacúolos autofágicos, corroborando com os resultados obtidos por Proikas-Cezanne e colaboradores (2007) ao estudarem uma correlação entre marcações difusas com a ausência do processo autofágico. No cultivo (36°C), por três dias, em meio SD contendo 4µM de MHY1485 (SD+M), as leveduras do Pb18 apresentaram menor quantidade de marcações pontuais (punctas) por MDC e por AO em relação ao primeiro dia de cultivo. Contudo, as células cultivadas no meio comum (SD) não apresentaram nenhuma marcação no terceiro dia de cultivo.
Após o sexto dia de incubação nos diferentes meios de cultura (SD, SD-G, SD0,2%, SD4%, SD+R e SD+M), os únicos que continham leveduras apresentando marcações pontuais por AO foram SD-G, SD0,2% e SD+R, conforme ilustrado na Figura 8. Na cultura contendo MHY1485 (SD+M), inibidor de TOR, as células apresentaram marcação difusa por AO (Figura 8). No cultivo em SD e em SD4% as
leveduras não se mostraram marcada por AO (Figura 8). As marcações por MDC, mostrada na Figura 9, ficaram difusas em meio SD (controle), nos tratamentos de privação (SD-G) e altas concentrações (SD4%) de glicose, e em meio contendo com as substâncias moduladoras, rapamicina (SD+R) e MHY1485 (SD+M). No cultivo em meio SD0,2% não houve nenhuma marcação.
Figura 4 – Vesículas ácidas coradas por Acridina Orange (AO), após um dia de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia.
Nota: Leveduras do Pb18 cultivadas em SD (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2% (SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), coletadas após um dia de incubação e coradas com 10 mM de AO, por 10 minutos no escuro. Citoplasma e núcleo marcados em verde; e em vermelho, vesículas ácidas. Setas brancas indicam pontos com marcação de vesículas ácidas. Barra de escala = 10 μm.
Figura 5 – Vacúolos autofágicos corados por monodansilcadaverina (MDC), após um dia de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia.
Nota: Leveduras do Pb18 cultivadas em SD (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2% (SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), coletadas após um dia de incubação e coradas com 50 μM de MDC por 20 minutos. Vacúolos autofágicos estão corados em verde. Setas brancas indicam pontos com marcação de vacúolos autofágicos; e setas amarelas, marcação difusa. Barra de escala = 10 μm.
Figura 6 – Vesículas ácidas coradas por Acridina Orange (AO), após três dias de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia.
Nota: Leveduras de Pb18 em (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2%
(SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), após três dias de incubação;
coradas com 10 mM de AO, por 10 minutos no escuro. Citoplasma e núcleo marcados em verde; e em vermelho, vesículas ácidas. Setas brancas indicam pontos com marcação de vesículas ácidas; e setas amarelas, marcação difusa. Barra de escala = 10 μm.
Figura 7 – Vacúolos autofágicos corados por monodansilcadaverina (MDC), após três dias de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia.
Nota: Leveduras do Pb18 cultivadas em (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2% (SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), coletadas após três dias de incubação e coradas 50 μM de MDC, por 20 minutos. Vacúolos autofágicos estão corados em verde. Setas brancas indicam pontos com marcação de vacúolos autofágicos. Barra de escala = 10 μm.
Figura 8 – Vesículas ácidas coradas por Acridina Orange (AO), após seis dias de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia.
Nota: Leveduras do Pb18 cultivadas em (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2% (SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), coletadas após seis dias de incubação e coradas com 10 mM de AO, por 10 minutos no escuro. Citoplasma e núcleo marcados em verde; e em vermelho, vesículas ácidas. Setas brancas indicam pontos com marcação de vesículas ácidas. Barra de escala = 10 μm.
Figura 9 – Vacúolos autofágicos corados por monodansilcadaverina (MDC), após seis dias de cultivo, em diferentes concentrações de glicose ou na presença de moduladores da autofagia.
Nota: Leveduras do Pb18 cultivadas em (SD 2% de glicose), SD-G (SD sem glicose), SD0,2% (SD0,2% de glicose), SD4% (SD 4% de glicose), SD+R (SD contendo 0,2 µg/mL de rapamicina) ou SD+M (SD contendo 4µM de MHY1485), coletadas após seis dias de incubação e coradas com 50 μM de MDC, por 20 minutos. Vacúolos autofágicos estão corados em verde. Setas brancas indicam pontos com marcação de vacúolos autofágicos; e setas amarelas, marcação difusa. Barra de escala = 10 μm.
Para reforçar a presença do mecanismo de autofagia em leveduras de P.
brasiliensis nas condições experimentais testadas, a presença de proteína Atg8 foi pesquisada por meio de imunofluorescência com um anticorpo anti-Atg8 conjugado a FITC, nas células tratadas com rapamicina (SD+R). A análise pela microscopia de fluorescência revelou uma localização difusa de Atg8 em células do controle (SD).
Em contraste, o tratamento das células com rapamicina (SD+R), após 24 horas, apresentou pontos de fluorescência de Atg8 (Figura 10), indicando presença de autofagossomos e/ou vacúolos autofágicos.
Figura 10 – Coloração de autofagossomos e/ou vacúolos autofágicos com anticorpo Anti-Atg8 conjugado com fluoróforo FITC.
Nota: Leveduras de Pb18 cultivadas em meio SD ou meio SD contendo 0,2 μg/mL de rapamicina (SD+R). Em (A), controle negativo. Em (B), leveduras de Pb18 após um dia de incubação e marcado com anticorpo anti-Atg8 conjugado ao fluoróforo FITC por uma hora.
Autofagossomos estão marcados em verde. Barra de escala = 10 μm.
6 DISCUSSÃO
Em leveduras, vários mecanismos de sinalização celular como TOR (NODA;
OHSUMI, 1998), cAMP (BERMEJO et al., 2013), Ras/PKA (BUDOVSKAYA et al., 2004), Sch9 (YORIMITSU et al., 2007) e Snf1 (WANG et al., 2001), estão relacionados com a regulação do tráfico autofágico, e cada uma destas vias é controlada por um conjunto diferente de moléculas que reflete o estado nutricional e energético da célula (TAYLOR et al., 2012). Entretanto, todas essas vias possuem relação com os níveis de glicose celulares (BROACH, 2012).
Kim e colaboradores (2011) mostraram que, em Aspergillus nidulans, a autofagia induzida pela rapamicina e a autofagia induzida por privação de carbono partilham alguns efetores para sobrevivência celular, como Tor. Porém, a exposição prolongada de células à privação de carbono leva à indução de autofagia por vias como a PKA, independente da cinase Tor. Nesse trabalho foi observado que as leveduras do Pb18 ativaram a autofagia quando crescidas em ausência de glicose (SD-G) e em meio reduzido (SD0,2%), bem como na presença de rapamicina (SD+R), um inibidor de Tor. Nessas condições de crescimento, os vacúolos autofágicos foram marcados por AO e MDC.
A proteína Atg8 está presente durante a formação de autofagossomos e permanece nos vacúolos autofágicos (YANG; KLIONSKY, 2009). O acúmulo de Atg8 é considerado uma das características da autofagia (SHIN; KIM; PARK, 2012). A fim de reafirmar a presença dos vacúolos autofágicos, marcados por AO e MDC, observamos marcações pontuais, por anticorpo imunofluorescente da proteína Atg8, em leveduras tratadas com rapamicina (SD+R), um estimulador da autofagia, após 24h, momento em que uma quantidade maior de leveduras apresentaram marcações, por AO e MDC. Em contraste, as leveduras cultivadas em SD, não exibiram tantas marcações pontuais como as observadas na cultura SD+R.
Mostrando que mesmo em condições de crescimento normal, ocorre autofagia a nível basal, uma vez que também é responsável por reciclagem de proteínas e organelas (YANG; KLIONSKY, 2010).
CHOI e colaboradores (2012) mostraram que em hepatócitos de rato (Ac2F) o composto MHY1485 apresentou efeito inibitório sobre o processo autofágico, por meio da ativação de TOR. Em leveduras de P. brasiliensis, cultivadas na presença de MHY1485 (SD+M), após seis dias de cultivo, foi notória a ausência de vacúolos
autofágicos, pela marcação difusa tanto por AO quanto por MDC, bem como nas leveduras cultivadas na ausência do composto, SD.
Kobayashi et al (2012) mostraram que em concentração elevada de glicose, ocorreu supressão da autofagia em cardiomiócitos de ratos recém-nascidos, a fim de proteger as células contra a toxicidade causada pela hiperglicemia. Além disso, os pesquisadores mostraram que a supressão da autofagia por 3-metiladenina ou pelo silenciamento do gene BECN1 ou ATG7, foi capaz de atenuar a morte dos cardiomiócitos induzida por glicose elevada. Inversamente, a regulação positiva da autofagia com rapamicina ou superexpressão de BECN1 ou ATG7 predispôs cardiomiócitos a uma elevada toxicidade glicídica. A inibição da autofagia induzida pela glicose foi mediada, pelo menos em parte, pelo aumento da sinalização de mTOR. Mesmo sendo esses dados provenientes de organismos diferentes, nossos resultados corroboram com eles, pois, mostraram que, em leveduras de P.
brasiliensis cultivadas por seis dias em altas concentrações de glicose (SD4%) foi notória a ausência de vacúolos autofágicos. Além disso, nessas condições de cultivo houve aumento de massa celular e manutenção da viabilidade das leveduras, semelhante aos resultados obtidos para a cultura SD (controle).
Além da inibição da autofagia, a atividade de TorC1 está intimamente relacionada ao crescimento celular de diferentes eucariotos (KIM; GUAN, 2015). Na presença de MHY1485 (SD+M), um ativador de Tor, houve aumento na proliferação e na viabilidade celular. Nas células cultivadas com rapamicina (SD+R), inibidor da atividade de Tor, foi possível observar um aumento na proliferação celular no terceiro dia de cultivo, seguido de uma diminuição da proliferação no sexto dia de incubação, em comparação com as células cultivadas na ausência do fármaco (SD), embora, a viabilidade das células cultivadas em SD+R tenha sido preservada. Esses resultados sugerem uma influência da atividade da Tor na manutenção do crescimento celular.
Além disso, leveduras de Pb18 cultivadas em SD-G e SD0,2% que, como mostrado, exibiram vacúolos autofágicos, tanto quanto as leveduras tratadas com rapamicina, proliferaram menos e tiveram viabilidade prejudicada, em comparação as leveduras crescidas em meio SD (controle), sugerindo que houve uma interferência na atividade de TOR, nas leveduras sob condições mínimas (SD0,2%) e privadas de glicose (SD-G).
Existem vários fatores que medeiam a expressão de diferentes genes que mudam a expressão durante a transição do crescimento de levedura para pseudo-hifas (PALECEK; PARIKH; KRON, 2002; BROACH, 2012). Em alguns casos, todos esses fatores convergem para o promotor de um gene, como SNF1 (sucrose nonfermentable 1) (JIANG; CARLSON, 1996; KUCHIN; VYAS; CARLSON, 2002) e FLO11, um gene importante, cuja expressão é necessária para codificar uma glicoproteína de superfície celular, necessária para a formação de pseudo-hifas (LO;
DRANGINIS, 1998) e crescimento invasivo (HALME et al., 2004; LAXMAN; TU, 2011). Em leveduras, um dos fatores envolvidos na regulação de FLO11 é a via Ras/PKA (MALCHER; SCHLADEBECK; MOSCH, 2011; CULLEN; SPRAGUE, 2012;
SONG; KUMAR, 2012), tanto em condições de privação total de glicose (CULLEN;
SPARGUE, 2002; BERMEJO et al., 2013) quanto na presença de níveis normais de glicose (BUDOVSKAYA et al., 2004; NAZARKO et al., 2008). Na presença de glicose, a atividade de PKA está aumentada, inibindo a atividade de FLO11 (MORUNO; PÉREZ-JIMÉNEZ; KNECHT, 2012). Em leveduras de P. brasiliensis observamos que a formação de pseudo-hifas foi abundante tanto em meio de cultivo com ausência (SD-G) ou redução de glicose (SD0,2%), quanto em altas concentrações de glicose (SD4%).
Em Saccharomyces cerevisiae, Cutler e colaboradores (2001) mostraram que a diferenciação pseudo-hifal é controlada por uma via de detecção de nutrientes envolvendo as proteínas cinases Tor. Em P. brasiliensis, demonstramos que o cultivo de leveduras na presença de 0,2 µg/mL de rapamicina, não somente inibiu o desenvolvimento de pseudo-hifas, como, também, promoveu aumento no diâmetro das leveduras e no número de brotos.
Não há na literatura trabalhos que utilizem MHY1485 em fungos. Em leveduras de P. brasileinsis, a adição de 4 µM de MHY1485 ao meio de cultura (SD+M), promoveu um aumento na massa celular, na viabilidade celular, no diâmetro das leveduras e desenvolvimento de pseudo-hifas. Corroborando com os poucos trabalhos existentes na literatura que utilizam esse composto em células de mamíferos, em que o MHY1485 se mostrou capaz de promover o desenvolvimento do folículo ovariano (CHENG et al., 2015) e diferenciação de osteoblastos (HU et al., 2016). Esses resultados condizem com efeitos esperados para a ativação de Torp2, ligada a TorC1, em organismos eucarióticos, que interfere no crescimento celular, promovendo aumento na síntese proteica (SENGUPTA; PETERSON; SABATINI,
2010) e no número de células da cultura (DECHANT et al., 2014; RALLIS; CODLIN;
BÄHLER, 2013).
Leveduras privadas de macronutrientes, como glicose (VALCOURT et al., 2012) e nitrogênio (AN et al., 2014), sofrem alterações morfológicas como:
apresentando formas mais alongadas, suprimindo o brotamento nas células-mãe, mantendo-se ligadas após citocinese (GANCEDO, 2001; PALECEK; PARIKH;
KRON, 2002) e exibindo quiescência (GRAY et al., 2004). Conway e colaboradores (2012) mostraram que leveduras de S. cerevisiae limitadas de glicose, nitrogênio e fosfato apresentaram ativação de um grande conjunto de genes comuns, relacionados à crescimento e quiescência. Além disso, todos os três nutrientes estimularam a produção de cAMP e em menor escala, a via Tor. A via de cAMP é importante para a forma patogênica de Paracoccidioides brasiliensis (CHEN et al., 2007). AMPK e mTOR são importantes para o controle da homeostase energética celular (INOKI; KIM; GUAN, 2012). Após incubação com rapamicina (SD+R) as leveduras apresentaram diâmetros maiores em relação aos exibidos pelas leveduras cultivadas em meio SD. Na cultura SD-G e em SD+M, após seis dias de cultivo, o aumento no diâmetro das leveduras também foi observado. O curioso é que esse aumento do diâmetro nas leveduras da cultura SD+M sugere que, nessa condição, este evento não está sobre influência da Tor, e sim de outra via, talvez cAMP. Esse achado necessita de mais estudos para elucidação.
7 CONCLUSÃO
Neste trabalho foi demonstrado, pela primeira vez, que a autofagia é um mecanismo ativo em leveduras do isolado 18 de P. brasiliensis, cultivadas em privação de glicose, e que os compostos moduladores do processo, rapamicina e MHY1485, foram capazes de interferir na viabilidade e morfologia dessas células.
Esses resultados demonstram que a autofagia é utilizada pelo fungo para sua adaptação, in vitro, em ambientes reduzidos de carbono. Essa informação abre um novo campo de estudo em Paracoccidioides spp., que crescem em condições não favoráveis, entre as quais privação de nutrientes dentro de macrófagos, residentes nos alvéolos pulmonares do hospedeiro. A definição da relevância da autofagia para a adaptação e sobrevivência do fungo no hospedeiro pode revelar novas moléculas candidatas a fatores de patogenicidade desse fungo, que precisa superar diferentes tipos de estresse para se estabelecer no hospedeiro.
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